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Biology

Un metodo migliore per precisa e rapida misurazione delle performance in volo Published: February 13, 2014 doi: 10.3791/51223

Summary

Qui si descrive un metodo per la misurazione rapida e accurata delle prestazioni di volo in Drosophila, consentendo di screening high-throughput.

Abstract

Drosophila ha dimostrato di essere un sistema modello utile per l'analisi del comportamento, comprensivo di volo. Il tester volo caduta coinvolta iniziale vola in un rivestimento d'olio cilindro graduato, altezza atterraggio fornito una misura della performance di volo da valutare come mosche lontane cadranno prima di produrre abbastanza spinta a mettersi in contatto con la parete del cilindro. Qui si descrive una versione aggiornata del tester volo con quattro importanti miglioramenti. In primo luogo, abbiamo aggiunto un "tubo pescante" per garantire che tutte le mosche entrano nel cilindro volo ad una velocità simile tra la prova, eliminando la variabilità tra gli utenti. In secondo luogo, abbiamo sostituito il rivestimento dell'olio con teli di plastica estraibili rivestiti in Tangle-Trap, un adesivo progettato per catturare insetti vivi. In terzo luogo, usiamo un cilindro più lungo per consentire la discriminazione più accurata capacità di volo. Quarto si usa una fotocamera digitale e software di imaging per automatizzare il punteggio delle prestazioni di volo. Questi miglioramenti consentono il rapid, la valutazione quantitativa del comportamento in volo, utile per grandi dataset e schermi genetici su larga scala.

Introduction

Drosophila è stato a lungo utilizzato per studiare le basi genetiche del comportamento 1, ed i ricercatori hanno messo a punto una serie di modi per analizzare i vari tipi di comportamento 2-6. Le mosche sono stati particolarmente utili per fornire utili modelli di malattie neuromuscolari 7. Un test comunemente usato per studiare il comportamento locomotore è la prestazione di volo. Il tester volo originale è utile per identificare ponti mutanti difettosi e per la valutazione quantitativa della capacità di volo 1, ma ha diversi difetti che ne limitano l'applicazione per schermi ad alto rendimento: l'uso di bombole rivestite petrolio è disordinato e ingombrante, alcune funzionalità come la lunghezza del cilindro e l'introduzione di mosche nel tubo con forza variabile ridurre la precisione quantitativa, ed è difficile da recuperare in linea diretta dal tester. Per superare queste limitazioni, abbiamo modificato il tester volo per includere una serie di miglioramenti. Abbiamo aggiunto una "goccia tuessere "introdurre linea per eliminare variabilità tra esperimenti e utenti. Usiamo lastre acriliche rimovibili rivestiti con un adesivo che consente una più facile pulizia e recupero di singoli mosche. Abbiamo aumentato la lunghezza del tubo di volo per migliorare la precisione e l'affidabilità quantitativa. Infine , si usa una fotocamera digitale e software di imaging per calcolare le altezze sbarco di mosche. Crediamo che questi miglioramenti saranno utili a qualsiasi laboratorio interessato a condurre schermi genetici su larga scala per i difetti di prestazioni di volo.

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Protocol

1. Montare Tester Volo

  1. Cilindro volo sicuro a Ring stand 1 con fascette catena. (Lasciare circa 3 cm sotto il cilindro per pesare piatto.)
    (Nota: Il cilindro volo che usiamo è lungo 90 centimetri con un diametro di 13,5 centimetri.)
  2. Inserire pesare piatto con un sottile strato di olio minerale sotto il cilindro volo.
  3. Imbuto sicuro a Ring stand 2 utilizzando una pinza anello e morsetto artiglio. Regolare l'altezza dell'imbuto modo che il fondo dell'imbuto è a filo con la parte superiore del cilindro volo. (Nota: il diametro della punta dell'imbuto deve essere inferiore al diametro esterno di flaconi posizionati nei tubi goccia in modo che le fiale non cadere.)
  4. Inserire il tubo discesa nella parte superiore dell'imbuto e fissarlo con un morsetto artiglio.
    (Nota: Usiamo un tubo goccia che è lungo 25 centimetri Dropping vola contenenti flaconi da questa altezza permette di espulsione coerente di tutte le mosche con forza uniforme Il diametro interno del tubo di caduta deve essere sligh..temente maggiore del diametro esterno del flaconcino per consentire il flaconcino di cadere liberamente.)
  5. Tagliare foglio di poliacrilammide (s) per la dimensione corretta. (Nota: Per facilitare l'inserimento e la rimozione del foglio, la larghezza deve essere leggermente inferiore alla circonferenza interna del cilindro volo).
  6. Applicare uno strato sottile di Tangle-Trap al foglio. Lasciare riposare per 1 ora prima dell'uso. (Nota: Lasciare spazio sufficiente nella parte superiore e inferiore del foglio (circa 3 cm) rivestito di cogliere il foglio per l'inserimento / rimozione.)
  7. Inserire il foglio poliacrilammide nel cilindro volo.
  8. Montare la pista fotocamera utilizzando staffe di supporto di pino. (Nota: assicurarsi che il fondo della pista può supportare la fotocamera senza bloccare la lente Fare riferimento alla Figura 1B..)
  9. Aggiungi tappi e avvitare. (Nota: posto i tappi nelle posizioni che permetteranno la telecamera per visualizzare l'intero foglio di plastica in modalità panoramica.)

2. Eseguire Experiment

    <li> Raccogliere le fiale di mosche da testare. Per ottenere i migliori risultati, utilizzare non più di 20 mosche / flacone.
  1. Toccare delicatamente le mosche al fondo della fiala, scollegare, quindi inserire nel tubo goccia e rilasciare fiala.
    (Nota: Il flaconcino cade il tubo calo fino a raggiungere l'apertura stretto imbuto Quando il flaconcino colpisce l'imbuto, le mosche vengono espulsi nel cilindro di volo.).
  2. Sollevare il tubo di caduta per rimuovere la fiala vuota.
    (Nota: più fiale di mosche dello stesso gruppo di prova possono essere analizzati su un singolo foglio di poliacrilammide Troviamo che fino a 200 mosche (10 flaconcini da 20 mosche ciascuno) possono essere testati e ripreso prontamente su un unico foglio..
  3. Togliere il foglio di plastica e posizionarlo su una superficie piatta e bianca.
    (Nota: cartoncino bianco può essere utilizzato se top panchina sono di colore scuro.)
  4. Montare la pista fotocamera sul foglio di plastica. La telecamera deve essere sufficientemente alto sopra il foglio di avere sia la parte superiore e inferiore del foglio nel campo visivo.
  5. Far scorrere la fotocamera lungo °e traccia tenendo premuto il pulsante "cattura" per acquisire un'immagine panoramica.
  6. Il numero di mosche atterraggio nell'olio può essere conteggiato manualmente per ogni prova.
  7. Ripetere i passaggi 2,2-2,7 per tutte le condizioni di un dato esperimento. Le mosche possono essere rimossi dal foglio tra ogni prova. In alternativa, possono essere utilizzati diversi fogli, con un nuovo foglio per ogni prova.

3. Raccolta dati

  1. Apri file di immagine utilizzando il software ImageJ.
  2. Ritagliare le immagini se necessario, per includere solo la superficie di atterraggio. (Questa è l'area rivestita in Tangle-Trap.)
  3. Converti immagini a 8-bit in scala di grigi.
  4. Creare una "soglia" per filtrare il fondo bianco.
    (Immagine → Regola → Threshold).
  5. Impostare i parametri per identificare ogni volo usando il menu "analizzare le particelle".
    (Analizza → Analizza Particles) Definire i parametri utilizzati per identificare una particella. Con il nostro set up, troviamo che l'utilizzo di unarea di 5-90 pixel 2 e una circolarità di 0,4-1,0 identifichi accuratamente tutti i campioni.
  6. Misurare la posizione di ogni volo usando l'elenco generato delle coordinate per ogni particella. La coordinata x in pixel possono essere convertiti in centimetri per calcolare l'altezza di atterraggio.
  7. Importare tabella in un foglio di calcolo (come Microsoft Excel).

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Representative Results

La figura 1A mostra uno schema del gruppo di tester volo aggiornato. Figura 1B illustra il disegno tracciato permette alla fotocamera di scattare un'immagine panoramica senza bloccare il campo visivo. Risultati rappresentativi sono mostrati nella Figura 2, in cui le prestazioni di volo di mosche mutanti slowpoke, che hanno un volo noto difetto 8-10, vengono confrontati con wild-type Canton-S mosche. Controllo vola costantemente atterrare vicino alla parte superiore del cilindro, con molto poco diffuso tra gli individui e un'altezza media sbarco di 73 ± 2,0 centimetri. Al contrario, le mosche slowpoke mostrano una diffusione molto più varia di atterraggio, e la terra significativamente più bassi, con una media di 44 ± 4,1 centimetri. Tutte le mosche erano tre giorni di età, allevati a temperatura ambiente (23 ° C).

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Figura 1. Diagrammi di Tester Flight, macchina fotografica, e Track. (A) Illustrazione del set up per il tester volo aggiornato. Anello del basamento 1 detiene il cilindro volo 90 centimetri-alte; Anello basamento 2 detiene l'imbuto e la lunga cm-10 "tubo di caduta". (B) Schema di ripresa e Pista utilizzata per produrre un'immagine panoramica. La fotocamera dovrebbe essere sostenuto da pista senza ostruire la vista dalla lente. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .

Figura 2
Figura 2. I risultati rappresentativi da un esperimento di volo del campione. Comparazione della capacità di volo di 3 giorni old Cacontrollo Nton-S vola a Slowpoke mutanti (slo TS1). (A) Schermo cattura per mosche slowpoke e di controllo che mostrano le altezze di atterraggio dei singoli mosche. Ogni cerchio blu rappresenta la posizione di una mosca individuale. Queste altezze atterraggio vengono utilizzati per calcolare l'altezza media di atterraggio (B), così come la distribuzione globale (C) per ogni genotipo. Mosche maschio e femmina sono stati raggruppati insieme in ogni campione. Le barre di errore rappresentano l'errore standard della media. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .

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Discussion

Usando i metodi qui descritti, siamo stati in grado di valutare rapidamente le prestazioni di volo di un gran numero di mutanti di Drosophila, fornendo una maggiore efficienza rispetto al passato. Per i nostri esperimenti, abbiamo abitualmente separati maschi e femmine e li alleviamo a bassa densità (meno di 20 mosche / fiala) per limitare l'aggressività che potrebbero danneggiare le ali. Un'altra considerazione importante è quello di controllare adeguatamente le differenze nelle prestazioni di volo a causa di differenze di background genetico. Troviamo inoltre aiuta a consentire un minimo di 24 ore mosche per recuperare da anestesia con anidride carbonica prima del test di volo. In alternativa, le mosche possono essere anestetizzati da esposizione al freddo (4 ° C) per consentire il recupero più veloce senza potenzialmente influenzare il comportamento.

La tappa limitante in questo protocollo è la rimozione in linea dal foglio di plastica tra le prove. Un metodo per aumentare l'efficienza è quello di utilizzare un numero grande of fogli contemporaneamente, mettendo da parte i fogli in cui sono utilizzati e li pulizie in una volta dopo la raccolta dei dati. Mosche che cadono sul fondo dovranno essere contati manualmente, in quanto non saranno inclusi sul foglio. Eppure, questo è facile rispetto al calcolo manuale altezza di atterraggio. La necessità di riapplicare Groviglio-Trap per ogni foglio varia a seconda dello spessore del rivestimento è. Nella nostra esperienza, un singolo foglio durerà un mese prima è necessario un nuovo rivestimento.

Un ulteriore vantaggio di utilizzare aggroviglia-Trap su olio minerale è la capacità di recuperare in linea diretta dal foglio. Dal momento che le mosche si attaccano semplicemente alla superficie del Groviglio-Trap piuttosto che immergersi, singoli mosche possono essere facilmente rimossi. mosche "volatori" che cadono sul fondo possono essere recuperati sostituendo il vassoio olio minerale con un pallone vuoto.

Crediamo che la misura automatizzata del comportamento in volo qui descritto fornisce un numeromero di vantaggi rispetto ai metodi precedenti, consentendo un più elevato livello di produttività, riproducibilità e precisione per schermi genetici. Scoring automatico è stato utilizzato anche per aumentare il throughput per le analisi comportamentali come RING test 11. Inoltre, la misura diretta dell'altezza sbarco fornisce una sensibilità maggiore di una semplice misura di pass / fail (% volantini, ecc.), Che ci permette di rilevare le differenze più sottili in prestazioni di volo.

Il test qui descritto può essere integrata da ulteriori successivi test che misurano gli aspetti più complessi di comportamento in volo, compreso il controllo visivo della velocità di volo 12 e le risposte volo libero di movimento 13. Mentre questi test sono più e non suscettibili di schermi genetici su larga scala-intensive tempo, possono contribuire a fornire maggiori informazioni sulla funzione di un particolare gene in una risposta locomotoria.

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Disclosures

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health concede F32 NS078958 (DTB) e R01 AG033620 (BG).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Putty knife Home Depot 630147 www.homedepot.com
Pine back band moulding (2x) Home Depot 156469 www.homedepot.com
Furring Strip Board Home Depot 164704 www.homedepot.com
Tangle-Trap Insect Trap Coating BioControl Network 268941 www.biconet.com
Laptop Computer  Apple www.apple.com/mac/
Mineral oil Fisher Scientific BP26291 www.fishersci.com
White poster board Staples 247403 www.staples.com
Polystyrene weighing dish Fisher Scientific S67091A www.fishersci.com
ImageJ Software National Institutes of Health http://rsb.info.nih.gov/ij/
Digital camera Sony DSC-TX7 www.store.sony.com
Fine forceps Fine Science Tools www.finescience.com
Polycarbonate cylinder (drop tube) McMaster-Carr 8585K62 www.mcmaster.com
Flight cylinder (acrylic) McMaster-Carr 8486K943 www.mcmaster.com
Polycarbonate sheets McMaster-Carr 85585K25 www.mcmaster.com
ring stand (2x) Fisher Scientific S47808 www.fishersci.com
Ring support Fisher Scientific S47791 www.fishersci.com
Three-prong extension clamps (x2) Fisher Scientific 05-769-7Q www.fishersci.com
Funnel Fisher Scientific 10-500-3 www.fishersci.com
chain clamps (2x) VWR 21573-275 www.vwr.com
Glass vials VWR 66020-198 www.vwr.com

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Tags

Comportamento , Neuroscienze performance di volo, wild-type
Un metodo migliore per precisa e rapida misurazione delle performance in volo<em&gt; Drosophila</em
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Cite this Article

Babcock, D. T., Ganetzky, B. AnMore

Babcock, D. T., Ganetzky, B. An Improved Method for Accurate and Rapid Measurement of Flight Performance in Drosophila. J. Vis. Exp. (84), e51223, doi:10.3791/51223 (2014).

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