Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Neuroscience

עכבר אחד, שתי תרבויות: בידוד והתרבות של תאי גזע עצביים למבוגרים משני האזורים העצביים של עכברים בודדים

doi: 10.3791/51225 Published: February 25, 2014

ERRATUM NOTICE

Summary

כאן אנו מתארים פרוטוקול מפורט לדור בו זמני של תרביות תאים עצביות מבשר, כמו גם monolayers או neurospheres חסיד, מאזור subventricular וgyrus משוננת של עכברים בוגרים בודדים.

Abstract

מערכת תרבות monolayer חסיד assay וneurosphere הם כלים רבי ערך כדי לקבוע את הפוטנציאל (התפשטות או בידול) של תאי גזע עצביים למבוגרים במבחנה. מבחני אלה יכולים לשמש כדי להשוות את פוטנציאל המבשר של תאים מבודדים מבעלי חיים שונים או טופלו באופן דיפרנציאלי גנטי כדי לקבוע את ההשפעות של גורמים חיצוניים על התפשטות תאים עצביים מבשר ובידול ולייצר שורות תאים עצביות מבשר כי ניתן assayed על מעברים רציפים. Assay neurosphere משמש באופן מסורתי לזיהוי פוסט הוק של תאי גזע, בעיקר בשל חוסר סמנים מוחלטים שבה הם יכולים להיות מבודדים מהרקמה העיקרית ויש לו היתרון הגדול של מתן הערכה מהירה של מספרים סלולריים מבשר ברקמת המוח מקורם בבעלי החיים בודדים. תרבויות monolayer חסיד, בניגוד לכך, לא באופן מסורתי משמשות להשוואת התפשטות בין בעלי חיים הבודדים, כמו כל תרבות היא בדרך כלל יזמה מן הרקמה בשילוב של בין 5-8 בעלי חיים. עם זאת, יש להם היתרון הגדול, שבניגוד neurospheres, הם מורכבים מאוכלוסייה בעיקר הומוגנית של תאים מבשר ושימושיים לבאים בתהליך ההתמיינות בתאים בודדים. כאן, אנו מתארים, בפירוט, את הדור של תרבויות neurosphere ו, בפעם הראשונה, תרבויות חסיד מבעלי חיים בודדים. יש לכך השלכות חשובות רבות, כולל ניתוח לזווג של הפצה ו / או פוטנציאל בידול בשני אזור subventricular (SVZ) ורכס משוננת (DG) של קווי עכבר שטופלו או שונים מבחינה גנטית, כמו גם הפחתה משמעותית בשימוש בבעלי חיים.

Introduction

Assay neurosphere 1,2 ותרבות חסיד monolayer 3,4, שניהם פותחו בתחילת 1990, עדיין יישארו סטנדרטי במבחני תא גזע עצביים מבחנה הזהב. במבחנים אלה, רקמה העיקרית היא מיקרו גזור מאזור במוח בפרט, ניתק לתוך השעיה תא בודדת ותרבית בנוכחות של גורם הגדילה באפידרמיס mitogens (EGF) וגידול פיברובלסטים גורם-2 (FGF2) ליצירת או חופשי צף אשכולות (neurospheres) או monolayers חסיד. שני המערכות יש מספר היתרונות וחסרונות ושיקול הדעת צריך להינתן לשאלה זו היא לטפל לפני אחד או המערכת אחרת נבחרה.

Neurospheres מאפשרת קריאה מתוך פשוטה של ​​הבדלים במספר תאי מבשר ופוטנציאלי. בנוסף, neurospheres הן גם כלי שימושי כדי ללמוד מפרט פנימי של התאים, כאשר הוסר מן הסביבה החיצונית הרגילה שלהם. Extrinניתן ללמוד רמזים כך במקור פשוט על ידי הוספת הגורם של עניין למדיום הגידול וכימות המספר והגודל של neurospheres שנוצרה. החסרון העיקרי של neurospheres לעומת זאת, הוא שהם יוצרים נישה משלהם, עם התאים במרכזו של neurospheres (neurospheres הגדולה במיוחד) להיות יותר מובחן מאלה על פני השטח 5. Neurospheres מכילה תערובת של תאי גזע, תאי אב מחויבים, ותאים מובחנים ותאי תאי אינטראקציות בתוך neurospheres לנטרל את התחזוקה של תאי הגזע. זו הסיבה neurospheres להכיל רק מספר קטן של תאי גזע אמיתיים 6-8.

תרבויות monolayer חסיד גם לספק מערכת במבחנה טובה למודל בהתפשטות vivo. תרבויות חסיד, שבו התאים נשארים יותר מבודדים והומוגנית, יכולות לחסל את הטבע הטרוגנית של neurosphere. בתנאים אלה צמיחת התאים המבשר להתרבות rapiהאלקי וכמעט כל תאי החלוקה ולהביע סמנים העצביים המבשר האופייניים Nestin, Sox2, וBLBP. החסרון העיקרי של מערכת תרבות monolayer לעומת assay neurosphere הוא ששיבוטים המופק מבשר אדם אינם מסוגלים להיות במעקב וכימות.

חסרון של רוב הפרוטוקולים עבור שני הסוגים של תרבויות היה ההכרח להשתמש במספרים גדולים יחסית של בעלי חיים, משום שהתשואה של אסטרטגיות הבידוד כבר לעתים קרובות עניות. באותו הזמן, זה הפך להיות ברור כי neurogenesis למבוגרים תורמים לindividualization של המוח 9, וכתוצאה מכך, כמו גם בצורך במודלים לשעבר אישית vivo. ניתן לספק צורכים אלה על ידי פרוטוקולים "אחד עכבר אחד תרבות" כפי שתוארו בדוח זה.

הפרוטוקול החזותי הבא מתאר את הדור בו זמני של תרבויות עצביות מבשר משני SVZ וDG של בעלי חיים בודדים או מ 'חסיד כonolayers או כneurospheres. הדור של תרבויות מבעלי החיים בודדים הוא שימושי במיוחד בעת השוואה בין בעלי חיים שטופלו בנפרד או מהונדס בודד שונים או wild-type עכברים נדרשות. פרוטוקול זה כולל הוראות מפורטות לmicrodissection בו זמנית של אזורי SVZ וDG מעכברים בוגרים, הניתוק שלהם לתוך השעיה תא בודדת, בתרבות במבחנה, כמו גם תרבויות חסיד monolayer או neurospheres וניתוח של multipotentiality ופוטנציאל לטווח ארוך, שני קרדינל מאפיינים של תאי גזע בתום עצם.

Protocol

1. התקנה והכנת בינוני התרבות בסיסית

  1. לפחות יומיים לפני תחילת הניסוי, להכין פולי-D-ליזין (PDL) / Laminin מצופה צלחות לתרבויות monolayer חסיד. כדי להכין בארות / צלוחיות להוסיף מספיק PDL (10 מ"ג / מיליליטר ב DH 2 O) למעיילות את פני השטח ודגירת הלילה בטמפרטורת חדר. הסר את הפתרון מהצלחת ולשטוף את הצלחת שלוש פעמים עם DH 2 O. לאפשר לאוויר יבש. הוספת Laminin (5 מ"ג / מיליליטר בDMEM הקר: F12) ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך לילה. הסר את Laminin וגם להשתמש בצלחות מייד או לאחסן בLaminin ב-20 ° C עד צורך.
  2. הכן טפטפות המלוטשת אש עם "בינוני" ומשעממים "קטן" על ידי החלפת טפטפות פסטר זכוכית בלהבה עד הקצוות להיות מעוגלים. החיטוי לעקר.
  3. ביום הנתיחה, להכין את הכמות המתאימה של מדיום תרבות על ידי ערבוב עצבי בסל בינוני עם 2% B27, 1x Glutamax, 2 מ"ג / מיליליטר הפרין, 50 יחידות / מיליליטר פניצילין / סטרפטומיצין, 20 ng / גורם מיליליטר מטוהר צמיחת אפידרמיס כיתה קולטן עכבר (EGF), ו20 ng / מיליליטר גורם רקומביננטי צמיחת פיברובלסטים שור (FGF-2). לחמם את מדיום תרבות 37 מעלות צלזיוס באמבט מים.
  4. לניתוק SVZ, להכין 0.05% טריפסין-EDTA ו0.125 מ"ג / מיליליטר טריפסין מעכב המכיל 0.01 מ"ג / מיליליטר DNaseI. לאזן את הפתרונים הללו ל37 ° C.
  5. הגדר את המיקרוסקופ לנתיחה ולהכין את הכלים הדרושים כדי להסיר את המוח (מספריים ומרית קטנה) ולSVZ וניתוחי DG (אזמל, 27 G מחט מחוברת למזרק 1 מיליליטר, # 1 x 7 מלקחיים, # x 1 5/45 מלקחיים) על ידי שריה ב70% אתנול.

2. קציר של מוח עכבר למבוגרים וMicrodissections SVZ / DG

  1. הרדימי מבוגר יחיד עכברים (8 שבועות בן) על פי ההנחיות מוסדיות המתאימות. בצע נקע בצוואר הרחם.
  2. לרסס את הראש עם 70% אתנול ללחטא את האזור ולצמצם את כמות הפרווה שdheres למספריים והמוח. באמצעות מספריים חדים לערוף את בעלי החיים בבסיס של גזע המוח.
  3. מחזיק את הראש בבסיס הגולגולת, לחתוך את הגולגולת בין שתי נורות חוש הריח על ידי הנחת להב אחד מספריים קטנים לתוך כל חלל העין וחיתוך coronally. בשלב הבא, לעשות שני חתכים לרוחב בבסיס הגולגולת, ואחריו חתך אורכי דרך הגולגולת לאורך תפר sagittal זהירות:. להבטיח את הזווית של המספריים היא רדודה ככל האפשר כדי למנוע נזק למוח הבסיסי.
  4. לחשוף את המוח על ידי לקלף את הגולגולת עם או הלהב של המספריים או זוג מלקחיים מעוקלים. לשחרר את המוח מהגולגולת בעזרת מרית קטנה ומקום לPBS הקר.
  5. יש לשטוף את המוח עם PBS להסיר דם ופרווה.
  6. העבר את המוח בצלחת פטרי 10 פלסטיק סנטימטר המכילה PBS
  7. מניחים צלחת פטרי המכילה את המוח תחת מיקרוסקופ לנתח בהגדלה נמוכה ולמקם את brain על פני השטח הגחון שלה. באמצעות מלקחיים מעוקלים בסדר להסיר את נורות חוש הריח בזמן שמחזיק את המוח במצב על ידי המוח הקטן.
  8. סובב את המוח על ההיבט הגבי ובאמצעות אזמל לעשות חתך העטרה דרך המוח ברמה של תצלובת הראייה
  9. לmicrodissect SVZ (לקבלת הוראות מפורטות יותר, ראה גם אזרי ואח'. 10), הנח את החלק מקורי של המוח, כך שעל פני השטח העטרה לחתוך פונה כלפי מעלה ולמקד את המיקרוסקופ על ההגדלה גבוהה יותר. להסיר ולסלק את המחיצה באמצעות מלקחיים מעוקלים בסדר.
  10. לנתח את SVZ (השכבה דקה של רקמה המקיפה את החדר) על ידי הצבת קצה להב אחד של זוג מלקחיים מעוקלים בסדר בפינה הצדדית של החדר לרוחב באופן מיידי מתחת לכפיס מוח והאחר כ 1 מ"מ לתוך הרקמה באופן מיידי בצמוד לחדר. לחץ כלפי מטה את המלקחיים לכיוון הבסיס של המנה וכלפי היבט הגחון של ventricle להסיר פיסה משולשת קטנה של רקמה. הנח את SVZ גזור לתוך צלחת פטרי על קרח.
  11. לmicrodissect DG (לקבלת הוראות מפורטות יותר, ראה גם Hagihara et al. 11), הנח את חלק הזנב של המוח בצלחת פטרי ולחתוך לאורך סדק אורכי באמצעות אזמל.
  12. תחת מיקרוסקופ לנתיחה, להסיר את המוח הקטן וdiencephalon באמצעות מלקחיים.
  13. ולמקד את המיקרוסקופ, כך שהגבולות סביב DG כעת נראים לעין. כדי להסיר הרכס משוננת, הכנס את קצה מחט 27 G ושקופיות לאורך הגבול בין DG והקרן של עמון. שימוש במלקחיים בסדר, לשחרר את DG מהרקמה הסובבת.

3. דיסוציאציה רקמות SVZ

  1. לרכך את הרקמה באמצעות להב סכין מנתחים לכ 1 דק 'עד שלא יישארו חתיכות גדולות.
  2. העברת הרקמה הטחון לצינור 15 מיליליטר באמצעות 1 מיליליטר של 0.05% prewarmed טריפסין-EDTA ו דגירה במשך 7 דקות באמבט מים מוגדר 37 ° C.
  3. כדי לעצור את התגובה האנזימטית, להוסיף 1 מיליליטר של מעכבי טריפסין המכילים DNaseI ומערבבים את התוכן על ידי מצליף את הצינור.
  4. גלולה ההשעיה על ידי צנטריפוגה XG 300 5 דקות וזורקים supernatant
  5. Resuspend גלולה ב 1 מיליליטר של מדיום גידול ולנתק בעדינות על ידי pipetting למעלה ולמטה כ 7-10x באמצעות פיפטה P1000 זהירות:. מעל triturating יכול להוביל למוות של תאים גדלו ויהיה להשפיע לרעה על צמיחת תאים שלאחר מכן.
  6. הוסף בינוני צמיחה להיקף כולל של 5 מ"ל ולהעביר את ההשעיה התא דרך מסננת 40 מ"מ כדי להסיר שאריות וגושי רקמת undissociated.
  7. צנטריפוגה XG 300 5 דקות, לבטל את supernatant ו resuspend את הכדור וכתוצאה מכך 200 בינוני מיליליטר צמיחה.

4. דיסוציאציה רקמות DG

  1. לרכך את הרקמה באמצעות להב סכין מנתחים לכ 1 דק 'עד שלא יישארו חתיכות גדולות והעברהלתערובת אנזים PDD prewarmed (פפאין 2.5 U / ml, Dispase U / ml 1, DNaseI 250 U / ml). דגירה עבור 20 דקות על 37 מעלות צלזיוס, ערבוב על ידי צינור היפוך כל דקות 3-5.
  2. לנתק את הרקמה באופן מכאני באמצעות משעמם בינוני, אש מלוטשת, פיפטה פסטר על ידי pipetting למעלה ולמטה בעדינות 10x.
  3. דגירה נוספת 10 דקות על 37 מעלות צלזיוס, ערבוב על ידי צינור היפוך כל דקות 3-5.
  4. בהמשך לנתק את הרקמה באופן מכאני באמצעות שעם קטן, אש מלוטשת פיפטה פסטר על ידי pipetting למעלה ולמטה בעדינות 10x.
  5. צנטריפוגה ב XG 130 למשך 5 דקות.
  6. הסר את supernatant ו resuspend את הכדור בפתרון חיץ מיליליטר 1 (1x HBSS, 30 מ"מ גלוקוז, 2 HEPES מ"מ (pH 7.4), 26 מ"מ NaHCO 3). הפוך עד 10 מיליליטר עם פתרון חיץ.
  7. צנטריפוגה ב XG 130 למשך 5 דקות.
  8. הסר supernatant ו resuspend את הכדור ב 5 מיליליטר של 20% Percoll. (כדי להכין 90% Percoll, להוסיף 4.5 מיליליטר של 100% Percoll ל0.5 מיליליטר של 10x PBS אז לדלל עוד יותר זה ל20% על ידי הוספת 1.1 מיליליטר 90% Percoll ל3.9 מיליליטר 1x PBS).
  9. צנטריפוגה 450 XG במשך 15 דקות.
  10. הסר את supernatant ו resuspend את הכדור ב 10 חיץ מיליליטר.
  11. צנטריפוגה ב XG 130 למשך 5 דקות.
  12. Resuspend את הכדור ב200 מדיום גידול μl.

5. דור של תרבויות חסיד חד שכבתי

  1. פלייט SVZ הניתק או רקמות DG לPDL / Laminin אחת מצופה גם צלחת 96 היטב ולדגור על 37 ° C עם 5% CO 2.
  2. כ 24 שעות לאחר ציפוי, ברגע שהתאים יש דבק למשטח המצופה, להחליף את מדיום הגידול כדי להסיר את עודפי פסולת נוסף.
  3. כל 3-4 ימים שלאחר מכן, מחצית חליפין של מדיום הגידול במדיום חדש כדי לחדש את גורמי הגדילה.
  4. חזור על פעולה עד שהתאים מגיעים confluency כ 80% והם מוכנים להיות passaged הערה:. הזמן בין ציפוי והקטע הראשון יכול לקחת עד 2-3 שבועות.

class = "jove_title"> 6. Passaging של תרבויות חסיד חד שכבתי

  1. כאשר התרבויות להגיע confluency כ 80% להסיר את המדיום מהבאר ולשטוף עם PBS.
    שים לב: אין לאפשר לתאים יעלו confluency 90% כמו זה יכול להוביל לניתוק של תאים והיווצרות neurosphere ובנוסף, רמות גבוהות של מוות של תאים.
  2. הוסף 50 מיליליטר Accutase ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 2-3 דקות (לבדוק אם התאים מעוגלים ומנותקים).
  3. הסר את תאי צינור 15 מ"ל ולשטוף היטב פעם עם PBS ולהעביר לאותו צינור.
  4. לדלל תאים עד 5 מיליליטר עם PBS ו צנטריפוגות XG 300 למשך 5 דקות.
  5. למעבר הראשון, לדלל תאים למיליליטר 1 וצלחת לתוך PDL / Laminin המצופה היטב של צלחת גם 24.
  6. לקטעים שלאחר מכן, תאי resuspend ב 200 מיליליטר מדיום גידול וספירה באמצעות hemocytometer. צלחת ב 1 x 10 4 תאים / 2 סנטימטר ובגודל המתאים מצופה או בקבוק. i>

7. בידול של תרבויות חסיד חד שכבתי

  1. כדי לבדל תרבויות monolayer חסיד, תאי צלחת מתרבות על coverslips המצופה PDL / Laminin בצפיפות של 1 x 10 4 תאים / 2 סנטימטר במדיום גידול המכיל 20 ng / ml EGF ו10 bFGF ng / ml.
  2. כאשר התאים מגיעים confluency כ 80% (בדרך כלל 2 ימים), החלף את מדיום הגידול במדיום המכיל bFGF 5 ng / ml ו0 ng / ml EGF.
  3. בעקבות 2 ימים ב5 ng / ml bFGF, להחליף את המדיום עם מדיום גידול בהיעדרם של שתי mitogens לעוד 3 ימים הערה:. בתקופה זו כמות משמעותית של מוות של תאים תתרחש.
  4. לאחר סך של 5 ימים, לשטוף את התאים מובחנים עם PBS להסיר את כל תאים מתים ואז לתקן עם paraformaldehyde 4% (PFA) עבור 20 דקות בטמפרטורת חדר.
  5. שטוף שוב עם PBS להסיר כל coverslips PFA והחנות בבארות ב1 מיליליטר PBS ב 4 ° C.
jove_title "> 8. neurosphere תרבות וכימות

  1. לדלל את SVZ הניתק או רקמות DG מחיה אחת ב20 מיליליטר של מדיום התרבות וצלחת 200 מיליליטר / היטב על פני צלחת 96 היטב באמצעות פיפטה multidoser 10 מיליליטר.
  2. לדגור על 37 ° C עם 5% CO 2 למשך 6-7 ימים לneurospheres נגזרת SVZ ו10-12 ימים לneurospheres נגזרה-DG.
    הערה: צמיחה למשך זמן ארוך יותר מאשר פעמים דגירה המומלצת אלה תגרום לצמיחת יתר ותביא למותם של תאים במרכז neurospheres ו / או, הקובץ המצורף והתמיינות ספונטניים.
  3. לספור ולמדוד את הקוטר של neurospheres באמצעות מצויד למיקרוסקופ אור הזקופה graticule עינית

9. Passaging neurospheres

לאחר neurospheres העיקרית נספרו והגודל שלהם נרשם שהם יכולים להיות מורחבים על פני כמה קטעים מתחילים עם או neurosphere בודד או תרבות בתפזורת.

  1. הרחבת neurosphere התרבות גורפת
    1. לneurospheres שילוב מעבר כתרבות בתפזורת, הסר את המדיום המכיל neurospheres מהצלחת, להעביר לצינור 15 מיליליטר ו צנטריפוגות ב XG 300 למשך 5 דקות.
    2. בטל supernatant ו resuspend neurospheres ב 1 מיליליטר של 0.05% prewarmed טריפסין-EDTA ו דגירה בטמפרטורת חדר למשך 3 דקות.
    3. הוסף נפח שווה של מעכבי טריפסין המכילים DNaseI ומערבבים היטב.
    4. צנטריפוגה במשך 5 דקות ב300 XG, להסיר את supernatant ולהוסיף 1 מיליליטר של מדיום גידול.
    5. Triturate למעלה ולמטה כ 10x עם טפטפת P1000 לנתק neurospheres.
    6. הסר 10 מיליליטר של ההשעיה התא ומערבבים עם נפח שווה של trypan כחול ולבצע ספירת תאים חי באמצעות hemocytometer.
    7. לזרוע תאים בצפיפות של 1 x 10 4 תאים / 2 סנטימטר בתרבות המתאימה בגודל התא טוב או בקבוק.
    8. דגירה על 37 מעלות צלזיוסעם 5% CO 2 עד טופס neurospheres המשנית.
  2. הרחבת neurosphere יחידה
    1. למעבר neurospheres פרט לבחור בארות המכילות neurosphere אחד ולהסיר בזהירות וזורקים כ 160 μl של מדיום גידול מכל אחד גם מבלי להפריע neurosphere.
    2. הוספה של 0.05% טריפסין-EDTA 100 מיליליטר לכל טוב שיש passaged ו דגירה בטמפרטורת חדר למשך 3 דקות.
    3. הוספה של טריפסין 100 μl מעכב המכיל DNAseI כדי לעצור את התגובה.
    4. Triturate כ 10 פעמים למעלה ולמטה עם טפטפת P200 להתפרק neurosphere.
    5. העבר מיליליטר 200 מכיל neurosphere ניתק לבאר חדשה של צלחת 24 גם מכילה 1.5 מיליליטר של מדיום גידול. לדגור על 37 ° C עם 5% CO 2 עד טופס neurospheres המשנית.
      הערה: כדי לקבוע את פוטנציאל לטווח ארוך, אחד המאפיינים העיקריים של ים עצבי אמיתיתא TEM, neurospheres יש passaged לפחות 5-10 מעברים. ראה גם הספרות העוסק בפרשנות השנויה במחלוקת של חלק בתוצאות כאלה 12-14.

10. בידול של תרבויות neurosphere

יכולה להיות מובחנת neurospheres הראשונית או passaged לקבוע multipotentiality.

  1. הסר neurospheres בהשעיה מצלחת התרבות או הבקבוק שלהם ולהעביר אותם לצלחת פטרי 10 פלסטיק סנטימטר.
  2. תחת מיקרוסקופ לנתיחה להסיר כ 15-20 neurospheres מהמדיום באמצעות פיפטה P20 ולהעביר לצלחת 24 גם מכילה את מדיום התרבות ללא גורמי גדילה וcoverslip מצופה PDL / Laminin.
  3. להבדיל לכ 7 ימים ב37 ° C עם 5% CO 2.
  4. שטוף את neurospheres הבדיל עם PBS להסיר את כל תאים מתים ואז לתקן עם PFA 4% עבור 20 דקות בטמפרטורת חדר.
  5. שטוף שוב עם PBS לrסר כל coverslips PFA והחנות בבארות ב1 מיליליטר PBS ב 4 ° C

11. Immunostaining של neurosphere ותרבויות חסיד

הערה: לצביעה עם נוגדן O4 להשמיט את טריטון מצעדי החסימה וצביעה וזכור להשתמש בשני נוגדנים IgM מתאימים.

  1. דגירה coverslips מכיל neurospheres הבדיל או תרבויות monolayer חסיד בחסימת פתרון (10% דונקי סרום רגיל בPBS המכיל 0.2% טריטון X-100) ל60 דקות בטמפרטורת חדר.
  2. דגירה בפתרון חסימה טרי המכיל bIII-טובולין הראשוני, Map2a + b, חלבון גליה fibrillary חומצי (GFAP) או נוגדני O4 ל60min בטמפרטורת חדר.
  3. לשטוף 3x עם PBS.
  4. דגירה בפתרון חסימה טרי המכיל נוגדנים מתאימים הקרינה מצומדות משניים ו4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI; 1:5,000) ל30 דקות בטמפרטורת חדר בחושך.
  5. הר coverslips על גבי שקופיות מיקרוסקופ באמצעות יבש בינונית ואוויר הרכבה הקרינה בלילה החשוך
  6. צפה בתמונה ובאמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

Representative Results

למרות ששני האזורים העצביים של מוח העכבר המבוגר שניהם מכילים תאים עצביים מבשר, תאים אלה יכולים להתנהג בצורה שונה לגמרי כאשר בתרבית במבחנה. תרבויות monolayer חסיד שנוצרו משני האזורים מופיעות מורפולוגית נבדלה (איור 1 א), לעומת זאת, התרבויות חסיד נגזרות SVZ מתרבות מהר יותר וצריכים להיות passaged, בממוצע, 1-2 ימים מוקדם יותר מאלה הנגזרים מDG. כneurospheres, התאים המבשר נגזרים SVZ גם מתרבים מהר יותר וליצור neurospheres הגדולה יותר (איור 1 ב ') מאשר תאי שמקורם-DG מבשר (תרשים 1C). בעוד neurospheres נגזרת SVZ נספרות בדרך כלל אחרי 6-7 ימים בתרבות, neurospheres נגזרה-DG בדרך כלל לכמת אחרי 10-12 ימים. בנוסף, מספר גדול בהרבה של תאים עצביים מבשר מתגורר בSVZ לעומת DG, כפי שמעיד מספר כמעט פי 10 גדולים יותר של neurospheres שיכול להיות סוגיםטד מאזור זה (SVZ: 1,173 ± 74.9 לעומת DG: 145.3 ± 26.4, p = <0.0001, n = 10 חיות לכל קבוצה; איור 2 א).

מחקרים הראו כי התאים המבשר בתוך SVZ וDG להגיב לגירויים שונים. התאים המבשר בDG מופעלים על ידי סוגים מסוימים של למידה מרחבית ועל ידי גירויים כגון העשרה סביבתית ופעילות גופנית, ואילו התאים המבשר SVZ מופעלים על ידי למידת חוש הריח והעשרת חוש הריח. עולה בקנה אחד עם זה, אחד מאיתנו (TLW) הוכיח בעבר כי DG מכיל אוכלוסייה של גזע רדום ובתאים שיכולים להיות מופעל על ידי עירור עצבי 15-18. בניגוד לכך, מצאנו כי התאים המבשר SVZ להגיב בצורה שונה לגמרי לגירוי זה, עם ירידה במספר neurosphere בתגובה לdepolarizing רמות של KCl 17. הנה, יש לנו חזרנו על הניסוי, ציפוי מחצית מהתאים המבודדים הנגזרים מSVZ וDG של individual בעלי חיים בdepolarizing רמות של KCl ואת החצי השני ברמות KCl שליטה. אנו מדגימים, כמו בעבר, שבזמן שהתאים המבשר DG מופעלים על ידי שלילת קוטביות (101.2 ± 17.4 לעומת 184.8 ± 12.5, p = 0.005, n = 5 בעלי חיים), ההתפשטות של התאים שמקורם-SVZ היא למעשה ירד משמעותי ( 368.0 ± 62.9 לעומת 266.6 ± 41.6, p = 0.02, n = 5 בעלי חיים; איור 2).

כדי לאשר את הפוטנציאל לטווח ארוך, אחד המאפיינים העיקריים של תאי גזע אמיתיים, neurospheres בודדת או תרבויות monolayer חסיד חייב להיות מסוגל התרחבות מורחבת כלומר מעל לפחות 10 מעברים. בכל מעבר, בעקבות הכנת השעיה תא בודד, מספר התאים נספר וההתרחבות של פי מחושבת. בסך הכל התא התיאורטי מחושב לאחר מכן על ידי הכפלה של פי ההתרחבות במהלך מעבר שעל ידי סך הכל התיאורטי מהמעבר הקודם. זה חד פעמי layed כגרף קו עם מספר המעבר זמם נגד log10 בסך הכל מספר התא התיאורטי (ראה דוגמא איור 3). כדי לאשר multipotentiality, יכולים להיות מובחנת שתי תרבויות monolayer וneurospheres ידי נסיגת mitogen ויוצגו ללהצמיח שני נוירונים, וגליה (איור 4).

איור 1
יכולים להיות מתורבת איור 1 תאים מבשר עכבר מבוגרים כתרבויות monolayer חסיד (א) או כneurospheres (B: SVZ, C: DG)... בר סולם הוא 50 מ"מ לחצו כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

"Src =" load/51225/51225fig2highres.jpg / files/ftp_upload/51225/51225fig2.jpg "/>
איור 2. באופן משמעותי יותר neurospheres נוצרת מSVZ לעומת DG של עכברים בודדים (א '). התאים המבשר SVZ וDG מגיבים באופן שונה לשלילת קוטביות במבחנה (ב ').

איור 3
איור 3. כדי לאשר הגברה לטווח ארוך, neurospheres מורחבת במשך 10 מעברים.

איור 4
איור 4. יכולה להיות מובחנת neurospheres לbIII-tubuנוירונים לין + (: אדום), GFAP האסטרוציטים + (: ירוק), O4 + oligodendrocytes (B: אדום) וMap2ab + נוירונים (C: אדום). לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

Discussion

מאמר זה מציג פרוטוקול מפורט לחניכה של תרבויות עצביות מבשר, שני monolayers וneurospheres חסיד כ, משני האזורים העצביים המרכזיים במוח העכבר המבוגר. ישנן מספר נקודות חשובות שיש לזכור בעת שניסו אחת במבחנת מערכות תרבות אלה. ראשית, הבחירה של שיטת דיסוציאציה היא מאוד חשובה והיא רקמה תלויה. בידיים שלנו, 0.05% טריפסין-EDTA הוא יעילים מאוד לניתוק של רקמת SVZ, ותוצאות במספר גבוה יותר של neurospheres מאשר בעת שימוש בטכניקת ניתוק המבוסס על פפאין. לניתוק של רקמת DG עם זאת, אנו ממליצים בחום גישת דיסוציאציה מבוסס פפאין. כאשר השוואה ישירה בין שתי שיטות ניתוק על רקמת DG, שצפינו תשואה נמוכה יותר באופן משמעותי של תאי קיימא וכ פי 10 פחות neurospheres בעת השימוש בטריפסין. הבדל בניתוק זה יכול להיות בגלל ההבדל בcompositio הרקמהn בין שני האזורים. הרקמה הקומפקטית של DG מוקף neuropil הנרחבת ונזק נרחב של תהליכים תאיים יכול להתרחש במהלך דיסוציאציה.

נקודה חשובה שנייה שיש לשים לב, כי בעוד assay neurosphere יכול להיות שימושי כדי להפוך את ההצהרות כמוני על מספר התאים המבשר נוכחים בדגימת רקמה נתון, קצת זהירות חייבת, עם זאת, להיות מועסקות בפרשנות של מספרים מוחלטים אלה. היתוך של neurospheres יכול להיות גורם בלבול גדול. מספר מחקרים הראו כי תאי עצב הם ניעתי מאוד ויכולים להתמזג, גם במה שהם לכאורה תנאים 'משובטים' 7,19. תדירות neurosphere כתוצאה מכך יכולה להיות מאוד תלויה בגורמים שונים, לרבות רכיבים בינוניים, הליך הנתיחה ואת תהליך הניתוק. אפילו בין מטפלים המנוסים איזו וריאציה במספר neurospheres שנוצרה מדגימות כביכול זהות באה לידי ביטוי (ראה איור 1 א.) יותר שימושי, היא השוואה ישירה של התדירות המבשרת בין שתי דגימות נתון (כלומר לעומת ביקורת שטופל או wild-type לעומת עקום החוצה) יטופלו על ידי אותו האדם בניסוי אחד, ולא הצהרה כמותית בסך הכל תא מבשר מספר.

כאשר מחליט איזו משתי שיטות התרבות הוא מתאים ביותר לניסוי מסוים זה חשוב לציין כי שתי מערכות התרבות אלה שונים בהומוגניות של סוגי התאים שנוצרו. בהשוואה למתרבה תרבויות חסיד תא, אשר מראות בריכה די הומוגנית תא מבשר (~ 98% מתאים הם Sox2 +) 20, neurospheres הן הטרוגנית יותר ומכילה, כמו גם תאים מתרבים מבשר, הנוירונים מובחנים, והאסטרוציטים 21,22. חשובה שneurospheres אינה בתרבית למשך תקופות ממושכות בין קטעים כגדולים neurosphere הפך סביר יותר הוא למצוא סוגי תאים מובחנים בליבה שלהם.

אנחנו באופן מסורתי ליזום תרבויות חסיד monolayer עצביות מבשר מרקמת DG של בין 5-8 עכברים. לכן, כאשר מנסים להקים את תרבויות monolayer חסיד מDG או SVZ של עכבר אחת, בזהירות רבה צריכה להילקח במהלך הליך ניתוק רקמות על מנת למנוע מוות של תאים מוגזמים נגרמים על ידי מעל triturating של הרקמות, או לקחת מורחבת פרקי זמן בין הנתיחה וצעדי culturing סופיים. פרוטוקול זה מתאר, בפעם הראשונה, את הדור של תרבויות המבשרת monolayer חסיד משני SVZ וDG של בעלי חיים בודדים. ישנם מקרים רבים שבם ההשוואה של התפשטות מבשר והבחנה צריכה להיעשות על בסיס חיה אחת. אלה כוללים את היכולת להשוות ישירות DG וSVZ של בעלי חיים בודדים באמצעות סטטיסטיקה לזווג ולשייך נתונים תרבות עם נתונים התנהגותיים או פיסיולוגיים פרט 9. תרבויות חיה אחת גם אלנמוך השימוש בבעלי חיים מהונדסים נדירים, שבו בריכה של 5-8 תורמים לתרבות התאמה בגיל זה אינו אפשרי, כמו גם בעלי חיים ייחודיים (למשל צלבי F2 או בעלי חיים מתוך גידלו) למחקרי קשר גנטי.

Disclosures

יש המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

TLW נתמכה על ידי מארי קירי בינלאומית נכנסת מלגה. עבודה זו גם תמומן ממימון מוסדי בסיסי, Bundesministerium פרווה מימון Bildung וForschung (BMBF) ובחלקו בתמיכה עדיפות תכנית המחקר (SFB) 655 לGK. המחברים מבקשים להודות לאנה Karasinsky לטיפול ותחזוקה של כל בעלי החיים המשמשים במחקר זה ואודט לייטר, סוזן Ruhwald, פאני בוהם, וריצ'רד וצל לתרבית תאים וסיוע מיקרוסקופ.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Poly-D-lysine Sigma P7280-5MG
Laminin Roche 11243217001
Glass Pastuer pipettes Volac BS5732
DMEM:F12 (1:1) 1x Life Technologies 21331-020
Neural Basal Medium (1x) Life Technologies 21103-049
B27 supplements (50x) Life Technologies 17504-044
GlutaMAX Life Technologies 35050-038
Heparin Sigma H3393
Penacillin/Streptomycin Life Technologies 15140-122
EGF PeproTech AF-100-15
bFGF PeproTech 100-18B
0.05% Trypsin-EDTA Life Technologies 25300-054
Trypsin inhibitor Sigma T6522
DNaseI Roche 10104159001
Accutase PAA L11-007
Papain Worthington LS003120
Dispase Life Technologies 17105-041
Percoll GE Healthcare 17-0891-02
HBSS (with Calcium and Magnesium) Life Technologies 14025-050
Glucose Roth X997.2
HEPES Sigma H3375-500G
NaHCO3 Merck K39347429847
1 ml Syringes  Braun 2016-10
27 G Needles Braun 4657705
Scalpels (#22 disposable) Braun BA222
Dumont #7 forceps FST 11271-30
Dumont 5/45 forceps FST 11251-35
Scissors FST 14060-10
Iris spatula FST 10093-13
70% Ethanol
PBS Life Technologies 14040-091
flasks/well plates TPP 92696
PFA (4%) Sigma P6148
Hemocytometer Marienfeld 650010
Trypan blue (0.4%) Sigma T8154
NDS Millipore 530
TritonX-100 Sigma T9284
Mouse monoclonal bIII-tubulin antibody Promega G712A
Rabbit polyclonal glial fibrillary acidic protein antibody Dako 20334
O4  R&D Systems MAB1326
Map2a+b Sigma M1406
Donkey anti-mouse Cy3 antibody  Jackson ImmunoResearch 715-505-151
Donkey anti-rabbit Alexa488  Dianova 711-545-152
4,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI)  Invitrogen 861405
Aqua Polymount Polysciences Inc 18606
10 ml Combi tips Eppendorf 30089677
Plastic 10 ml and 25 ml serological pipettes Corning 4488/4489
EQUIPMENT
Pipetboy Integra Biosciences 521942
Multidoser pipette Eppendorf
37 °C waterbath
Dissecting microscope
37 °C:5% CO2 incubator
Centrifuge Eppendorf 5810R

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
  2. Reynolds, B. A., Weiss, S. Clonal and population analyses demonstrate that an EGF-responsive mammalian embryonic CNS precursor is a stem cell. Dev. Biol. 175, 1-13 (1996).
  3. Palmer, T. D., Ray, J., Gage, F. H. FGF-2-responsive neuronal progenitors reside in proliferative and quiescent regions of the adult rodent brain. Mol. Cell. Neurosci. 6, 474-486 (1995).
  4. Ray, J., Raymon, H. K., Gage, F. H. Generation and culturing of precursor cells and neuroblasts from embryonic and adult central nervous system. Methods Enzymol. 254, 20-37 (1995).
  5. Bez, A., et al. Neurosphere and neurosphere-forming cells: morphological and ultrastructural characterization. Brain Res. 993, 18-29 (2003).
  6. Babu, H., Cheung, G., Kettenmann, H., Palmer, T. D., Kempermann, G. Enriched monolayer precursor cell cultures from micro-dissected adult mouse dentate gyrus yield functional granule cell-like neurons. PLoS One. 2, (2007).
  7. Jessberger, S., Clemenson, G. D., Gage, F. H. Spontaneous fusion and nonclonal growth of adult neural stem cells. Stem Cells. 25, 871-874 (2007).
  8. Reynolds, B. A., Tetzlaff, W., Weiss, S. A multipotent EGF-responsive striatal embryonic progenitor cell produces neurons and astrocytes. J. Neurosci. 12, 4565-4574 (1992).
  9. Freund, J., et al. Emergence of individuality in genetically identical mice. Science. 340, 756-759 (2013).
  10. Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay. J. Vis. Exp. (2010).
  11. Hagihara, H., Toyama, K., Yamasaki, N., Miyakawa, T. Dissection of hippocampal dentate gyrus from adult mouse. J. Vis. Exp. (2009).
  12. Jensen, J. B., Parmar, M. Strengths and limitations of the neurosphere culture system. Mol. Neurobiol. 34, 153-161 (2006).
  13. Pastrana, E., Silva-Vargas, V., Doetsch, F. Eyes wide open: a critical review of sphere-formation as an assay for stem cells. Cell. Stem Cell. 8, 486-498 (2011).
  14. Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres- re-evaluating the relationship. Nat. Methods. 2, 333-336 (2005).
  15. Walker, T. L., Turnbull, G. W., Mackay, E. W., Hannan, A. J., Bartlett, P. F. The latent stem cell population is retained in the hippocampus of transgenic Huntington's disease mice but not wild-type mice. PLoS One. 6, (2011).
  16. Walker, T. L., et al. Prolactin stimulates precursor cells in the adult mouse hippocampus. PLoS One. 7, (2012).
  17. Walker, T. L., et al. Latent stem and progenitor cells in the hippocampus are activated by neural excitation. J. Neurosci. 28, 5240-5247 (2008).
  18. Walker, T. L., et al. Prominin-1 allows prospective isolation of neural stem cells from the adult murine hippocampus. J. Neurosci. 33, (2013).
  19. Singec, I., et al. Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology. Nat. Methods. 3, 801-806 (2006).
  20. Babu, H., et al. A protocol for isolation and enriched monolayer cultivation of neural precursor cells from mouse dentate gyrus. Front. Neurosci. 5, 89 (2011).
  21. Parmar, M., Sjoberg, A., Bjorklund, A., Kokaia, Z. Phenotypic and molecular identity of cells in the adult subventricular zone in vivo and after expansion in vitro. Mol. Cell Neurosci. 24, 741-752 (2003).
  22. Suslov, O. N., Kukekov, V. G., Ignatova, T. N., Steindler, D. A. Neural stem cell heterogeneity demonstrated by molecular phenotyping of clonal neurospheres. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 14506-14511 (2002).

Erratum

Formal Correction: Erratum: One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice
Posted by JoVE Editors on 11/26/2014. Citeable Link.

A correction was made to One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice. Many micro symbols were changed into milli symbols by accident: In the Protocols, sections 1.1, 1.3, 3.6, 3.7, 6.2, 6.6, 8.1, 9.1.6, 9.2.2, and 9.2.5 need to be fixed, as does Figure 1 description in the Results section.

Protocol section 1.1 was changed from:

At least two days prior to commencing the experiment, prepare Poly-D-lysine (PDL)/Laminin coated plates for adherent monolayer cultures. To prepare wells/flasks add enough PDL (10 mg/ml in dH2O) to coat the surface and incubate overnight at room temperature. Remove the solution from the dish and wash the dish three times with dH2O. Allow to air dry. Add Laminin (5 mg/ml in cold DMEM:F12) and incubate at 37 °C overnight. Remove the Laminin and either use the plates immediately or store with the Laminin at -20 °C until required.

to:

At least two days prior to commencing the experiment, prepare Poly-D-lysine (PDL)/Laminin coated plates for adherent monolayer cultures. To prepare wells/flasks add enough PDL (10 µg/ml in dH2O) to coat the surface and incubate overnight at room temperature. Remove the solution from the dish and wash the dish three times with dH2O. Allow to air dry. Add Laminin (5 µg/ml in cold DMEM:F12) and incubate at 37 °C overnight. Remove the Laminin and either use the plates immediately or store with the Laminin at -20 °C until required.

Protocol section 1.3 was changed from:

On the day of dissection, prepare the appropriate amount of culture medium by mixing Neural Basal Medium with 2% B27, 1x GlutaMAX, 2 µg/ml heparin, 50 units/ml Penicillin/Streptomycin, 20 ng/ml purified mouse receptor-grade epidermal growth factor (EGF), and 20 ng/ml recombinant bovine fibroblast growth factor (FGF-2). Warm the culture medium to 37 °C in a water bath.

to:

On the day of dissection, prepare the appropriate amount of culture medium by mixing Neural Basal Medium with 2% B27, 1x GlutaMAX, 2 mg/ml heparin, 50 units/ml Penicillin/Streptomycin, 20 ng/ml purified mouse receptor-grade epidermal growth factor (EGF), and 20 ng/ml recombinant bovine fibroblast growth factor (FGF-2). Warm the culture medium to 37 °C in a water bath.

Protocol section 3.6 was changed from:

Add growth medium to a total volume of 5 ml and pass the cell suspension through a 40 mm sieve to remove debris and undissociated tissue clumps.

to:

Add growth medium to a total volume of 5 ml and pass the cell suspension through a 40 µm sieve to remove debris and undissociated tissue clumps.

Protocol section 3.7 was changed from:

Centrifuge at 300 x g for 5 min, discard the supernatant and resuspend the resulting pellet in 200 ml growth medium.

to:

Centrifuge at 300 x g for 5 min, discard the supernatant and resuspend the resulting pellet in 200 µl growth medium.

Protocol section 6.2 was changed from:

Add 50 ml Accutase and incubate at 37 °C for 2-3 min (checking to see if the cells are rounded and detached).

to:

Add 50 µl Accutase and incubate at 37 °C for 2-3 min (checking to see if the cells are rounded and detached).

Protocol section 6.6 was changed from:

For subsequent passages, resuspend cells in 200 ml growth medium and count using a hemocytometer. Plate at 1 x 104 cells/cm2 in the appropriate sized coated well or flask.

to:

For subsequent passages, resuspend cells in 200 µl growth medium and count using a hemocytometer. Plate at 1 x 104 cells/cm2 in the appropriate sized coated well or flask.

Protocol section 8.1 was changed from:

Dilute the dissociated SVZ or DG tissue from one animal in 20 ml of culture medium and plate 200 ml/well across a 96-well plate using a 10 ml multidoser pipette.

to:

Dilute the dissociated SVZ or DG tissue from one animal in 20 ml of culture medium and plate 200 µl/well across a 96-well plate using a 10 ml multidoser pipette.

Protocol section 9.1.6 was changed from:

Remove 10 ml of the cell suspension and mix with an equal volume of trypan blue and perform a live cell count using a hemocytometer.

to:

Remove 10 µl of the cell suspension and mix with an equal volume of trypan blue and perform a live cell count using a hemocytometer.

Protocol section 9.2.2 was changed from:

Add 100 ml of 0.05% Trypsin-EDTA to each well to be passaged and incubate at room temperature for 3 min.

to:

Add 100 µl of 0.05% Trypsin-EDTA to each well to be passaged and incubate at room temperature for 3 min.

Protocol section 9.2.5 was changed from:

Transfer the 200 ml containing the dissociated neurosphere to a new well of a 24-well plate containing 1.5 ml of growth medium. Incubate at 37 °C with 5% CO2 until secondary neurospheres form.

to:

Transfer the 200 µl containing the dissociated neurosphere to a new well of a 24-well plate containing 1.5 ml of growth medium. Incubate at 37 °C with 5% CO2 until secondary neurospheres form.

Figure 1 description was updated from:

Figure 1. Adult mouse precursor cells can be cultured as adherent monolayer cultures (A) or as neurospheres (B: SVZ, C: DG). Scale bar is 50 mm.

to:

Figure 1. Adult mouse precursor cells can be cultured as adherent monolayer cultures (A) or as neurospheres (B: SVZ, C: DG). Scale bar is 50 µm.

עכבר אחד, שתי תרבויות: בידוד והתרבות של תאי גזע עצביים למבוגרים משני האזורים העצביים של עכברים בודדים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Walker, T. L., Kempermann, G. One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice. J. Vis. Exp. (84), e51225, doi:10.3791/51225 (2014).More

Walker, T. L., Kempermann, G. One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice. J. Vis. Exp. (84), e51225, doi:10.3791/51225 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter