Summary
Här beskriver vi en metod för snabb och noggrann mätning av flygprestanda i Drosophila, vilket möjliggör high-throughput screening.
Abstract
Drosophila har visat sig vara ett användbart modellsystem för analys av beteende, inklusive flyg. Den ursprungliga flygningen testare inblandade släppa flyger in i en oljebelagd mätglas, landningshöjd förutsatt ett mått på flygprestanda genom att bedöma hur långt flugor kommer att falla innan producera tillräckligt dragkraft för att göra kontakt med väggen av cylindern. Här beskriver vi en uppdaterad version av flyg testare med fyra stora förbättringar. Först har vi lagt en "drop tube" för att se till att alla flugor in i flygcylindern på en liknande hastighet mellan försöken, vilket eliminerar variationer mellan användarna. För det andra, ersatte vi oljebeläggning med löstagbara plastskivor belagda i Tangle-Trap, ett lim som syftar till att fånga levande insekter. För det tredje, använder vi en längre cylinder för att möjliggöra mer exakt diskriminering av flyg förmåga. Fjärde använder vi en digitalkamera och bildbehandling för att automatisera poängsättning av flygprestanda. Dessa förbättringar möjliggör rappaid, kvantitativ bedömning av flyg beteende, användbart för stora datamängder och stora genetiska skärmar.
Introduction
Drosophila har länge använts för att studera den genetiska grunden för beteende 1, och forskare har tagit fram ett antal olika sätt att analysera olika typer av beteenden 2-6. Flugor har varit särskilt användbara för att ge användbara modeller av neuromuskulära sjukdomar 7. En gemensam analys för att studera rörelsebeteende är flygprestanda. Den ursprungliga flyg testare är användbart för att identifiera flyg defekta mutanter och för kvantitativ bedömning av flygförmåga 1, men den har flera brister som begränsar dess tillämpning för hög genomströmning skärmar: användningen av oljebelagda cylindrar är rörigt och besvärligt, vissa funktioner som längden av cylindern och införsel av flugor i röret med variabel kraft minska kvantitativ noggrannhet, och det är svårt att återhämta levande flugor från testaren. För att övervinna dessa begränsningar har vi modifierat flygningen testare för att inkludera ett antal förbättringar. Vi har lagt till en "drop tuvara "att presentera flugor för att eliminera variationer mellan experiment och användare. Vi använder flyttbara akrylskivor belagda med ett lim som gör det enklare sanering och återvinning av enskilda flugor. Vi har ökat längden på flygröret för att förbättra kvantitativa noggrannhet och tillförlitlighet. Slutligen använder vi en digitalkamera och programvara bildbehandling för att beräkna landnings höjder av flugor. Vi tror att dessa förbättringar kommer att vara till nytta för alla laboratorier intresserade av att genomföra storskaliga genetiska skärmar för fel i flygprestanda.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Montera Flight Tester
- Säkra flygcylinder till Ring Stand 1 med hjälp av klämmor kedja. (Lämna ca 3 cm nedanför cylindern till väga skålen.)
(OBS: Flyg cylinder vi använder är 90 cm lång med en diameter på 13,5 cm.) - Sätt väger skålen med ett tunt lager av mineralolja under flygningen cylindern.
- Säker tratt till Ring Stand 2 med hjälp av en ringklämma och klo klämma. Justera höjden av tratten, så att bottnen av tratten är i jämnhöjd med den övre delen av flyg cylindern. (Notera: den spetsdiameter av tratten måste vara mindre än den yttre diametern hos ampullerna placeras i hängrören så att rören inte kommer att falla igenom.)
- Sätt i hängröret in i den övre delen av tratten och säkra med en klo klämma.
(Observera: Vi använder en droppe rör som är 25 cm långa Drop flyga innehållande ampullerna från denna höjd tillåter konsekvent utstötning av alla flugor med likformig kraft Innerdiametern hos fallröret bör vara sligh..tly större än ytterdiametern på flaskan så att flaskan falla fritt.) - Skär polyakrylamid Blad (s) till rätt storlek. (OBS: För att underlätta införande och avlägsnande av arket bör bredden vara något mindre än den inre omkretsen av flygningen cylinder.)
- Applicera ett tunt lager av Tangle-Trap på arket. Låt stå under en timme före användning. (OBS: Lämna tillräckligt med utrymme i toppen och botten av arket (ca 3 cm) obestruket att ta tag i bladet för insättning / borttagning.)
- Sätt i polyakrylamid arket i flygcylindern.
- Montera kameran spår med tall konsoler. (Notera: se till att botten på spåret kan stödja kameran utan att blockera linsen Se figur 1B..)
- Lägg proppar och skruva fast den. (OBS: plats stoppen på platser som gör att kameran att visa hela plastfolie i panoramaläge.)
2. Kör Experiment
- <li> Samla flaskor av flugor som ska testas. För bästa resultat, använd inte mer än 20 flugor / flaska.
- Knacka försiktigt flugor till botten av flaskan, dra ur och sätt in i droppröret och släpp flaskan.
(Notera: Ampullen faller ner droppröret tills den träffar den smala trattöppningen När flaskan träffar tratten, är flugorna sprutas in flygningen cylindern..) - Lyft droppröret för att ta bort den tomma flaskan.
(OBS: Flera injektionsflaskor med flugor i samma testgruppen kan analyseras på ett enda polyakrylamid blad Vi finner att upp till 200 flugor (10 injektionsflaskor med 20 flugor vardera) kan testas och avbildas lätt på ett enda ark.. - Ta bort plastskivan och lägg den på en plan vit yta.
(OBS: vit affisch ombord kan användas om bänkskivor är mörk.) - Montera kameran spåret över plastfolie. Kameran bör vara tillräckligt högt ovanför arket att ha både toppen och botten av arket i synfältet.
- Skjut kamera tillsammans the spår samtidigt som "capture"-knappen för att få en panoramabild.
- Antalet flugor som landar i oljan kan räknas manuellt för varje försök.
- Upprepa steg från 2,2 till 2,7 för samtliga i ett givet experiment. Flugorna kan avlägsnas från arket mellan varje försök. Alternativt kan flera ark användas, med ett nytt blad för varje försök.
3. Datainsamling
- Öppna bildfiler med ImageJ programvara.
- Beskära bilder om det är nödvändigt att ta med endast landningsytan. (Detta är det område belagt i Tangle-Trap.)
- Konvertera bilder till 8-bitars gråskala.
- Skapa en "tröskel" för att filtrera bort den vita bakgrunden.
(Bild → Justera → Threshold). - Ställ in parametrarna för att identifiera varje fluga med "analysera partiklar"-menyn.
(Analyze → Analysera Partiklar) Definiera de parametrar som används för att identifiera en partikel. Med vår inrättas, finner vi att du använder enområde på 5-90 pixlar 2 och en cirkel av 0,4-1,0 kommer korrekt identifiera alla prover. - Mät läget för varje fluga använder den genererade listan med koordinaterna för varje partikel. De x-koordinat i pixlar kan omvandlas till centimeter för att beräkna landningshöjd.
- Importera tabell i ett kalkylblad (till exempel Microsoft Excel).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1A visar en schematisk bild av den uppdaterade flyg testare montering. Figur 1B visar spår designen tillåter kameran att ta en panoramabild utan att blockera synfältet. Representativa resultat visas i figur 2, när flygningen prestanda slowpoke mutanta flugor, som har en känd flyg defekt 8-10, jämförs med vildtyp Canton-S-flugor. Kontroll flyger konsekvent landa nära toppen av cylindern, med mycket lite spridning mellan individer och en genomsnittlig landningshöjd på 73 ± 2,0 cm. Däremot slöfock flugor visar en mycket mer varierad landning spridning och mark betydligt lägre, i genomsnitt 44 ± 4,1 cm. Alla flugor var 3 dagar gammal, uppvuxen i rumstemperatur (23 ° C).
s/ftp_upload/51223/51223fig1.jpg "width =" 600px "/>
Figur 1. Diagram över Flight Tester, kamera, och spår. (A) Illustration av den som inrättats för den uppdaterade flyg testare. Ring Stand 1 håller 90 cm höga flyg cylinder, ring Stand 2 håller tratten och 10 cm lång "drop tube". (B) Diagram över kamera och spåra användas för att producera en panoramabild. Kameran bör stödjas av spåret utan att skymma utsikten från objektivet. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 2. Representativa resultat från en provflygexperiment. Jämförelse av flyg förmåga 3-dagars gammal CaNton-S kontroll flyger till Slowpoke mutanter (slo TS1). (A) Skärm fångar för slöfock och kontroll flugor visar landnings höjder enskilda flugor. Varje blå cirkel representerar läget för en enskild fluga. Dessa landnings höjder används för att beräkna den genomsnittliga landningshöjden (B) samt övergripande fördelning (C) för varje genotyp. Manliga och kvinnliga flugor samlades ihop i varje prov. Felstaplar representerar standardavvikelsen för medelvärdet. Klicka här för att visa en större bild .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Med hjälp av de metoder som beskrivs här, har vi haft möjlighet att snabbt bedöma flygprestanda för ett stort antal Drosophila-mutanter, vilket ger större effektivitet än tidigare varit möjligt. För våra experiment, vi rutinmässigt skilja män och kvinnor och ta upp dem vid låg täthet (mindre än 20 flugor / flaska) för att begränsa angrepp som kan skada vingar. En annan viktig faktor är att kontrollera ordentligt för skillnader i flygprestanda på grund av skillnader i genetisk bakgrund. Vi tycker också att det bidrar till att göra det möjligt flugor minst 24 timmar för att återhämta sig från bedövning med koldioxid före testflygningar. Alternativt kan flugor bedövas genom exponering för kall temperatur (4 ° C) för att tillåta snabbare återhämtning utan potentiellt påverka beteenden.
Det hastighetsbegränsande steget i detta protokoll är att ta bort flugorna från plastarket mellan försöken. En metod för att öka effektiviteten är att använda ett stort antal of ark samtidigt, åsidosätta de ark när de används och rengöring dem alla på en gång efter datainsamling. Flugor som faller till botten måste räknas manuellt, eftersom de inte kommer att finnas med på arket. Ändå är det lätt jämfört med manuellt beräkna landningshöjd. Behovet av att återapplicera Tangle-Trap att varje ark kommer att variera beroende på hur tjockt beläggningen är. Enligt vår erfarenhet, kommer en individuell plåt varar en månad innan en ny beläggning behövs.
En ytterligare fördel med att använda Tangle-Trap över mineralolja är förmågan att återhämta sig levande flugor från arket. Sedan flugorna fastnar helt enkelt på ytan av Tangle-Trap stället blir nedsänkta kan individuella flugor lätt tas bort. "Flightless" flugor som faller till botten kan också återvinnas genom att ersätta mineraloljefacket med en tom flaska.
Vi tror att den automatiska mätningen av flyg beteende som beskrivs här ger en numlet fördelar över tidigare metoder, vilket möjliggör en högre genomströmning, reproducerbarhet och noggrannhet för genetiska skärmar. Automatiserad scoring har också använts för att öka genomströmningen för beteendeanalyser, såsom den RING-analys 11. Vidare direkt mätning av landningshöjden ger en större känslighet än en enkel pass / fail mätning (% flygblad, etc.), Vilket tillåter oss att upptäcka mer subtila skillnader i flygprestanda.
Den analys som beskrivs här kan kompletteras med efterföljande ytterligare analyser som mäter mer komplexa aspekter av flygbeteende, inklusive visuell kontroll av flyghastighet 12 och fri-flyg svar på motion 13. Även om dessa tester är mer tidskrävande och inte mottaglig för storskaliga genetiska skärmar, kan de bidra till att ge mer information om en viss gen funktion i ett rörelsesvar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att lämna ut.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Institutes of Health bidrag F32 NS078958 (DTB) och R01 AG033620 (BG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Putty knife | Home Depot | 630147 | www.homedepot.com |
| Pine back band moulding (2x) | Home Depot | 156469 | www.homedepot.com |
| Furring Strip Board | Home Depot | 164704 | www.homedepot.com |
| Tangle-Trap Insect Trap Coating | BioControl Network | 268941 | www.biconet.com |
| Laptop Computer | Apple | www.apple.com/mac/ | |
| Mineral oil | Fisher Scientific | BP26291 | www.fishersci.com |
| White poster board | Staples | 247403 | www.staples.com |
| Polystyrene weighing dish | Fisher Scientific | S67091A | www.fishersci.com |
| ImageJ Software | National Institutes of Health | http://rsb.info.nih.gov/ij/ | |
| Digital camera | Sony | DSC-TX7 | www.store.sony.com |
| Fine forceps | Fine Science Tools | www.finescience.com | |
| Polycarbonate cylinder (drop tube) | McMaster-Carr | 8585K62 | www.mcmaster.com |
| Flight cylinder (acrylic) | McMaster-Carr | 8486K943 | www.mcmaster.com |
| Polycarbonate sheets | McMaster-Carr | 85585K25 | www.mcmaster.com |
| ring stand (2x) | Fisher Scientific | S47808 | www.fishersci.com |
| Ring support | Fisher Scientific | S47791 | www.fishersci.com |
| Three-prong extension clamps (x2) | Fisher Scientific | 05-769-7Q | www.fishersci.com |
| Funnel | Fisher Scientific | 10-500-3 | www.fishersci.com |
| chain clamps (2x) | VWR | 21573-275 | www.vwr.com |
| Glass vials | VWR | 66020-198 | www.vwr.com |
References
- Benzer, S. Genetic dissection of behavior. Sci. Am. 229, 24-37 (1973).
- Ali, Y. O., Escala, W., Ruan, K., Zhai, R. G. Assaying locomotor, learning, and memory deficits in Drosophila models of neurodegeneration. J. Vis. Exp. , e2504 (2011).
- de Vries, S. E., Clandinin, T. Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. , e50192 (2013).
- Mundiyanapurath, S., Certel, S., Kravitz, E. A. Studying aggression in Drosophila (fruit flies). J. Vis. Exp. , e155 (2007).
- Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B. Methods to assay Drosophila behavior. J. Vis. Exp. , e3795 (2012).
- Shiraiwa, T., Carlson, J. R. Proboscis extension response (PER) assay in Drosophila. J. Vis. Exp. , e193 (2007).
- Lloyd, T. E., Taylor, J. P. Flightless flies: Drosophila models of neuromuscular disease. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1184, e1-e20 (2010).
- Atkinson, N. S., et al. Molecular separation of two behavioral phenotypes by a mutation affecting the promoters of a Ca-activated K channel. J. Neurosci. 20, 2988-2993 (2000).
- Atkinson, N. S., Robertson, G. A., Ganetzky, B. A component of calcium-activated potassium channels encoded by the Drosophila slo locus. Science. 253, 551-555 (1991).
- Elkins, T., Ganetzky, B., Wu, C. F. A Drosophila mutation that eliminates a calcium-dependent potassium current. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 8415-8419 (1986).
- Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Exp. Gerontol. 40, 386-395 (2005).
- Fry, S. N., Rohrseitz, N., Straw, A. D., Dickinson, M. H. Visual control of flight speed in Drosophila melanogaster. J. Exp. Biol. 212, 1120-1130 (2009).
- Mronz, M., Lehmann, F. O. The free-flight response of Drosophila to motion of the visual environment. J. Exp. Biol. 211, 2026-2045 (2008).
