Summary
Her beskriver vi en metode for rask og nøyaktig måling av ytelse flytur i Drosophila, slik at high-throughput screening.
Abstract
Drosophila har vist seg å være en nyttig modellsystem for analyse av virkemåten, som blant annet fly. Den innledende uren tester involverte slippe flyr inn i en olje-belagte målesylinder; landing høyde ga et mål på uren ytelse ved å vurdere hvor langt fluer vil falle for å produsere tilstrekkelig skyvekraft for å gjøre kontakt med veggen av sylinderen. Her beskriver vi en oppdatert versjon av tester flytur med fire store forbedringer. Først la vi en "drop tube" for å sikre at alle fluer inn sylinderen uren på et tilsvarende hastighet mellom studier, eliminere variasjonen mellom brukerne. For det andre, erstattet vi smøre med flyttbare plastblader belagt i Tangle-Trap, et lim laget for å fange levende insekter. Tredje, bruker vi en lengre sylinder for å gi mer presis diskriminering av flygeevne. Fjerde vi bruker et digitalt kamera og bildebehandling programvare for å automat scoring av flight ytelse. Disse forbedringene tillate for rapid, kvantitativ vurdering av fluktadferd, nyttig for store datasett og store genetiske skjermer.
Introduction
Drosophila har lenge vært brukt for å studere den genetiske basis av opptreden 1, og forskere har utviklet en rekke metoder for å analysere forskjellige typer av oppførsel 2-6. Fluer har vært spesielt nyttig i å gi nyttige modeller av nevromuskulære lidelser 7. En vanlig test som benyttes for å studere bevegelsesatferd er uren ytelse. Den opprinnelige flight tester er nyttig for å identifisere fly defekte mutanter og for kvantitativ vurdering av flyge evne en, men den har flere svakheter som begrenser sin søknad for høy gjennomstrømning skjermer: bruk av olje-belagte sylindere er rotete og tungvint, visse funksjoner som lengden av sylinderen, og innføring av fluene inn i røret med variabel kraft reduserer kvantitativ nøyaktighet, og det er vanskelig å utvinne levende fluer fra tester. For å overvinne disse begrensningene, har vi endret flyturen tester for å inkludere en rekke forbedringer. Vi har lagt til en "drop tuvære "å innføre fluer for å eliminere variabiliteten mellom eksperimenter og brukere. Vi benytter fjernbare akrylplater belagt med et klebemiddel som gir mulighet for lettere opprydding og utvinning av individuelle fluer. Vi har økt lengden av uren røret for å forbedre kvantitativ nøyaktighet og pålitelighet. Endelig Vi bruker et digitalt kamera og bildebehandling for å beregne landings høyder av fluer. Vi mener at disse forbedringene vil være nyttig for ethvert laboratorium interessert i å gjennomføre storskala genetiske skjermer for defekter i flight ytelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Monter Fly Tester
- Sikker sylinder fly til Ring Stand en bruker kjede klemmer. (Legg igjen ca 3 cm under sylinderen for veie fatet.)
(Merk: sylinder uren vi bruker er 90 cm lang med en diameter på 13,5 cm.) - Sett veie fatet med et tynt lag av mineralolje under sylinderen uren.
- Sikker trakt til Ring Stand to ved hjelp av en ring klemme og klo klemme. Juster høyde av trakten, slik at bunnen av trakten er i flukt med toppen av sylinderen uren. (Merk: tuppen diameter av trakten må være mindre enn den ytre diameter av ampullene plassert inn i dråpe-rør, slik at ampullene ikke vil falle gjennom.)
- Sett dråpe røret inn i toppen av trakten og sikres ved hjelp av en klo klemme.
(Merk: Vi bruker en dråpe rør som er 25 cm lang slippe fly-som inneholder ampuller fra denne høyden gir konsistent utstøting av alle fluer med uniform kraft Den indre diameter på drop tube bør være Sligh..tly større enn den utvendige diameter av ampullen for å tillate glasset å falle fritt.) - Skjær polyakrylamid ark (er) til den riktige størrelse. (Merk: For å hjelpe til med å sette inn og ta arket, bør bredden være litt mindre enn den indre omkrets av sylinderen uren).
- Påfør et tynt lag med Tangle-Trap til arket. La det sitte i en time før bruk. (Merk: La det være nok plass på toppen og bunnen av arket (ca. 3 cm) ubestrøket å gripe arket for innsetting / fjerning.)
- Sett polyakrylamid ark i sylinderen uren.
- Monter kameraet sporet ved hjelp av furu støttebraketter. (Merk: For å sikre at bunnen av sporet kan støtte kameraet uten å blokkere linsen Se figur 1B.).
- Legg stoppere og skru på plass. (Merk: sted stopperne på steder som gjør at kameraet kan se hele plast ark i panoramamodus.)
2. Kjør eksperiment
- <li> Samle ampuller av fluer som skal testes. For best resultat, bruk ikke mer enn 20 fluer / hetteglass.
- Banke forsiktig på fluer til bunnen av hetteglasset, trekk, deretter sette inn dråpe røret og slipp hetteglass.
(Merk: hetteglass faller ned drop tube til den treffer den smale traktåpningen Når hetteglasset treffer trakten, er fluene matet ut i sylinderen uren..) - Løft drop tube for å fjerne det tomme hetteglasset.
(Merk: Flere ampuller med fluer i samme testgruppen kan bli analysert på et enkelt polyakrylamid ark Vi finner at opptil 200 fluer (10 hetteglass à 20 fluer hver) kan testes og avbildes gjerne på ett enkelt ark.. - Fjern plastarket og legg den på et flatt hvit overflate.
(Merk: hvit plakat bord kan benyttes dersom benk topper er mørk farget.) - Monter kameraet spor over plast ark. Kameraet bør være tilstrekkelig høyt over arket for å ha både toppen og bunnen av sjiktet i synsfeltet.
- Skyv kamera sammen the sporet mens du holder "capture"-knappen for å skaffe seg et panoramabilde.
- Antall fluer landing i oljen kan telles manuelt for hvert forsøk.
- Gjenta trinn 02.02 til 02.07 for alle forhold i et gitt eksperiment. Fluene kan fjernes fra arket mellom hvert forsøk. Alternativt kan flere ark anvendes, idet en ny plate for hvert forsøk.
Tre. Datainnsamling
- Åpne bildefiler med ImageJ programvare.
- Korn bilder hvis nødvendig å inkludere bare landingsoverflate. (Dette er det området belagt i Tangle-Trap.)
- Konvertere bilder til 8-bits gråtoner.
- Lag en "terskel" for å filtrere ut den hvite bakgrunnen.
(Bilde → Juster → Threshold). - Still inn parametrene for å identifisere hvert fly ved hjelp av "analysere partiklene"-menyen.
(Analyze → Analyser Partikler) Definer parametrene som brukes til å identifisere en partikkel. Med vår satt opp, finner vi at det å bruke enareal på 5-90 piksler to og en sirkularitet av 0,4-1,0 vil nøyaktig identifisere alle prøvene. - Mål plasseringen av hvert fly ved hjelp av den genererte listen koordinater for hver partikkel. Den x-koordinaten i piksler kan bli omdannet til centimeter for å beregne landingshøyde.
- Importere tabell i et regneark (for eksempel Microsoft Excel).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1A viser skjematisk den oppdaterte uren tester sammenstillingen. Figur 1B illustrerer sporet utforming tillate kameraet å ta et panoramabilde uten å blokkere synsfelt. Representative resultater er vist i figur 2, der resultatene flukt Slowpoke mutante fluer, som har en kjent uren defekt 8-10, blir sammenlignet med vill-type Canton-S fluer. Styre fluer gående lande nær toppen av sylinderen, med svært liten spredning mellom individer og en gjennomsnittlig landing høyde av 73 ± 2,0 cm. I kontrast, Slowpoke fluer vise en mye mer variert landing spredning, og landet betydelig lavere, gjennomsnittlig 44 ± 4,1 cm. Alle fluene var 3 dager gammel, oppvokst ved romtemperatur (23 ° C).
s/ftp_upload/51223/51223fig1.jpg "width =" 600px "/>
Figur 1. Diagrammer av Flight Tester, kamera, og Track. (A) Illustrasjon av oppsettet for den oppdaterte flight tester. Ring Stand en holder 90 cm-høy flight sylinder den; Ring Stand to holder trakten og 10 cm lange "drop tube". (B) Diagram av kamera og spor brukes til å produsere et panoramabilde. Kameraet bør støttes av banen uten å hindre utsikten fra objektivet. Klikk her for å se større bilde .
Figur 2. Representative resultater fra en sample flight eksperiment. Sammenligning av flyturen evne til tre-dagers gammel Canton-S kontroll flyr til Slowpoke mutanter (slo TS1). (A) Screen fanger for Slowpoke og kontroll fluer viser landings høyder av individuelle fluer. Hver blå sirkelen representerer plasseringen av en privatperson fly. Disse destinasjons høyder brukes til å beregne gjennomsnittlig landing høyde (B) samt generell fordeling (C) for hver genotype. Mannlige og kvinnelige fluer ble samlet sammen i hver prøve. Feil søylene representerer standardfeilen for gjennomsnittet. Klikk her for å se større bilde .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ved hjelp av de fremgangsmåter som er beskrevet her, har vi vært i stand til å vurdere ytelsen hurtig uren av et stort antall av Drosophila mutanter, noe som gir større effektivitet enn tidligere mulig. For våre eksperimenter, vi rutinemessig skille hanner og hunner og heve dem med lav tetthet (mindre enn 20 fluer / hetteglass) for å begrense aggresjon som kan skade vinger. En annen viktig faktor er å kontrollere riktig måte for forskjeller i flukt ytelse på grunn av forskjeller i genetisk bakgrunn. Vi finner også det hjelper å tillate fluer et minimum av 24 timers for å komme seg fra anesthetization med karbondioksid før flight testing. Alternativt kan fluer bedøves ved eksponering for kald temperatur (4 ° C) for å gi raskere gjenvinning uten potensielt påvirke virkemåten.
Den hastighetsbegrensende trinn i denne protokollen er å fjerne fluene fra plast ark mellom studier. En måte å øke effektiviteten på er å bruke et stort antall of ark samtidig, sette til side de arkene som de er brukt og rengjøring dem alle på en gang følgende datainnsamling. Fluer som faller til bunnen må telles manuelt, da de ikke vil bli inkludert på arket. Likevel, dette er lett i forhold til manuelt beregne landing høyde. Behovet for å på nytt Tangle-Trap til hvert ark vil variere avhengig av hvor tykt belegget er. I vår erfaring, vil et enkelt ark vare en måned før en ny coating er nødvendig.
En ytterligere fordel ved å bruke floke-felle i løpet mineralolje er evnen til å gjenopprette levende fluer fra arket. Siden fluene rett og slett holde seg til overflaten av Tangle-Trap snarere enn å bli oppslukt, kan enkelte fluer enkelt fjernes. "flight" fluer som faller til bunnen kan også utvinnes ved å bytte ut mineralolje brett med en tom kolbe.
Vi tror den automatiserte måling av fluktadferd beskrevet her gir et number fordeler fremfor tidligere metoder, noe som åpner for en høyere grad av gjennomstrømning, reproduserbarhet og nøyaktighet for genetiske skjermer. Automatisert scoring har også blitt brukt til å øke gjennomstrømningen for atferds analyser som RING analysen 11. Videre direkte måling av landing høyde gir en større følsomhet enn en enkel bestått / ikke bestått måling (% løpesedler, osv..), Slik at vi kan oppdage mer subtile forskjeller i flight ytelse.
Analysen beskrevet her kan suppleres med påfølgende ytterligere analyser som måler mer komplekse aspekter av fluktadferd, inkludert visuell kontroll av flygehastighet 12 og free-flight respons på bevegelse 13. Selv om disse testene er mer tidkrevende og ikke mottagelig for store genetiske skjermer, kan de bidra til å gi mer informasjon om et bestemt gen funksjon i et bevegelses respons.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health gir F32 NS078958 (DTB) og R01 AG033620 (BG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Putty knife | Home Depot | 630147 | www.homedepot.com |
| Pine back band moulding (2x) | Home Depot | 156469 | www.homedepot.com |
| Furring Strip Board | Home Depot | 164704 | www.homedepot.com |
| Tangle-Trap Insect Trap Coating | BioControl Network | 268941 | www.biconet.com |
| Laptop Computer | Apple | www.apple.com/mac/ | |
| Mineral oil | Fisher Scientific | BP26291 | www.fishersci.com |
| White poster board | Staples | 247403 | www.staples.com |
| Polystyrene weighing dish | Fisher Scientific | S67091A | www.fishersci.com |
| ImageJ Software | National Institutes of Health | http://rsb.info.nih.gov/ij/ | |
| Digital camera | Sony | DSC-TX7 | www.store.sony.com |
| Fine forceps | Fine Science Tools | www.finescience.com | |
| Polycarbonate cylinder (drop tube) | McMaster-Carr | 8585K62 | www.mcmaster.com |
| Flight cylinder (acrylic) | McMaster-Carr | 8486K943 | www.mcmaster.com |
| Polycarbonate sheets | McMaster-Carr | 85585K25 | www.mcmaster.com |
| ring stand (2x) | Fisher Scientific | S47808 | www.fishersci.com |
| Ring support | Fisher Scientific | S47791 | www.fishersci.com |
| Three-prong extension clamps (x2) | Fisher Scientific | 05-769-7Q | www.fishersci.com |
| Funnel | Fisher Scientific | 10-500-3 | www.fishersci.com |
| chain clamps (2x) | VWR | 21573-275 | www.vwr.com |
| Glass vials | VWR | 66020-198 | www.vwr.com |
References
- Benzer, S. Genetic dissection of behavior. Sci. Am. 229, 24-37 (1973).
- Ali, Y. O., Escala, W., Ruan, K., Zhai, R. G. Assaying locomotor, learning, and memory deficits in Drosophila models of neurodegeneration. J. Vis. Exp. , e2504 (2011).
- de Vries, S. E., Clandinin, T. Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. , e50192 (2013).
- Mundiyanapurath, S., Certel, S., Kravitz, E. A. Studying aggression in Drosophila (fruit flies). J. Vis. Exp. , e155 (2007).
- Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B. Methods to assay Drosophila behavior. J. Vis. Exp. , e3795 (2012).
- Shiraiwa, T., Carlson, J. R. Proboscis extension response (PER) assay in Drosophila. J. Vis. Exp. , e193 (2007).
- Lloyd, T. E., Taylor, J. P. Flightless flies: Drosophila models of neuromuscular disease. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1184, e1-e20 (2010).
- Atkinson, N. S., et al. Molecular separation of two behavioral phenotypes by a mutation affecting the promoters of a Ca-activated K channel. J. Neurosci. 20, 2988-2993 (2000).
- Atkinson, N. S., Robertson, G. A., Ganetzky, B. A component of calcium-activated potassium channels encoded by the Drosophila slo locus. Science. 253, 551-555 (1991).
- Elkins, T., Ganetzky, B., Wu, C. F. A Drosophila mutation that eliminates a calcium-dependent potassium current. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 8415-8419 (1986).
- Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Exp. Gerontol. 40, 386-395 (2005).
- Fry, S. N., Rohrseitz, N., Straw, A. D., Dickinson, M. H. Visual control of flight speed in Drosophila melanogaster. J. Exp. Biol. 212, 1120-1130 (2009).
- Mronz, M., Lehmann, F. O. The free-flight response of Drosophila to motion of the visual environment. J. Exp. Biol. 211, 2026-2045 (2008).
