Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Neuroscience

En mus, to kulturer: isolering og dyrkning af voksne neurale stamceller fra Two Neurogene zoner Individuel Mus

doi: 10.3791/51225 Published: February 25, 2014

ERRATUM NOTICE

Summary

Her beskriver vi en detaljeret protokol for samtidig produktion af neurale forløber cellekulturer, som enten vedhængende monolag eller neurosfærer fra subventricular zone og dentatgyrus enkelte voksne mus.

Abstract

Neurosfæren assay og adhærerende monolag dyrkningssystem er værdifulde værktøjer til at bestemme de potentielle (proliferation eller differentiering) af voksne neurale stamceller in vitro. Disse assays kan anvendes til at sammenligne precursor potentiale af celler isoleret fra genetisk forskellige eller forskelligt behandlede dyr at bestemme virkningerne af eksogene faktorer på neurale forstadie celleproliferation og-differentiering og til at generere neurale precursor cellelinier, der kan analyseres i løbet af kontinuerlige passager. Neurosfæren analysen er traditionelt anvendes til post-hoc identifikation af stamceller, primært på grund af manglende endelige markører, som de kan isoleres fra den primære væv og har den store fordel, at give en hurtig vurdering af forstadie celletal i hjernevæv stammer fra individuelle dyr. Adhærente monolagskulturer derimod ikke traditionelt bruges til at sammenligne spredning mellem de enkelte dyr, Som hver kultur i almindelighed initieres fra den kombinerede væv mellem 5-8 dyr. Men de har den store fordel, at i modsætning neurosfærer, de består af en hovedsagelig homogen population af precursorceller og er anvendelige til at følge differentieringsprocessen i enkeltceller. Her vil vi beskrive i detaljer, generering af neurosfæreceller kulturer, og for første gang, vedhængende kulturer fra de enkelte dyr. Dette har mange vigtige konsekvenser, herunder parret analyse af proliferation og / eller differentiering potentiale i både subventricular zone (SVZ) og dentatgyrus (DG) af behandlede eller genetisk forskellige mus linjer, samt en betydelig reduktion i brugen af ​​dyr.

Introduction

Neurosfæren assay 1,2 og klæbende monolagskultur 3,4, begge udviklet i begyndelsen af 1990'erne, stadig den gyldne standard in vitro neurale stamceller assays. I disse assays er primært væv mikro dissekeret fra et bestemt område af hjernen, dissocieres til en enkelt cellesuspension og dyrkes i nærværelse af mitogener epidermal vækstfaktor (EGF) og fibroblastvækstfaktor-2 (FGF2) til dannelse af enten frit flydende klynger (neurosfærer) eller omliggende monolag. Begge systemer har en række fordele og ulemper, og omhyggelig overvejelse bør gives til det spørgsmål, der skal løses, før det ene eller det andet system er valgt.

Neurosfærer tillader en enkel udlæsning af forskelle i forstadie celle nummer og potentiale. Derudover neurosfærer er også et nyttigt redskab til at studere iboende specifikation af celler, når fjernet fra deres normale ydre miljø. Læsionsic tidskoder kan studeres ved blot at tilføje den faktor af interesse for vækstmediet og kvantificere antallet og størrelsen af ​​neurosfærerne genererede. Den største ulempe ved neurosfærer er imidlertid, at de danner deres egen niche, med cellerne i centrum af neurosfærerne (særligt store neurosfærer) er mere differentierede end dem på overflade 5. Neurosfærer indeholder en blanding af stamceller, begået stamfædre og differentierede celler og celle-celle interaktioner inden neurosfærerne modvirker vedligeholdelse af stamceller. Dette er grunden til neurosfærer kun indeholder et lille antal sande stamceller 6-8.

Adhærente monolagskulturer også give en god in vitro system til at modellere in vivo spredning. Tilhænger kulturer, hvor cellerne forbliver mere isoleret og homogen, kan eliminere heterogene karakter neurosfæren. Under disse vækstbetingelser precursor prolifererer rapiDELAY og næsten alle celler deler og udtrykke de karakteristiske neurale precursor markører nestin, Sox2 og BLBP. Den største ulempe ved monolagskultur systemet i forhold til neurosfæren assayet er, at de enkelte precursor-afledte kloner er i stand til at blive overvåget og kvantificeres.

En ulempe ved de fleste protokoller for begge typer af kulturer har været nødvendigt at anvende relativt store antal dyr, fordi udbyttet af den isolation strategier ofte har været dårlig. Samtidig er det blevet klart, at voksen neurogenese bidrager til individualisering af hjernen 9, hvilket resulterer i behovet for individualiserede ex vivo modeller samt. Disse behov kan opfyldes ved "one-mus-en-kultur" protokoller, der er beskrevet i denne rapport.

Følgende visuelle protokol beskriver den samtidige generation af neurale precursor kulturer fra både SVZ og GD af enkelte dyr enten som klæbende monolayers eller som neurosfærer. Den generation af kulturer fra det enkelte dyr er især nyttig, når sammenligninger mellem individuelt behandlede dyr eller diverse individuelle transgene eller vild-type mus er påkrævet. Denne protokol indeholder detaljerede instruktioner til den samtidige mikrodissektion af SVZ og GD regioner fra voksne mus, deres dissociation i en enkelt celle suspension, in vitro kultur som enten vedhængende monolagskulturer eller neurosfærer og analyser af multipotentiality og langsigtet potentiale, de to kardinal egenskaber af en knogle fide stamcelle.

Protocol

1.. Grundlæggende opsætning og klargøring af Culture Medium

  1. Mindst to dage før påbegyndelse af eksperimentet, forberede Poly-D-lysin (PDL) / Laminin belagte plader til vedhængende monolagskulturer. Til fremstilling brønde / kolber tilføje nok PDL (10 mg / ml i dH2O) at overtrække overfladen og inkuberes natten over ved stuetemperatur. Fjern løsning fra fadet og vaske fad tre gange med dH 2 O. Lad lufttørre. Tilføj laminin (5 mg / ml i kold DMEM: F12), og der inkuberes ved 37 ° C natten over. Fjern laminin og enten bruge pladerne straks eller opbevares sammen med laminin ved -20 ° C indtil brug.
  2. Forbered brand poleret pipetter med "medium" og "små" boringer ved at dreje glas Pasteur-pipetter i en flamme, indtil kanterne bliver afrundet. Autoklaveres for at sterilisere.
  3. På dagen for dissektion, forberede den passende mængde dyrkningsmedium ved at blande Neural Basal Medium med 2% B27, 1x Glutamax, 2 mg / ml heparin, 50 enheder / ml penicillin / streptomycin, 20 ng / ml oprenset muse-receptor-grade epidermal vækstfaktor (EGF) og 20 ng / ml rekombinant bovin fibroblastvækstfaktor (FGF-2). Opvarm dyrkningsmedium til 37 ° C i et vandbad.
  4. For SVZ dissociation forberede 0,05% trypsin-EDTA og 0,125 mg / ml trypsininhibitor indeholdende 0,01 mg / ml DNaseI. Ækvilibrer disse løsninger til 37 ° C.
  5. Opsæt en dissektion mikroskop og forberede de nødvendige redskaber til at fjerne hjernen (saks og lille spatel) og for SVZ og GD dissektioner (skalpel, 27 G nål fastgjort til 1 ml sprøjte, 1 x # 7 pincet, 1 x # 5/45 pincet) ved neddypning i 70% ethanol.

2. Høst af Voksen musehjerner og SVZ / GD Microdissections

  1. Bedøver enkelt voksen (8 uger gamle) mus i henhold til de relevante institutionelle retningslinjer. Udfør cervikal dislokation.
  2. Spray hovedet med 70% ethanol til at sterilisere området og for at minimere mængden af ​​pels, at endheres til saksen og hjerne. Brug af en skarp saks halshugge dyr på bunden af ​​hjernestammen.
  3. Holde hovedet i bunden af ​​kraniet, skåret kraniet mellem de to olfaktoriske pærer ved at placere et blad af en lille saks i hvert øje, hulrum og skære coronalt. Dernæst skal to laterale snit i bunden af kraniet, efterfulgt af en langsgående snit gennem kraniet langs den sagittale sutur Forsigtig:. Sikrer vinklen på saks er så lavvandet som muligt for at undgå at beskadige den underliggende hjernen.
  4. Udsætte hjernen ved at trække kraniet med enten bladet af en saks eller et par buede pincet. Frigør hjernen fra kraniet ved en lille spatel og sted i koldt PBS.
  5. Skyl hjerner med PBS for at fjerne blod og pels.
  6. Overfør hjerner til en 10 cm plast petriskål indeholdende PBS
  7. Placer petriskål indeholdende hjernen under et dissektionsmikroskop ved lav forstørrelse og placer brain på ventrale overflade. Brug fine buede pincet fjerne de olfaktoriske pærer, mens du holder hjernen på plads af lillehjernen.
  8. Drej hjernen på den dorsale aspekt, og ved hjælp af en skalpel gøre en koronale snit gennem hjernen på niveauet for den optiske chiasm
  9. At microdissect den SVZ (for mere detaljerede instruktioner, se også Azari et al. 10), skal du placere rostrale del af hjernen, så cut koronale overflade vender opad og fokusere mikroskopet på et højere forstørrelse. Fjern og kassér membran med fine buede pincet.
  10. Dissekere SVZ (det tynde lag af væv, der omgiver ventrikel) ved at placere spidsen af ​​et blad af et par fine buet pincet i den laterale hjørne af den laterale ventrikel umiddelbart under corpus callosum og de øvrige ca 1 mm ind i vævet umiddelbart støder op til ventrikel. Tryk ned tangen mod bunden af ​​skålen og mod den ventrale aspekt af VentRkel at fjerne en lille trekantet stykke væv. Placer dissekerede SVZ i en petriskål på is.
  11. At microdissect GD (for mere detaljerede instruktioner, se også Hagihara et al. 11), skal du placere caudale del af hjernen i petriskålen og klippe langs den langsgående revne ved hjælp af en skalpel.
  12. Under en dissektion mikroskop, fjerne lillehjernen og diencephalon med pincet.
  13. Koncentrere mikroskop, så grænserne omkring GD er nu synlige. For at fjerne dentatgyrus, spidsen af ​​en 27 G kanyle og glide langs grænsen mellem GD og Ammons horn. Ved hjælp af fine tænger, befri GD fra det omgivende væv.

3. SVZ Tissue Dissociation

  1. Hak væv ved hjælp af en skalpel for ca 1 min, indtil ingen store stykker tilbage.
  2. Overfør det hakkede væv til et 15 ml rør ved hjælp af 1 ml forvarmet 0,05% trypsin-EDTA og inkuberes i 7 minutter iet vandbad indstillet til 37 ° C.
  3. For at stoppe den enzymatiske reaktion, der tilsættes 1 ml trypsin inhibitor indeholdende DNaseI og bland indholdet ved at stille røret.
  4. Pelletere suspensionen ved centrifugering ved 300 xg i 5 min og supernatanten
  5. Pellet resuspenderes i 1 ml vækstmedium og dissociere ved forsigtigt at pipettere op og ned omkring 7-10x ved hjælp af en P1000 pipette Forsigtig:. Løbet findeling kan føre til øget celledød og vil have en negativ indvirkning på den efterfølgende cellevækst.
  6. Tilføj vækstmedium til et samlet volumen på 5 ml og passerer cellesuspensionen gennem en 40 mm sigte til at fjerne snavs og dissocierede væv klumper.
  7. Der centrifugeres ved 300 xg i 5 minutter, supernatanten og resuspender resulterende pellet i 200 ml vækstmedium.

4.. GD Tissue Dissociation

  1. Hak væv ved hjælp af en skalpel i ca 1 min, indtil ingen store stykker tilbage og overførseli forvarmet PDD enzymblanding (Papain 2,5 U / ml dispase 1 U / ml, DNasel 250 U / ml). Inkuber i 20 minutter ved 37 ° C, blandes ved at vende røret hver 3-5 min.
  2. Adskille vævet mekanisk med en medium boring, fyre poleret, Pasteur pipette ved pipettering op og ned forsigtigt 10x.
  3. Inkuberes i yderligere 10 minutter ved 37 ° C, blanding ved at vende røret hver 3-5 min.
  4. Yderligere dissocierer vævet mekanisk med en lille boring, flammepoleret Pasteur-pipette ved pipettering op og ned forsigtigt 10x.
  5. Centrifuger ved 130 xg i 5 min.
  6. Supernatanten fjernes, og pellet resuspenderes i 1 ml bufferopløsning (1x HBSS, 30 mM glucose, 2 mM HEPES (pH 7,4), 26 mM NaHCO3). Der fyldes op til 10 ml med bufferopløsning.
  7. Centrifuger ved 130 xg i 5 min.
  8. Fjern supernatanten og pellet resuspenderes i 5 ml 20% Percoll. (Til fremstilling af 90% Percoll, tilsættes 4,5 ml 100% Percoll til 0,5 ml 10x PBS derefter yderligere fortynde dette til 20%ved tilsætning af 1,1 ml 90% Percoll til 3,9 ml 1x PBS).
  9. Centrifuger 450 xg i 15 min.
  10. Supernatanten fjernes, og pellet resuspenderes i 10 ml buffer.
  11. Centrifuger ved 130 xg i 5 min.
  12. Pellet resuspenderes i 200 vækst pi medium.

5.. Generering af Adherent monolagskulturer

  1. Plate dissocieret SVZ eller GD væv i en enkelt PDL / Laminin coated brønd på en 96-brønds plade og inkuberes ved 37 ° C med 5% CO2.
  2. Ca. 24 timer efter udpladning, når cellerne er klæbet til den overtrukne overflade, udveksler vækstmediet for yderligere at fjerne overskud af snavs.
  3. Hvert efterfølgende 3-4 dage, udveksling halvdelen af ​​vækstmediet med frisk medium til at genopbygge de vækstfaktorer.
  4. Gentag, indtil cellerne når omkring 80% konfluens, og er klar til at blive passeret Bemærk:. Tiden mellem yderklædningen og den første passage kan tage op til 2-3 uger.
  1. Når kulturerne nå omkring 80% sammenflydning fjerne mediet fra brønden og vask med PBS.
    Bemærk: Du må ikke tillade, at cellerne overstige 90% sammenflydning, da dette kan føre til frigørelse af cellerne og neurosfære dannelse og derudover forhøjede niveauer af celledød.
  2. 50 ml Accutase og inkuberes ved 37 ° C i 2-3 min (kontrol for at se, om cellerne er afrundet og fritliggende).
  3. Fjern cellerne til et 15 ml rør og vaske brønden en gang med PBS og overføres til det samme rør.
  4. Fortynd celler til 5 ml med PBS og centrifugeres 300 xg i 5 min.
  5. For den første passage, fortyndes cellerne til 1 ml og pladen i en PDL / Laminin coated brønd i en plade med 24 brønde.
  6. For efterfølgende passager, Resuspender cellerne i 200 ml vækstmedium og tæller ved hjælp af et hæmocytometer. Plade ved 1 x 10 4 celler / cm 2 i passende størrelse belagt godt eller kolbe. i>

7.. Differentiering af Adherent monolagskulturer

  1. At differentiere de adhærente monolagskulturer, varmeplader prolifererende celler på PDL / laminin coatede dækglas i en tæthed på 1 x 10 4 celler / cm 2 i vækstmedium indeholdende 20 ng / ml EGF, og 10 ng / ml bFGF.
  2. Når cellerne nåede ca 80% konfluens (som regel 2 dage), udskifte vækstmedium med medium indeholdende 5 ng / ml bFGF og 0 ng / ml EGF.
  3. Efter 2 dage i 5 ng / ml bFGF erstatte mediet med vækstmedium i fravær af begge mitogener i yderligere 3 dage Bemærk:. I denne periode en betydelig mængde af celledød vil forekomme.
  4. Efter i alt 5 dage, vaskes differentierede celler med PBS for at fjerne eventuelle døde celler derefter fastgøres med 4% paraformaldehyd (PFA) i 20 minutter ved stuetemperatur.
  5. Der udvaskes igen med PBS for at fjerne eventuelle PFA og gemme dækglas i brønde i 1 ml PBS ved 4 ° C.
jove_title "> 8. neurosfære Kultur og kvantificering

  1. Fortynd dissocierede SVZ eller GD væv fra et dyr i 20 ml dyrkningsmedium og pladen 200 ml / brønd på en plade med 96 brønde under anvendelse af en 10 ml multidoser pipette.
  2. Der inkuberes ved 37 ° C med 5% CO 2 for 6-7 dage for SVZ-afledte neurosfærer og 10-12 dage for DG-afledte neurosfærer.
    Bemærk: vækst i længere tid end de anbefalede inkubationstider vil resultere i overvækst og vil føre til celledød i centrum af neurosfærerne og / eller, spontan fastgørelse og differentiering.
  3. Tæl og måle diameteren af ​​neurosfærerne ved hjælp af et okular gradnet monteret på en opretstående lysmikroskop

9.. Passage af Neurosfærer

Efter de primære neurosfærer er blevet talt, og deres størrelse registreres de kan udvides over flere passager, der begynder med enten en enkelt neurosfære eller en bulk kultur.

  1. Bulk kultur neurosfære ekspansion
    1. Passage kombineret neurosfærer som en bulk kultur, skal du fjerne mediet indeholdende neurosfærerne fra pladen overføres til et 15 ml rør og centrifuger ved 300 xg i 5 min.
    2. Bortkast supernatanten og resuspender neurosfærerne i 1 ml forvarmet 0,05% trypsin-EDTA og inkuberes ved stuetemperatur i 3 min.
    3. Tilføj en tilsvarende mængde trypsin inhibitor indeholdende DNaseI og bland godt.
    4. Centrifuger i 5 minutter ved 300 xg, supernatanten fjernes, og der tilsættes 1 ml vækstmedium.
    5. Triturer op og ned ca 10x med en P1000 pipette til at adskille neurosfærer.
    6. Fjern 10 ml af cellesuspensionen og blandes med et lige volumen trypanblåt og udføre en levende celletal under anvendelse af et hæmocytometer.
    7. Reseed cellerne ved en densitet på 1 x 10 4 celler / cm 2 i passende størrelse cellekultur godt eller kolbe.
    8. Der inkuberes ved 37 ° Cmed 5% CO 2, indtil sekundære neurosfærer formular.
  2. Single neurosfære ekspansion
    1. Passage individuelle neurosfærer vælge brønde, der indeholder en enkelt neurosfære og forsigtigt fjerne og kassere cirka 160 ul af vækstmediet fra hver brønd uden at forstyrre neurosfæren.
    2. Der tilsættes 100 ml 0,05% trypsin-EDTA til hver brønd, der skal passeres, og der inkuberes ved stuetemperatur i 3 min.
    3. Tilsæt 100 pi af trypsininhibitor indeholdende DNAseI at standse reaktionen.
    4. Triturer cirka 10 gange op og ned med en P200 pipette til at bryde ud neurosfæren.
    5. Overfør 200 ml indeholdende dissocieret neurosfæren til en ny brønd i en plade med 24 brønde indeholdende 1,5 ml vækstmedium. Der inkuberes ved 37 ° C med 5% CO 2, indtil sekundære neurosfærer formular.
      Bemærk: For at bestemme langsigtet potentiale, en af de kardinale egenskaber af en ægte neurale sTEM-celle, skal neurosfærer passeres i mindst 5-10 passager. Se også litteraturen på delvis kontroversiel fortolkning af disse resultater 12-14.

10.. Differentiering af neurosfære Cultures

Primære eller passeret neurosfærer kan differentieres for at bestemme multipotentiality.

  1. Fjern neurosfærer i suspension fra deres kultur plade eller kolbe og overføre dem til en 10 cm plast petriskål.
  2. Under et dissektionsmikroskop fjerne cirka 15-20 neurosfærer fra mediet ved hjælp af en P20 pipette og overføres til en 24-brønds plade indeholdende dyrkningsmediet uden vækstfaktorer og en PDL / Laminin coated dækglas.
  3. Differentiere til cirka 7 dage ved 37 ° C med 5% CO2.
  4. Vask opdelte neurosfærer med PBS for at fjerne eventuelle døde celler derefter fastgøres med 4% PFA i 20 minutter ved stuetemperatur.
  5. Der udvaskes igen med PBS til rEFlyt eventuelle PFA og gemme dækglas i brønde i 1 ml PBS ved 4 ° C

11.. Immunfarvning af neurosfæren og Adhærente kulturer

Bemærk: farvning med O4 antistoffet udelade Triton fra de blokerende og pletter trin og husk at bruge en passende IgM sekundært antistof.

  1. Inkuber dækglassene indeholdende differentierede neurosfærer eller adhærente monolagskulturer i blokerende opløsning (10% Normal Donkey serum i PBS indeholdende 0,2% Triton X-100) i 60 minutter ved stuetemperatur.
  2. Inkuberes i frisk blokerende opløsning indeholdende primære BIII-tubulin Map2a + b, glial fibrillært surt protein (GFAP) eller O4 antistoffer til 60min ved stuetemperatur.
  3. Vask 3 gange med PBS.
  4. Inkuberes i frisk blokerende opløsning indeholdende passende fluorescens konjugerede sekundære antistoffer og 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 1:5000) i 30 minutter ved stuetemperatur i mørke.
  5. Monter dækglas på objektglas ved hjælp Fluorescensmonteringsmedium og lufttørre i mørke natten over
  6. Se og billedet ved hjælp af en fluorescens mikroskop.

Representative Results

Selv om de to neurogene områder af voksen musehjerne begge indeholder neurale precursorceller kan disse celler opfører sig helt forskelligt, når de dyrkes in vitro. Omliggende monolagskulturer genereret fra begge regioner synes skelnes morfologisk (figur 1A), men de SVZ-afledte adhærente kulturer formere sig hurtigere og skal passeres i gennemsnit 1-2 dage tidligere end dem, der stammer fra generaldirektoratet. Som neurosfærer, også SVZ-afledte prækursorceller formere sig hurtigere og danne større neurosfærer (figur 1b) end GD-afledte prækursorceller (jf. figur 1c). Mens SVZ-afledte neurosfærer typisk talt efter 6-7 dage i kultur er GD-afledte neurosfærer normalt kvantificeres efter 10-12 dage. Derudover et langt større antal af neurale precursorceller bor i SVZ forhold til GD, hvilket fremgår af den næsten 10 gange større antal neurosfærer der kan være slægterTED fra denne region (SVZ: 1.173 ± 74,9 vs GD: 145,3 ± 26,4 p = <0,0001, n = 10 dyr per gruppe, figur 2A).

Undersøgelser har vist, at precursor celler i SVZ og GD reagere på forskellige stimuli. Præcursorcellerne i GD aktiveres ved bestemte typer af rumlige læring og ved stimuli, såsom miljøberigelse og fysisk aktivitet, mens de SVZ præcursorceller aktiveres af olfaktoriske læring og olfaktoriske berigelse. I overensstemmelse med denne, en af os (TLW) tidligere vist, at GD indeholder en population af latent stilk og stamceller, der kan aktiveres ved neural excitation 15-18. I modsætning hertil fandt vi, at de SVZ precursorceller reagerer helt anderledes på denne stimulering med et fald i neurosphære nummer som svar på depolariserende niveauer af KCl 17. Her har vi gentaget dette eksperiment, plating halvdelen af ​​de isolerede celler afledt fra SVZ og GD for INDividual dyr depolariserende niveauer af KCl og den anden halvdel i kontrol KCl niveauer. Vi viser, som tidligere, at mens GD præcursorceller aktiveres ved depolarisering (101,2 ± 17,4 vs 184,8 ± 12,5, p = 0,005, n = 5 dyr), spredning af SVZ-afledte celler er faktisk faldt betydeligt ( 368,0 ± 62,9 vs 266,6 ± 41,6, p = 0,02, n = 5 dyr figur 2B).

For at bekræfte langsigtede potentiale, en af de kardinale funktioner i en sand stamcelle enkelt neurosfærer eller adhærente monolagkulturer skal være i stand til forlænget ekspansion, dvs over mindst 10 passager. Ved hver passage, efter fremstilling af en enkelt cellesuspension, er antallet af celler tælles, og folden ekspansion beregnes. Den teoretiske totale celle beregnes derefter ved at multiplicere fold ekspansion i løbet af denne passage fra den teoretiske totale fra den tidligere passage. Dette er disp lagt som et linjediagram med passagen nummer plottet mod log10 af det teoretiske samlede celleantal (se eksempel figur 3). For at bekræfte multipotentiality kan både monolagskulturer og neurosfærer differentieres ved tilbagetrækning mitogen og påvises at give anledning til både neuroner og glia (Figur 4).

Figur 1
. Figur 1 Voksen mus prækursorceller kan dyrkes som vedhængende monolagskulturer (A) eller som neurosfærer (B: SVZ, C: DG).. Scale bar er 50 mm Klik her for at se større billede.

load/51225/51225fig2highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51225/51225fig2.jpg "/>
Figur 2. Signifikant flere neurosfærer genereres fra SVZ forhold til GD enkelt mus (A). De SVZ og GD præcursorceller reagerer forskelligt på in vitro depolarisering (B).

Figur 3
Fig. 3. For at bekræfte langsigtet potensering er neurosfærer udvidet mere end 10 passager.

Figur 4
Figur 4.. Neurosfærer kan differentieres i BIII-Tubulin + neuroner (A: rød), GFAP + astrocytter (A: grøn), O4 + oligodendrocytter (B: rød) og Map2ab + neuroner (C: rød). Klik her for at se større billede.

Discussion

Denne artikel præsenterer en detaljeret protokol for indledningen af ​​neurale precursor kulturer, både som klæbende monolag og neurosfærer, fra de to store neurogene regioner af den voksne mus hjernen. Der er en række vigtige punkter, der skal holdes for øje, når du forsøger en af disse in vitro dyrkningssystemer. For det første er valget af dissociation metode er meget vigtig og væv afhængig. I vores hænder, 0,05% trypsin-EDTA er meget effektiv til dissociation af SVZ væv, og resulterer i et højere antal neurosfærer end når du bruger en papain-baserede dissociation teknik. For dissociation af GD væv men vi anbefaler et papain-baserede dissociation tilgang. Når direkte sammenligne de to dissociation metoder på GD væv, observerede vi en markant lavere udbytte af levedygtige celler og cirka 10 gange færre neurosfærer ved brug af trypsin. Denne forskel i dissociation kan skyldes forskellen i væv composition mellem de to regioner. Den kompakte væv i GD er omgivet af omfattende neuropil og omfattende skader på cellulære processer kan forekomme under adskillelse.

Et andet vigtigt punkt at bemærke er, at mens neurosfæren analysen kan være nyttigt at gøre de kvantitative udsagn om antallet af prækursor celler til stede i en given vævsprøve, en vis forsigtighed skal dog være ansat i fortolkningen af ​​disse absolutte tal. Fusion af neurosfærer kan være en væsentlig forstyrrende faktor. Adskillige undersøgelser har vist, at neuroner er meget bevægelige og kan smelte selv under hvad er angiveligt 'klonede' betingelser 7,19. Den resulterende neurosfære frekvens kan være meget afhængig af faktorer, herunder mellemstore komponenter, dissektion procedure og dissociation proces. Selv mellem erfarne håndterer en vis variation i antallet af neurosfærer dannet fra angiveligt identiske prøver er tydelig (se figur 1A.) Mere nyttigt, er en direkte sammenligning af forstadiet frekvens mellem to givne prøver (dvs. kontrol vs behandlet eller vildtype vs knock-out) håndteres af den samme person inden for en enkelt eksperiment, snarere end en kvantitativ opgørelse af de samlede precursorcelle nummer.

Når det afgøres, hvilken af ​​de to dyrkningsmetoder er mest velegnet til et bestemt forsøg er det vigtigt at bemærke, at disse to dyrkningssystemer adskiller sig homogenitet celletyper genereret. I sammenligning med prolifererende adhærente cellekulturer, som viser en temmelig homogen precursor cellepool (~ 98% af cellerne er Sox2 +) 20 neurosfærer er mere heterogen og indeholder, samt prolifererende precursorceller, differentierede neuroner og astrocytter 21,22. Det er vigtigt, neurosfærerne ikke dyrkes i længere perioder mellem passager som større neurosfæren bliver mere sandsynligt er det at finde differentierede celletyper i deres kerne.

Vi traditionelt indlede vedhængende monolags neurale precursor kulturer fra GD væv på mellem 5-8 mus. Derfor, når du forsøger at etablere omliggende monolagskulturer fra GD eller SVZ af en enkelt mus, behov, den yderste forsigtighed, der skal tages i løbet af vævet dissociation procedure for at undgå overdreven celledød forårsaget af over triturering af vævet, eller tage forlænget perioder mellem dissektion og endelige dyrkning trin. Denne protokol beskriver for første gang, den generation af vedhængende monolag precursor kulturer fra både SVZ og GD af de enkelte dyr. Der er mange tilfælde, hvor sammenligningen af ​​forstadie proliferation og differentiering skal gøres på et enkelt dyr basis. Disse omfatter evnen til direkte at sammenligne GD og SVZ af de enkelte dyr ved hjælp af parrede statistikker og til at parre kultur data med individuelle adfærdsmæssige eller fysiologiske data 9. Enkelte kulturer dyr også allav brug af sjældne transgene dyr, hvor alder matcher en pulje af 5-8 donorer pr kulturen ikke er muligt, samt unikke dyr (fx F2 krydser eller ud opdrættet dyr) til genetisk forening undersøgelser.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at afsløre.

Acknowledgments

TLW blev støttet af et Marie Curie International Incoming Fellowship. Dette arbejde blev også finansieret af grundlæggende institutionel finansiering, Bundesministerium für Bildung og Forschung (BMBF) finansiering og dels med støtte fra Priority Research Program (SFB) 655 til GK. Forfatterne vil gerne takke Anne Karasinsky til pleje og vedligeholdelse af alle anvendt i denne undersøgelse dyr og Odette Leiter, Susann Ruhwald, Fanny Boehme, og Richard Wetzel for celle kultur og mikroskopi assistance.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Poly-D-lysine Sigma P7280-5MG
Laminin Roche 11243217001
Glass Pastuer pipettes Volac BS5732
DMEM:F12 (1:1) 1x Life Technologies 21331-020
Neural Basal Medium (1x) Life Technologies 21103-049
B27 supplements (50x) Life Technologies 17504-044
GlutaMAX Life Technologies 35050-038
Heparin Sigma H3393
Penacillin/Streptomycin Life Technologies 15140-122
EGF PeproTech AF-100-15
bFGF PeproTech 100-18B
0.05% Trypsin-EDTA Life Technologies 25300-054
Trypsin inhibitor Sigma T6522
DNaseI Roche 10104159001
Accutase PAA L11-007
Papain Worthington LS003120
Dispase Life Technologies 17105-041
Percoll GE Healthcare 17-0891-02
HBSS (with Calcium and Magnesium) Life Technologies 14025-050
Glucose Roth X997.2
HEPES Sigma H3375-500G
NaHCO3 Merck K39347429847
1 ml Syringes  Braun 2016-10
27 G Needles Braun 4657705
Scalpels (#22 disposable) Braun BA222
Dumont #7 forceps FST 11271-30
Dumont 5/45 forceps FST 11251-35
Scissors FST 14060-10
Iris spatula FST 10093-13
70% Ethanol
PBS Life Technologies 14040-091
flasks/well plates TPP 92696
PFA (4%) Sigma P6148
Hemocytometer Marienfeld 650010
Trypan blue (0.4%) Sigma T8154
NDS Millipore 530
TritonX-100 Sigma T9284
Mouse monoclonal bIII-tubulin antibody Promega G712A
Rabbit polyclonal glial fibrillary acidic protein antibody Dako 20334
O4  R&D Systems MAB1326
Map2a+b Sigma M1406
Donkey anti-mouse Cy3 antibody  Jackson ImmunoResearch 715-505-151
Donkey anti-rabbit Alexa488  Dianova 711-545-152
4,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI)  Invitrogen 861405
Aqua Polymount Polysciences Inc 18606
10 ml Combi tips Eppendorf 30089677
Plastic 10 ml and 25 ml serological pipettes Corning 4488/4489
EQUIPMENT
Pipetboy Integra Biosciences 521942
Multidoser pipette Eppendorf
37 °C waterbath
Dissecting microscope
37 °C:5% CO2 incubator
Centrifuge Eppendorf 5810R

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
  2. Reynolds, B. A., Weiss, S. Clonal and population analyses demonstrate that an EGF-responsive mammalian embryonic CNS precursor is a stem cell. Dev. Biol. 175, 1-13 (1996).
  3. Palmer, T. D., Ray, J., Gage, F. H. FGF-2-responsive neuronal progenitors reside in proliferative and quiescent regions of the adult rodent brain. Mol. Cell. Neurosci. 6, 474-486 (1995).
  4. Ray, J., Raymon, H. K., Gage, F. H. Generation and culturing of precursor cells and neuroblasts from embryonic and adult central nervous system. Methods Enzymol. 254, 20-37 (1995).
  5. Bez, A., et al. Neurosphere and neurosphere-forming cells: morphological and ultrastructural characterization. Brain Res. 993, 18-29 (2003).
  6. Babu, H., Cheung, G., Kettenmann, H., Palmer, T. D., Kempermann, G. Enriched monolayer precursor cell cultures from micro-dissected adult mouse dentate gyrus yield functional granule cell-like neurons. PLoS One. 2, (2007).
  7. Jessberger, S., Clemenson, G. D., Gage, F. H. Spontaneous fusion and nonclonal growth of adult neural stem cells. Stem Cells. 25, 871-874 (2007).
  8. Reynolds, B. A., Tetzlaff, W., Weiss, S. A multipotent EGF-responsive striatal embryonic progenitor cell produces neurons and astrocytes. J. Neurosci. 12, 4565-4574 (1992).
  9. Freund, J., et al. Emergence of individuality in genetically identical mice. Science. 340, 756-759 (2013).
  10. Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay. J. Vis. Exp. (2010).
  11. Hagihara, H., Toyama, K., Yamasaki, N., Miyakawa, T. Dissection of hippocampal dentate gyrus from adult mouse. J. Vis. Exp. (2009).
  12. Jensen, J. B., Parmar, M. Strengths and limitations of the neurosphere culture system. Mol. Neurobiol. 34, 153-161 (2006).
  13. Pastrana, E., Silva-Vargas, V., Doetsch, F. Eyes wide open: a critical review of sphere-formation as an assay for stem cells. Cell. Stem Cell. 8, 486-498 (2011).
  14. Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres- re-evaluating the relationship. Nat. Methods. 2, 333-336 (2005).
  15. Walker, T. L., Turnbull, G. W., Mackay, E. W., Hannan, A. J., Bartlett, P. F. The latent stem cell population is retained in the hippocampus of transgenic Huntington's disease mice but not wild-type mice. PLoS One. 6, (2011).
  16. Walker, T. L., et al. Prolactin stimulates precursor cells in the adult mouse hippocampus. PLoS One. 7, (2012).
  17. Walker, T. L., et al. Latent stem and progenitor cells in the hippocampus are activated by neural excitation. J. Neurosci. 28, 5240-5247 (2008).
  18. Walker, T. L., et al. Prominin-1 allows prospective isolation of neural stem cells from the adult murine hippocampus. J. Neurosci. 33, (2013).
  19. Singec, I., et al. Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology. Nat. Methods. 3, 801-806 (2006).
  20. Babu, H., et al. A protocol for isolation and enriched monolayer cultivation of neural precursor cells from mouse dentate gyrus. Front. Neurosci. 5, 89 (2011).
  21. Parmar, M., Sjoberg, A., Bjorklund, A., Kokaia, Z. Phenotypic and molecular identity of cells in the adult subventricular zone in vivo and after expansion in vitro. Mol. Cell Neurosci. 24, 741-752 (2003).
  22. Suslov, O. N., Kukekov, V. G., Ignatova, T. N., Steindler, D. A. Neural stem cell heterogeneity demonstrated by molecular phenotyping of clonal neurospheres. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 14506-14511 (2002).

Erratum

Formal Correction: Erratum: One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice
Posted by JoVE Editors on 11/26/2014. Citeable Link.

A correction was made to One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice. Many micro symbols were changed into milli symbols by accident: In the Protocols, sections 1.1, 1.3, 3.6, 3.7, 6.2, 6.6, 8.1, 9.1.6, 9.2.2, and 9.2.5 need to be fixed, as does Figure 1 description in the Results section.

Protocol section 1.1 was changed from:

At least two days prior to commencing the experiment, prepare Poly-D-lysine (PDL)/Laminin coated plates for adherent monolayer cultures. To prepare wells/flasks add enough PDL (10 mg/ml in dH2O) to coat the surface and incubate overnight at room temperature. Remove the solution from the dish and wash the dish three times with dH2O. Allow to air dry. Add Laminin (5 mg/ml in cold DMEM:F12) and incubate at 37 °C overnight. Remove the Laminin and either use the plates immediately or store with the Laminin at -20 °C until required.

to:

At least two days prior to commencing the experiment, prepare Poly-D-lysine (PDL)/Laminin coated plates for adherent monolayer cultures. To prepare wells/flasks add enough PDL (10 µg/ml in dH2O) to coat the surface and incubate overnight at room temperature. Remove the solution from the dish and wash the dish three times with dH2O. Allow to air dry. Add Laminin (5 µg/ml in cold DMEM:F12) and incubate at 37 °C overnight. Remove the Laminin and either use the plates immediately or store with the Laminin at -20 °C until required.

Protocol section 1.3 was changed from:

On the day of dissection, prepare the appropriate amount of culture medium by mixing Neural Basal Medium with 2% B27, 1x GlutaMAX, 2 µg/ml heparin, 50 units/ml Penicillin/Streptomycin, 20 ng/ml purified mouse receptor-grade epidermal growth factor (EGF), and 20 ng/ml recombinant bovine fibroblast growth factor (FGF-2). Warm the culture medium to 37 °C in a water bath.

to:

On the day of dissection, prepare the appropriate amount of culture medium by mixing Neural Basal Medium with 2% B27, 1x GlutaMAX, 2 mg/ml heparin, 50 units/ml Penicillin/Streptomycin, 20 ng/ml purified mouse receptor-grade epidermal growth factor (EGF), and 20 ng/ml recombinant bovine fibroblast growth factor (FGF-2). Warm the culture medium to 37 °C in a water bath.

Protocol section 3.6 was changed from:

Add growth medium to a total volume of 5 ml and pass the cell suspension through a 40 mm sieve to remove debris and undissociated tissue clumps.

to:

Add growth medium to a total volume of 5 ml and pass the cell suspension through a 40 µm sieve to remove debris and undissociated tissue clumps.

Protocol section 3.7 was changed from:

Centrifuge at 300 x g for 5 min, discard the supernatant and resuspend the resulting pellet in 200 ml growth medium.

to:

Centrifuge at 300 x g for 5 min, discard the supernatant and resuspend the resulting pellet in 200 µl growth medium.

Protocol section 6.2 was changed from:

Add 50 ml Accutase and incubate at 37 °C for 2-3 min (checking to see if the cells are rounded and detached).

to:

Add 50 µl Accutase and incubate at 37 °C for 2-3 min (checking to see if the cells are rounded and detached).

Protocol section 6.6 was changed from:

For subsequent passages, resuspend cells in 200 ml growth medium and count using a hemocytometer. Plate at 1 x 104 cells/cm2 in the appropriate sized coated well or flask.

to:

For subsequent passages, resuspend cells in 200 µl growth medium and count using a hemocytometer. Plate at 1 x 104 cells/cm2 in the appropriate sized coated well or flask.

Protocol section 8.1 was changed from:

Dilute the dissociated SVZ or DG tissue from one animal in 20 ml of culture medium and plate 200 ml/well across a 96-well plate using a 10 ml multidoser pipette.

to:

Dilute the dissociated SVZ or DG tissue from one animal in 20 ml of culture medium and plate 200 µl/well across a 96-well plate using a 10 ml multidoser pipette.

Protocol section 9.1.6 was changed from:

Remove 10 ml of the cell suspension and mix with an equal volume of trypan blue and perform a live cell count using a hemocytometer.

to:

Remove 10 µl of the cell suspension and mix with an equal volume of trypan blue and perform a live cell count using a hemocytometer.

Protocol section 9.2.2 was changed from:

Add 100 ml of 0.05% Trypsin-EDTA to each well to be passaged and incubate at room temperature for 3 min.

to:

Add 100 µl of 0.05% Trypsin-EDTA to each well to be passaged and incubate at room temperature for 3 min.

Protocol section 9.2.5 was changed from:

Transfer the 200 ml containing the dissociated neurosphere to a new well of a 24-well plate containing 1.5 ml of growth medium. Incubate at 37 °C with 5% CO2 until secondary neurospheres form.

to:

Transfer the 200 µl containing the dissociated neurosphere to a new well of a 24-well plate containing 1.5 ml of growth medium. Incubate at 37 °C with 5% CO2 until secondary neurospheres form.

Figure 1 description was updated from:

Figure 1. Adult mouse precursor cells can be cultured as adherent monolayer cultures (A) or as neurospheres (B: SVZ, C: DG). Scale bar is 50 mm.

to:

Figure 1. Adult mouse precursor cells can be cultured as adherent monolayer cultures (A) or as neurospheres (B: SVZ, C: DG). Scale bar is 50 µm.

En mus, to kulturer: isolering og dyrkning af voksne neurale stamceller fra Two Neurogene zoner Individuel Mus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Walker, T. L., Kempermann, G. One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice. J. Vis. Exp. (84), e51225, doi:10.3791/51225 (2014).More

Walker, T. L., Kempermann, G. One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice. J. Vis. Exp. (84), e51225, doi:10.3791/51225 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter