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Summary
여기서 우리는 subventricular 영역과 개인 성인 쥐의 치아 이랑 (dentate gyrus)에서, 부착 단층 또는 neurosphere를 하나로서, 신경 전구 세포 배양의 동시 발생에 대한 자세한 프로토콜을 설명합니다.
Abstract
neurosphere 분석 및 접착 단층 배양 시스템은 생체 전위의 성인 신경 줄기 세포 (증식 또는 분화)을 결정하는 유용한 도구이다. 이러한 분석법은 신경 전구 세포의 증식과 분화에 외인성 요인의 효과를 결정하기 위하여 연속적인 통로를 통해 정량 할 수있는 신경 전구 세포주를 생성하기 위해 유 전적으로 다른 또는 차동으로 처리 된 동물에서 분리 된 세포의 전구체 전위와 비교하는데 사용될 수있다. neurosphere 분석은 전통적으로 주로 그들은 일차 조직으로부터 분리하여 뇌 조직에서 전구체 세포 수의 빠른 추정을주는 중요한 이점을 갖는다 될 수있는 최종적인 마커의 부족으로, 줄기 세포의 사후 식별에 사용된다 각각의 동물에서 유래. 자기편 단층 배양 대조적 전통적 동물 개체 간의 확산을 비교하는 데 사용되지 않는다각각의 문화는 일반적으로 5-8 사이 동물의 결합 조직에서 시작으로. 그러나, 그들은, neurosphere를 달리 그들이 전구체 세포의 대부분 균질 집단으로 구성 및 단일 세포 분화 과정을 다음에 유용한 큰 장점이있다. 여기서는, 처음으로, 개별 동물로부터 접착 배양을, 상세히, neurosphere 문화의 생성을 설명하고. 이 subventricular 영역 (SVZ) 및 처리 또는 유 전적으로 다른 마우스 라인의 치아 이랑 (dentate gyrus) (DG) 모두에서 증식 및 / 또는 분화 가능성의 짝을 분석뿐만 아니라 동물의 사용에 상당한 감소를 포함하여 많은 중요한 의미가 있습니다.
Introduction
neurosphere 분석 1,2 자기편 단일 층 문화 3,4, 모두가 1990 년대 초에 개발은 여전히 체외 신경 줄기 세포 분석의 황금 표준 남아있다. 이러한 분석에서, 일차 조직이 특정 뇌 영역에서 마이크로 해부, 부동성 어느 인자 -2 (FGF2)가 형성하는 단일 세포 현탁액과 분열 촉진 물질의 표피 성장 인자 (EGF) 및 섬유 아세포 성장의 존재 하에서 배양으로 해리 클러스터 (neurosphere를) 또는 부착 단층. 두 시스템은 장점과 단점 및 심사숙고의 수는 하나 또는 다른 시스템을 선택하기 전에 해결되어야하는 문제에 관련되어야한다.
을 neurospheres은 전구 세포의 수와 가능성의 차이 간단 판독 할 수 있습니다. 또한, neurosphere를 또한 정상적인 외부 환경에서 제거 할 때 셀의 고유 사양을 연구 할 수있는 유용한 도구입니다. ExtrinSIC 큐 단순히 성장 배지의 관심 요소를 첨가하고 생성을 neurospheres의 개수와 크기를 정량화하여 연구 될 수있다. 을 neurospheres의 주요 결점은 있지만, 그들은면 (5)에 비해 더 분화되고 neurosphere를 (특히 대형을 neurospheres)의 중앙에 세포와 자신의 틈새를 형성한다는 것이다. neurosphere를 줄기 세포, 전구 세포 투입하고 분화 된 세포와 neurosphere를 내의 세포 - 세포 상호 작용을 줄기 세포의 유지를 방해의 혼합을 포함한다. neurosphere를 해당 줄기 세포 6-8 단지 소수를 포함하는 이유이다.
자기편 단일 층 문화는 또한 생체 내 증식 모델에 좋은 생체 외 시스템을 제공한다. 세포가 더 고립되고 균일 남아있는 자기편 문화, neurosphere의 이질성을 제거 할 수 있습니다. 이러한 성장 조건에서 전구체 세포를 증식 RAPIDLY 거의 모든 세포는 분열과 특성 신경 전구 마커 네 스틴, SOX2, 그리고 BLBP을 표현하고 있습니다. neurosphere 분석에 비해 단층 배양 시스템의 주요 단점은 각각의 전구체에서 파생 된 클론을 모니터링하고 정량화 할 수없는 것입니다.
분리 전략의 수율은 종종 빈약 되었기 때문에 배양 두 유형에도 프로토콜의 단점은, 동물의 상대적으로 많은 수의 사용 필요성왔다. 동시에, 그것은 성인 신경뿐만 아니라 개별적인 생체 외 모델에 대한 필요성의 결과 뇌 9의 개별화에 기여하는 것이 명백 해졌다. 이 보고서에 설명 된대로 이러한 요구는 "한 - 마우스 - 하나의 문화"프로토콜에 의해 충족 될 수있다.
다음 Visual 프로토콜은 SVZ과 DG 개별 동물 중 하나를 부착 한 m에서 모두 신경 전구체 문화의 동시 발생을 설명합니다onolayers 또는 neurosphere를 등. 개별 동물의 문화의 생성은 개별적으로 처리 된 동물 또는 다양한 개별 유전자 변형 또는 야생형 생쥐 사이의 비교가 필요한 경우에 특히 유용합니다. 이 프로토콜은 자세한 어른 생쥐에서 SVZ과 DG 지역의 동시 미세 절제에 대한 지침, 단일 세포 현탁액에 자신의 분리, 부착 단층 문화 또는 neurosphere를하고 multipotentiality 장기 잠재력 분석 중 하나로 체외 문화, 두 추기경을 포함 뼈 성실한 줄기 세포의 특성.
Protocol
1. 기본 설정 및 문화 매체의 제조
- 두 개 이상의 일 이전에 실험을 시작으로, 폴리-D-라이신 (PDL) / 라미닌이 부착 단층 배양을 위해 플레이트를 코팅을 준비합니다. 우물 / 플라스크 코트 표면에 충분히 PDL DH (2 O 10 ㎎ / ㎖)을 추가하고 실온에서 밤새 품어 준비하려면. 요리에서 솔루션을 제거하고 dH보다 2 O와 접시를 세 번 씻어 공기 건조 할 수 있습니다. 라미닌 (차가운 DMEM 5 ㎎ / ㎖ : F12)를 추가하고 밤새 37 ° C에서 알을 품다. 라미닌을 제거하고도 즉시 번호판을 사용하거나 필요한 때까지 -20 ° C에서 라미닌에 저장합니다.
- 모서리가 둥근 될 때까지 불꽃에 유리 파스퇴르 피펫을 돌려 "보통"과 "작은"구멍에 불 광택 피펫을 준비합니다. 소독 압력솥.
- 해부의 날에, 2 % B27, 1X 루타, 2 ㎎ / ㎖ 헤파린과 함께 신경 기초 배지를 혼합하여 배양액에 적당량을 제조 50 유닛 / ㎖ 페니실린 / 스트렙토 마이신, 20 NG / ㎖ 정제 마우스 수용체상의 표피 성장 인자 (EGF), 및 20 NG / ml의 재조합 소 섬유 아세포 성장 인자 (FGF-2). 수조에서 37 ° C로 배지를 따뜻하게.
- SVZ 해리를 들어, 0.05 % 트립신-EDTA를 준비하고 0.125 ㎎ / ㎖ 트립신은 0.01 ㎎ / ㎖ DNaseI를 포함 억제제. 37 ° C.에이 솔루션을 평형
- 해부 현미경을 설정하고 뇌 (가위와 작은 주걱)를 제거하고 SVZ과 DG 해부 (메스, 1 ML의 주사기에 부착 된 27 G 바늘, 1 개의 x # 7 집게, 1 개의 x # 45분의 5에하는 데 필요한 도구를 준비 70 % 에탄올에 담가 집게).
2. 성인 마우스의 두뇌와 SVZ / DG Microdissections의 수확
- 해당 기관의 지침에 따라 하나의 성인 (8 주령) 마우스를 마취. 자궁 경부 전위를 수행합니다.
- 영역을 살균 및 퍼의 양을 최소화하기 위해 70 % 에탄올로 헤드 스프레이 것을가위와 뇌에 dheres. 사용 날카로운 가위는 뇌간의 기지에서 동물의 목을 벨.
- 각각의 눈 구멍에 가위의 작은 쌍 중 하나 블레이드를 배치하고 관상으로 절단하여 두 개의 후각 전구의 두개골을 절단, 두개골의 기지에서 머리를 들고. . 가위의 각도가 기본이되는 뇌의 손상을 방지하기 위해 가능한 한 얕은 확인 : 다음,주의 시상 봉합 따라 두개골을 통해 길이 컷 뒤에 두개골의 바닥에있는 두 개의 측면 상처를합니다.
- 가위의 날이나 곡선 포셉 한 쌍의 하나와 두개골을 다시 박리하여 뇌를 노출합니다. 차가운 PBS로 작은 주걱과 장소를 사용하여 두개골에서 뇌를 무료.
- 혈액과 모피를 제거하는 PBS로 머리를 씻어.
- PBS를 포함하는 10cm 플라스틱 페트리 접시에 머리를 이동
- 낮은 배율의 해부 현미경으로 뇌를 포함하는 페트리 접시를 놓고 꼰 로프 위치그것의 복부 표면에 N. 소뇌에 의해 위치에 머리를 잡고 잘 곡선 집게를 사용하면 후각 전구를 제거합니다.
- 등의 측면에 두뇌 회전과 메스를 사용하면 시신경 시신경 교차의 수준에서 뇌를 통해 관상 컷을
- SVZ를 microdissect하기 위해 (더 자세한 내용은 Azari 등. 10 참조), 잘라 관상면이 위쪽으로 향하도록 뇌의 주동이의 부분을 배치하고 높은 배율로 현미경의 초점을 맞 춥니 다. 제거 및 미세 곡선 집게를 사용하여 격막을 버린다.
- 즉시 조직으로 바로 뇌량 다른 약 1mm에서 뇌실의 측면 모서리에 미세한 곡선 포셉 한 쌍의 한 블레이드의 팁을 배치하여 SVZ (뇌실 주위 조직의 얇은 층) 해부 뇌실에 인접한. 요리의 기본 방향과 ventr의 복부 측면을 향해 집게를 아래로 눌러icle는 조직의 작은 삼각형 조각을 제거합니다. 얼음에 페트리 접시에 해부 SVZ를 놓습니다.
- DG를 microdissect하기 위해 (더 자세한 내용은 Hagihara 등. 11 참조), 페트리 접시와 메스를 사용하여 세로 방향 균열을 따라 절단에 뇌의 꼬리 부분을 놓습니다.
- 해부 현미경, 집게를 사용하여 소뇌와 간뇌를 제거합니다.
- DG 주위의 테두리를 지금 볼 수 있도록 현미경을 집중할. 치아 이랑 (dentate gyrus)를 제거하려면 DG 암몬의 뿔 사이의 경계를 따라 27 G 바늘과 슬라이드의 끝 부분을 삽입합니다. 미세 집게를 사용하여 주변 조직에서 DG를 무료.
3. SVZ 조직 해리
- 더 큰 조각이 남아 있지 않을 때까지 약 1 분 동안 메스 블레이드를 사용하여 조직을 말하다.
- 데워진 0.05 % 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 1 ㎖를 사용하여 15 ML 튜브에 다진 조직을 전송하고 7 분 동안 품어물 목욕은 37 ℃로 설정
- , 효소 반응을 중지 DNaseI를 포함하는 트립신 억제제 1 ㎖를 추가하고 튜브를 쓸어 넘겨 내용을 혼합합니다.
- 5 분 300 XG에서 원심 분리하여 현탁액을 펠렛 상층 액을 버린다
- 성장 배지 1 ㎖에 펠렛을 재현 탁 부드럽게 P1000 피펫을주의하여 아래로 약 7 배를 피펫 팅에 의해 해리 :. triturating 이상 증가 된 세포의 죽음으로 이어질 수있는 부정적인 이후의 세포 성장에 영향을 미칠 것입니다.
- 5 ㎖의 총 볼륨 성장 매체를 추가하고 파편과 해리되지 않은 조직 덩어리를 제거하기 위해 40 밀리 체를 통해 세포 현탁액을 전달합니다.
- 5 분 300 XG에 원심 분리기, 뜨는을 취소하고 200 ㎖의 성장 매체에서 생성 된 펠렛을 재현 탁.
4. DG 조직 해리
- 더 큰 조각이 남아 및 전송까지 약 1 분 동안 메스 블레이드를 사용하여 조직을 잘게데워진 PDD 효소 믹스 (파파인 2.5 U / ㎖, 디스 파제 1 U / ㎖, DNaseI 250 U / ㎖)로. 관마다 3 ~ 5 분을 반전시켜 혼합, 37 ° C에서 20 분 동안 품어.
- 기계적으로 중간 구멍을 사용하여 조직을 떼어 놓다, 부드럽게 아래로 배를 피펫 팅에 의해, 파스퇴르 피펫을 연마 화재.
- 관마다 3 ~ 5 분을 반전시켜 혼합, 37 ° C에서 추가로 10 분 동안 품어.
- 또한 기계적으로 작은 구멍을 사용하여 조직을 떼어 놓다, 화재 부드럽게 아래로 배를 피펫 팅에 의해 파스퇴르 피펫을 연마했습니다.
- 5 분 130 XG에 원심 분리기.
- 뜨는을 제거하고 1 ㎖의 완충 용액 (1X HBSS, 30 mM의 포도당, 2 mM의 HEPES (산도 7.4), 26 mM의 탄산 수소 나트륨)의 펠렛을 재현 탁. 완충 용액 10 mL로한다.
- 5 분 130 XG에 원심 분리기.
- 상층 액을 제거하고 20 % 퍼콜 5 ㎖에 펠렛을 재현 탁. (0.5 배 PBS의 ML에 100 % 퍼콜 4.5 mL를 넣고, 퍼콜 90 %를 준비하려면 다음 추가로 20 %에이 희석3.9 ㎖의 1X PBS)에 1.1 ㎖의 90 % 퍼콜을 추가하여.
- 15 분 450 XG에 원심 분리기.
- 상층 액을 제거하고 10 ㎖ 버퍼에 펠렛을 재현 탁.
- 5 분 130 XG에 원심 분리기.
- 200 ㎕의 성장 배지에 펠렛을 재현 탁.
5. 자기편 단층 문화의 생성
- 96 - 웰 플레이트 잘 코팅 된 단일 PDL / 라미닌에 해리 SVZ 또는 DG 조직 플레이트와 5 % CO 2와 37 ° C에서 알을 품다.
- 세포는 코팅 표면에 부착 한 후 약 24 시간 후에, 도금, 더 과량의 파편을 제거하기 위하여 성장 배지를 교환한다.
- 모든 후속 3-4일, 성장 인자를 보충하는 신선한 배지에서 성장 배지의 교환 절반.
- . 세포가 약 80 %의 포화 상태에 도달하고 계대 할 준비가 참고가 될 때까지 반복 도금 및 제 1 통로 사이의 시간 2 ~ 3 주 걸릴 수 있습니다.
- 문화가 약 80 %의 포화 상태에 도달하면 우물에서 매체를 제거하고 PBS로 세척.
참고 : 세포 사멸의 증가 수준이 세포의 분리 및 neurosphere 형성하고 추가로 발생할 수있는 세포가 90 %의 포화 상태를 초과하는 것을 허용하지 않습니다. - 50 ㎖ Accutase를 추가하고 2 ~ 3 분 (세포가 둥근와 분리되어 있는지 확인), 37 ° C에서 알을 품다.
- 15 ML 튜브에 세포를 제거하고 잘 PBS로 한번 씻어 같은 튜브에 전송할 수 있습니다.
- 5 PBS ㎖로 5 분 동안 원심 분리기 300 XG에 세포를 희석.
- 제 1 통로를 들어, 1 ml로 세포를 희석하고 24 웰 플레이트에 잘 코팅 된 PDL / 라미닌에 접시.
- 이후의 통로를 들어, 200 ㎖의 성장 매체와 카운트가 혈구를 사용하여에에 resuspend 세포. 플레이트 1에서 X 10 4 세포를 적절한 크기의 코팅 잘 나 플라스크 / ㎠. I>
7. 자기편 단층 문화의 분화
- 20 NG / ML EGF 10 NG / ML bFGF와를 포함하는 성장 매체에 1 × 104 세포 / ㎠의 밀도로 PDL / 라미닌 코팅 커버 슬립에 부착 단층 배양 접시, 증식 세포를 구별합니다.
- 세포가 약 80 %의 포화 상태 (보통 2 일)에 도달하면, 매체가 5 NG / ㎖의 bFGF를 0 NG / ML EGF를 함유하는 성장 매체를 교체하십시오.
- 5 NG / ㎖의 bFGF의 이일 따라, 또한 3 일간 모두 분열 촉진 물질의 부재하에 성장 배지로 배지를 대체 참고.이 기간 동안 세포 사멸의 상당량이 발생할 것이다.
- 오일의 전체 후, 실온에서 20 분 동안 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)로 고정 후 죽은 세포를 제거하기 위해 PBS로 분화 된 세포를 세척한다.
- 4 ℃에서 1 ㎖ PBS 우물의 모든 PFA 및 저장의 coverslips를 제거하는 PBS로 다시 세척
- 배지 20 ㎖에 동물에서 해리 SVZ 또는 DG 조직을 희석하고 10 ㎖ multidoser 피펫을 사용하여 96 - 웰 플레이트에서 200 ㎖ / 잘 접시.
- DG-파생 neurosphere를위한 SVZ 파생 neurosphere를 10-12 일 6~7일에 대한 5 % CO 2와 37 ° C에서 알을 품다.
참고 :이 권장 배양 시간 이상을위한 성장과 성장에 발생하고 neurosphere를 및 / 또는 자발적 부착 및 분화의 중심에서 세포의 죽음으로 이어질 것입니다. - 계산 및 수직 광학 현미경에 장착 접안 계수 선을 사용하여 neurosphere를의 직경을 측정
9. 을 neurospheres 계대
기본 neurosphere를이 계산 된 그들의 크기는 기록 후 그들은 하나의 neurosphere 또는 대량 문화 중 하나로 시작하는 여러 통로를 통해 확장 할 수 있습니다.
- 대량 문화 neurosphere 확장
- 대량 문화로 통과 결합을 neurospheres에, 5 분 300 XG에 15 ML 튜브와 원심 분리기로 전송, 플레이트에서 neurosphere를을 포함하는 매체를 제거합니다.
- 뜨는을 취소하고 예비 가온 0.05 % 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 1 ㎖에을 neurospheres 재현 탁하고 3 분 동안 실온에서 품어.
- DNaseI를 포함하는 트립신 억제제의 동일한 볼륨을 추가하고 잘 섞는다.
- 300 XG에서 5 분 원심 분리하여 상층 액을 제거하고 성장 매체의 1 ML을 추가합니다.
- 을 neurospheres 해리 P1000 피펫으로 위아래로 약 10 배 씹다.
- 세포 현탁액 10 ㎖를 제거하고 트리 판 블루의 동량으로 섞어 혈구를 사용하여 살아있는 세포 수를 수행합니다.
- 적절한 크기의 셀 웰 배양 플라스크 또는 / cm이 1 × 104 세포의 밀도로 세포를 시드.
- 37 ° C에서 알을 품다5 % CO 2 차 neurosphere를 형성 할 때까지.
- 단일 neurosphere 확장
- 통로에 개인 neurosphere를 단일 neurosphere을 포함 우물을 선택하고 신중하게 neurosphere을 방해하지 않고 각 우물에서 성장 매체의 약 160 μl를 제거하고 폐기.
- 각 웰 계대 할에 0.05 % 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 100 ㎖를 첨가하고 3 분 동안 실온에서 품어.
- 반응을 정지 DNAseI를 포함하는 트립신 억제제의 100 μl를 추가합니다.
- 씹다 약 10 배 위로 neurosphere을 분열하는 P200 피펫 아래.
- 성장 배지 1.5 ㎖를 함유 24 - 웰 플레이트의 웰에 새로운 해리 neurosphere를 함유하는 200 ㎖를 전송합니다. 차 neurosphere를 형성 할 때까지 5 % CO 2와 37 ° C에서 알을 품다.
참고 : 장기 잠재력, 진정한 신경의의 추기경의 속성 중 하나를 결정하기 위해TEM 셀은 neurosphere를 적어도 50-10 계대 계대한다. 또한 결과 12-14의에서 일부 논란의 해석에 관한 문헌을 참조하십시오.
10. Neurosphere 문화의 분화
기본 또는 계대을 neurospheres은 multipotentiality를 결정하기 위해 차별화 할 수 있습니다.
- 그들의 문화 플레이트 또는 플라스크에서 정학을 neurospheres 제거하고 10cm 플라스틱 페트리 접시에 전송할 수 있습니다.
- 해부 현미경 P20 피펫을 사용하여 매체로부터 약 15-20 neurosphere를 제거하고 성장 인자와 PDL / 라미닌 코팅 된 커버 슬립없이 배양 배지를 함유하는 24 - 웰 플레이트에 옮긴다.
- 5 % CO 2와 37 ° C에서 약을 7 일 동안 차별화.
- 실온에서 20 분 동안 4 % PFA로 고정 후 죽은 세포를 제거하는 PBS와 차별화 neurosphere를 씻으십시오.
- R에 PBS로 다시 세척4 ° C에서 1 ㎖의 PBS에있는 우물에서 어떤 PFA 및 저장 커버 슬립을 emove
11. Neurosphere과 자기편 문화의 면역 염색
참고 : O4 항체로 염색은 트리톤 차단 및 염색 단계에서 생략하고 적절한 IgM 항체 차 항체를 사용하는 것을 기억하십시오.
- 실온에서 60 분 동안 용액 (PBS의 10 % 정상 혈청 당나귀 0.2 % 트리톤 X-100을 포함)을 차단하는 분화 neurosphere를 부착 또는 단층 배양 물을 함유하는 커버 슬립을 배양한다.
- 기본 빌 - 튜 불린, Map2a + B를, 아교 섬유 성 산성 단백질 (GFAP) 또는 실온에서 60 분에 대한 O4 항체를 포함하는 신선한 차단 솔루션에 품어.
- PBS로 3 회 세척한다.
- 적절한 형광 복합 이차 항체 및 4,6 - diamidino -2 - 페닐 인돌 포함 신선한 차단 솔루션을 품다 (DAPI를, 1:5,000) 어둠 속에서 실온에서 30 분 동안.
- 어두운 야간에 형광 설치 매체 및 공기 건조를 사용하여 현미경 슬라이드에 커버 슬립을 탑재
- 형광 현미경을 사용하여보기 및 이미지.
Representative Results
성인 마우스 뇌의 두 개의 영역이 신경성 신경 전구 세포가 포함되지만 때 시험관에서 배양이 세포는 상당히 다르게 동작 할 수있다. 두 지역에서 생성 된 부착 단층 배양 그러나, SVZ 유래 접착 문화가 빠르게 확산 1-2 일전 DG에서 파생 된 것보다 평균적으로 계대 배양해야합니다 (그림 1A) 형태 학적으로 구별이 나타납니다. neurosphere를 같이, SVZ 유래 전구 세포는 빠르게 증식 및 DG-유래 전구 세포 (그림 1C)보다 큰 neurosphere를 (그림 1B)를 형성한다. SVZ 파생을 neurospheres는 일반적으로 문화 6 ~ 7 일 후에 계산하는 동안, DG-파생 neurosphere를 보통 10-12일 후 정량화. 속을 neurospheres 될 수의 약 10 배 더 큰 수에 의해 입증되는 바와 같이 또한, 신경 전구 세포의 수는 더 작게, DG 비교 SVZ에 상주이 지역에서 테드 (SVZ : DG 대 1,173 ± 74.9 : 145.3 ± 26.4, P = <0.0001, 그룹 당 n = 10 마리, 그림 2A).
연구는 SVZ과 DG 내 전구 세포가 다른 자극에 반응하는 것으로 나타났습니다. SVZ 전구 세포가 후각 학습과 후각 농축에 의해 활성화되는 반면 DG의 전구 세포는 공간 학습의 특정 유형에 의해 이러한 환경 농축과 신체 활동 등의 자극에 의해 활성화된다. 이과 일치, 우리 (TLW) 중 하나는 이전에 DG가 신경 여자 15 ~ 18에 의해 활성화 될 수있는 잠재 줄기 및 전구 세포의 인구를 포함 것을 보여 주었다. 반면에, 우리는 SVZ 전구 세포는 KCl을 17 레벨을 탈분극에 대한 응답으로 neurosphere 수의 감소와 함께, 매우 다르게이 자극에 반응 것으로 나타났습니다. 여기, 우리는 공업의 SVZ과 DG에서 파생 된 고립 된 세포의 절반을 도금,이 실험을 반복 한의 KCl의 수준과 제어의 KCl 수준의 다른 절반을 탈분극에있는 동물을 ividual. 우리는 (DG 전구체 세포 탈분극 (101.2 ± 17.4 대 184.8 ± 12.5, p = 0.005, N = 5 동물)에 의해 활성화되는 동안, SVZ 유래 세포의 증식이 실제로 상당히 감소 된 것으로, 앞서 입증 368.0 ± 62.9 대 266.6 ± 41.6, P = 0.02, N = 5 동물, 그림 2B).
장기 잠재력, 진정한 줄기 세포, 단일 neurosphere를 또는 부착 단층 문화의 추기경의 기능 중 하나를 확인하려면 최소 10 유로 이상 즉, 확장 된 확장 할 수 있어야합니다. 각 통로에서, 단일 세포 현탁액의 제조 다음, 세포의 수를 카운트하고 방면 팽창이 계산된다. 이론적 셀 전체이어서 이전 유로로부터 이론적 인 전체 의해 그 유로 중에 방면 팽창을 곱하여 계산된다. 이 DISP입니다 통로 번호를 가진 선 그래프로 누워 (실시 예도 3 참조) 이론적 총 세포 수의 LOG10 대해 도시. multipotentiality을 확인하려면 두 단층 문화와 neurosphere를은 미토 겐의 철수에 따라 구별 할 수있는 두 뉴런에 상승을 제공하기 위해 표시하고, 아교 (그림 4).
.. 그림 1 성인 마우스 전구 세포가 부착 단층 문화 (A) 또는 neurosphere를 (: SVZ, C : B DG)로 배양 될 수있다. 스케일 바 50 mm로 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
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그림 2. 훨씬 더 neurosphere를이 하나의 마우스의 DG에 비해 SVZ에서 생성 된 (A). SVZ과 DG 전구 세포는 체외 탈분극 (B)에 다르게 반응.
그림 3. 장기 상승 작용을 확인하기는 neurosphere를 10 이상 구절 확장됩니다.
그림 4. neurosphere를이 빌 - 부르 돈 관로 분화 할 수있다LIN + 뉴런 (A : 빨강), GFAP + 성상 세포 (A : 녹색), O4 + 희소 돌기 아교 세포 (B : 빨강) 및 Map2ab + 뉴런 (C : 레드). 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
이 논문은 성인 쥐 뇌의 두 가지 주요 신경성 지역에서 신경 전구 문화, 부착 한 단층과 neurosphere를 모두의 개시에 대한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 이러한 체외 배양 시스템 중 하나를 시도 할 때 염두에 보관해야합니다 중요한 점은 여러 가지가있을 수 있습니다. 첫째, 분리 방법의 선택은 매우 중요하고 조직 의존적이다. 우리 손에, 0.05 % 트립신-EDTA는 SVZ 조직의 분해에 매우 효과적이며, 파파인 해리 기반 기술을 사용하는 경우보다 neurosphere를 높은 수의 결과. DG 조직의 분리를 위해, 그러나, 우리는 강하게 파파 기반의 분리 방법을 추천합니다. 직접 DG 조직에있는 두 개의 분리 방법을 비교했을 때, 우리는 가능한 세포의 상당히 낮은 수율을 관찰 트립신을 사용하는 경우 약 적은을 neurospheres 10 배. 해리의 차이는 조직 compositio의 차이로 인해 수두 지역 사이의 N. DG의 소형 조직은 광범위한 neuropil에 둘러싸여 세포 과정의 광범위한 손상을 분리하는 동안 발생할 수 있습니다.
주목해야 할 두번째 중요한 점 neurosphere 분석은 주어진 조직 샘플에 존재하는 전구 세포의 수에 대한 정량적 인 설명은 할 유용 할 수 있지만, 약간의주의는, 그러나, 이들의 절대 수치 해석에 사용되어야한다는 것이다. 을 neurospheres의 융합은 중요한 교란 요인이 될 수 있습니다. 몇몇 연구는 신경이 매우 운동성, 심지어 가정으로 '클론'조건 7,19 무엇인지에 따라, 융합 할 수있는 것으로 나타났습니다. 얻어진 neurosphere 주파수는 매체 컴포넌트, 해부 절차와 해리 과정 포함한 요소에 매우 의존 할 수있다. 심지어 경험이 풍부한 핸들러 사이에 가정으로 동일 시료에서 생성 neurosphere를 수있는 몇 가지 변화는 (그림 1A에게 볼 분명하다.) 더 유용하게, 주어진 두 개의 샘플 (즉, 제어 대 치료 또는 야생형 대 녹아웃)가 아니라 전체의 양적 문보다, 하나의 실험에서 동일한 사람에 의해 처리 사이의 전구체 주파수의 직접적인 비교입니다 전구 세포의 수.
그것은 두 배양 시스템이 생성 세포 유형의 균질성에서 다르다는 것을주의하는 것이 중요하다 특정 실험에도 적합이 배양 방법 중 어느 결정할 때. 매우 균일 한 전구 세포 풀 (~ 세포의 98 %가 SOX2 +이다)를 보여 자기편 세포 배양, 증식에 비해 20 neurosphere를 더 이질적 및 포함,뿐만 아니라 증식 전구 세포, 분화 된 신경 세포와 성상 세포 (21, 22). 그것은 neurosphere를 더 큰 같은 구절 사이의 장기간 배양하지 않는 것이 중요합니다 그것이 자신의 핵심에있는 분화 된 세포 유형을 찾을 확률이 더 높다가 neurosphere.
우리는 전통적으로 5-8 사이의 마우스의 DG 조직에서 자기편 단일 층 신경 전구 문화를 시작합니다. 단일 마우스 DG 또는 SVZ에서 점착성 단층 배양을 확립하려고 시도하는 따라서 정성은 조직 triturating 위에 기인 과도한 세포 죽음을 피하기 위해 조직 해리 과정 중에주의 할 필요 또는 확장 복용 해부 및 최종 배양 단계 사이의 시간의 기간. 이 프로토콜은, 처음으로, 설명의 개별 동물의 SVZ와 DG 모두로부터 점착성 단층 배양 전구체의 생성. 전구체의 증식 및 분화의 비교는 하나의 동물에 기초 할 필요가있는 경우 많은 경우가있다. 이들은 직접 DG 페어링 된 통계를 사용하여 개별 동물의 SVZ을 비교하는 개별 행동 또는 생리 학적 데이터 9와 문화의 데이터를 쌍으로 할 수있는 기능을 포함합니다. 단일 동물 문화도 알유전자 협회의 연구에 대한 연령과 일치하는 문화 당 5-8 기증자의 풀 수없는 희귀 형질 전환 동물뿐만 아니라 독특한 동물 (예 : F2 십자가 또는 축소 사육 동물)의 낮은 사용.
Disclosures
저자가 공개하는 게 없다.
Acknowledgments
TLW는 마리 퀴리 국제 들어오는 원정대에 의해 지원되었다. 이 작품은 또한 기본적인 제도적 기금에서 조달하고, Bundesministerium은 Bildung와 Forschung (BMBF)의 자금과 일부 GK에 우선 순위 연구 프로그램 (SFB) 655의 지원을 모피. 저자는 배려와 모든 연구에 사용 된 동물과 오데트 라이터, Susann Ruhwald, 패니 BOEHME, 세포 배양과 현미경의 도움 리처드 웨츨의 유지 보수를 위해 앤 Karasinsky에게 감사의 말씀을 전합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly-D-lysine | Sigma | P7280-5MG | |
| Laminin | Roche | 11243217001 | |
| Glass Pastuer pipettes | Volac | BS5732 | |
| DMEM:F12 (1:1) 1x | Life Technologies | 21331-020 | |
| Neural Basal Medium (1x) | Life Technologies | 21103-049 | |
| B27 supplements (50x) | Life Technologies | 17504-044 | |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050-038 | |
| Heparin | Sigma | H3393 | |
| Penacillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
| bFGF | PeproTech | 100-18B | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
| Trypsin inhibitor | Sigma | T6522 | |
| DNaseI | Roche | 10104159001 | |
| Accutase | PAA | L11-007 | |
| Papain | Worthington | LS003120 | |
| Dispase | Life Technologies | 17105-041 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-02 | |
| HBSS (with Calcium and Magnesium) | Life Technologies | 14025-050 | |
| Glucose | Roth | X997.2 | |
| HEPES | Sigma | H3375-500G | |
| NaHCO3 | Merck | K39347429847 | |
| 1 ml Syringes | Braun | 2016-10 | |
| 27 G Needles | Braun | 4657705 | |
| Scalpels (#22 disposable) | Braun | BA222 | |
| Dumont #7 forceps | FST | 11271-30 | |
| Dumont 5/45 forceps | FST | 11251-35 | |
| Scissors | FST | 14060-10 | |
| Iris spatula | FST | 10093-13 | |
| 70% Ethanol | |||
| PBS | Life Technologies | 14040-091 | |
| flasks/well plates | TPP | 92696 | |
| PFA (4%) | Sigma | P6148 | |
| Hemocytometer | Marienfeld | 650010 | |
| Trypan blue (0.4%) | Sigma | T8154 | |
| NDS | Millipore | 530 | |
| TritonX-100 | Sigma | T9284 | |
| Mouse monoclonal bIII-tubulin antibody | Promega | G712A | |
| Rabbit polyclonal glial fibrillary acidic protein antibody | Dako | 20334 | |
| O4 | R&D Systems | MAB1326 | |
| Map2a+b | Sigma | M1406 | |
| Donkey anti-mouse Cy3 antibody | Jackson ImmunoResearch | 715-505-151 | |
| Donkey anti-rabbit Alexa488 | Dianova | 711-545-152 | |
| 4,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Invitrogen | 861405 | |
| Aqua Polymount | Polysciences Inc | 18606 | |
| 10 ml Combi tips | Eppendorf | 30089677 | |
| Plastic 10 ml and 25 ml serological pipettes | Corning | 4488/4489 | |
| EQUIPMENT | |||
| Pipetboy | Integra Biosciences | 521942 | |
| Multidoser pipette | Eppendorf | ||
| 37 °C waterbath | |||
| Dissecting microscope | |||
| 37 °C:5% CO2 incubator | |||
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R |
References
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신경 과학 제 84 전구 세포 neurosphere 부착 단층 subventricular 영역 치아 이랑 (dentate gyrus) 성인 마우스Erratum
Formal Correction: Erratum: One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice
Posted by JoVE Editors on 11/26/2014.
Citeable Link.
A correction was made to One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice. Many micro symbols were changed into milli symbols by accident: In the Protocols, sections 1.1, 1.3, 3.6, 3.7, 6.2, 6.6, 8.1, 9.1.6, 9.2.2, and 9.2.5 need to be fixed, as does Figure 1 description in the Results section.
Protocol section 1.1 was changed from:
At least two days prior to commencing the experiment, prepare Poly-D-lysine (PDL)/Laminin coated plates for adherent monolayer cultures. To prepare wells/flasks add enough PDL (10 mg/ml in dH2O) to coat the surface and incubate overnight at room temperature. Remove the solution from the dish and wash the dish three times with dH2O. Allow to air dry. Add Laminin (5 mg/ml in cold DMEM:F12) and incubate at 37 °C overnight. Remove the Laminin and either use the plates immediately or store with the Laminin at -20 °C until required.
to:
At least two days prior to commencing the experiment, prepare Poly-D-lysine (PDL)/Laminin coated plates for adherent monolayer cultures. To prepare wells/flasks add enough PDL (10 µg/ml in dH2O) to coat the surface and incubate overnight at room temperature. Remove the solution from the dish and wash the dish three times with dH2O. Allow to air dry. Add Laminin (5 µg/ml in cold DMEM:F12) and incubate at 37 °C overnight. Remove the Laminin and either use the plates immediately or store with the Laminin at -20 °C until required.
Protocol section 1.3 was changed from:
On the day of dissection, prepare the appropriate amount of culture medium by mixing Neural Basal Medium with 2% B27, 1x GlutaMAX, 2 µg/ml heparin, 50 units/ml Penicillin/Streptomycin, 20 ng/ml purified mouse receptor-grade epidermal growth factor (EGF), and 20 ng/ml recombinant bovine fibroblast growth factor (FGF-2). Warm the culture medium to 37 °C in a water bath.
to:
On the day of dissection, prepare the appropriate amount of culture medium by mixing Neural Basal Medium with 2% B27, 1x GlutaMAX, 2 mg/ml heparin, 50 units/ml Penicillin/Streptomycin, 20 ng/ml purified mouse receptor-grade epidermal growth factor (EGF), and 20 ng/ml recombinant bovine fibroblast growth factor (FGF-2). Warm the culture medium to 37 °C in a water bath.
Protocol section 3.6 was changed from:
Add growth medium to a total volume of 5 ml and pass the cell suspension through a 40 mm sieve to remove debris and undissociated tissue clumps.
to:
Add growth medium to a total volume of 5 ml and pass the cell suspension through a 40 µm sieve to remove debris and undissociated tissue clumps.
Protocol section 3.7 was changed from:
Centrifuge at 300 x g for 5 min, discard the supernatant and resuspend the resulting pellet in 200 ml growth medium.
to:
Centrifuge at 300 x g for 5 min, discard the supernatant and resuspend the resulting pellet in 200 µl growth medium.
Protocol section 6.2 was changed from:
Add 50 ml Accutase and incubate at 37 °C for 2-3 min (checking to see if the cells are rounded and detached).
to:
Add 50 µl Accutase and incubate at 37 °C for 2-3 min (checking to see if the cells are rounded and detached).
Protocol section 6.6 was changed from:
For subsequent passages, resuspend cells in 200 ml growth medium and count using a hemocytometer. Plate at 1 x 104 cells/cm2 in the appropriate sized coated well or flask.
to:
For subsequent passages, resuspend cells in 200 µl growth medium and count using a hemocytometer. Plate at 1 x 104 cells/cm2 in the appropriate sized coated well or flask.
Protocol section 8.1 was changed from:
Dilute the dissociated SVZ or DG tissue from one animal in 20 ml of culture medium and plate 200 ml/well across a 96-well plate using a 10 ml multidoser pipette.
to:
Dilute the dissociated SVZ or DG tissue from one animal in 20 ml of culture medium and plate 200 µl/well across a 96-well plate using a 10 ml multidoser pipette.
Protocol section 9.1.6 was changed from:
Remove 10 ml of the cell suspension and mix with an equal volume of trypan blue and perform a live cell count using a hemocytometer.
to:
Remove 10 µl of the cell suspension and mix with an equal volume of trypan blue and perform a live cell count using a hemocytometer.
Protocol section 9.2.2 was changed from:
Add 100 ml of 0.05% Trypsin-EDTA to each well to be passaged and incubate at room temperature for 3 min.
to:
Add 100 µl of 0.05% Trypsin-EDTA to each well to be passaged and incubate at room temperature for 3 min.
Protocol section 9.2.5 was changed from:
Transfer the 200 ml containing the dissociated neurosphere to a new well of a 24-well plate containing 1.5 ml of growth medium. Incubate at 37 °C with 5% CO2 until secondary neurospheres form.
to:
Transfer the 200 µl containing the dissociated neurosphere to a new well of a 24-well plate containing 1.5 ml of growth medium. Incubate at 37 °C with 5% CO2 until secondary neurospheres form.
Figure 1 description was updated from:
Figure 1. Adult mouse precursor cells can be cultured as adherent monolayer cultures (A) or as neurospheres (B: SVZ, C: DG). Scale bar is 50 mm.
to:
Figure 1. Adult mouse precursor cells can be cultured as adherent monolayer cultures (A) or as neurospheres (B: SVZ, C: DG). Scale bar is 50 µm.
