Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Neuroscience

En mus, to kulturer: Isolation and Culture of Adult nevrale stamceller fra de to nevrogene Soner Individuell Mus

doi: 10.3791/51225 Published: February 25, 2014

ERRATUM NOTICE

Summary

Her beskriver vi en detaljert protokoll for samtidig generering av nevrale forløper cellekulturer, som enten heft monolayers eller neurospheres, fra subventricular sone og dentate gyrus av individuelle voksne mus.

Abstract

Den neurosphere analysen og tilhenger monolayer kultur system er verdifulle verktøy for å fastslå potensialet (spredning eller differensiering) av voksne nevrale stamceller in vitro. Disse analyser kan anvendes for å sammenligne den forløper potensialet av celler isolert fra genetisk forskjellige eller differensielt behandlede dyr for å bestemme virkningene av eksogene faktorer på neural forløper celleproliferasjon og differensiering, og for å generere nevrale forløper cellelinjer som kan bli analysert i løpet kontinuerlige passasjer. Den neurosphere assay er tradisjonelt brukt for den post-hoc-Identifikasjon av stamceller, hovedsakelig på grunn av mangel på definitiv markører som de kan bli isolert fra primær vev og har den store fordelen av å gi en rask estimat av forløper celle tall i hjernevev avledet fra enkeltdyr. Heft ettlagskulturer, i kontrast, er ikke tradisjonelt brukt for å sammenligne spredning mellom enkeltdyr, Som hver kultur blir generelt initiert fra den kombinerte vev av mellom 5-8 dyr. Men de har den store fordel at, i motsetning til neurospheres, består de av en hovedsakelig homogen populasjon av forløper-celler, og er anvendbare for å følge differensieringsprosessen i enkeltceller. Her beskriver vi i detalj, generering av neurosphere kulturer og, for første gang, heft kulturer fra enkeltdyr. Dette har mange viktige implikasjoner herunder sammenkoblet analyse av proliferasjon og / eller differensiering potensial i begge subventricular sone (SVZ) og dentate gyrus (DG) av behandlede eller genetisk forskjellige mus linjer, så vel som en signifikant reduksjon i bruken dyret.

Introduction

Den neurosphere analysen 1,2 og tilhenger monokultur 3,4, begge utviklet tidlig på 1990-tallet, fortsatt gullstandarden i vitro nevrale stamceller analyser. I slike analyser, blir primær vevet mikro dissekert fra et bestemt område i hjernen, dissosiert til en enkelt cellesuspensjon og dyrket i nærvær av mitogener epidermal vekstfaktor (EGF), og fibroblast vekstfaktor-2 (FGF2) for å danne enten frittflytende klynger (neurospheres) eller tilhenger monolayers. Begge systemene har en rekke fordeler og ulemper, og nøye vurdering bør tas hensyn til spørsmålet som skal tas opp før det ene eller det annet system som er valgt.

Neurospheres tillate en enkel avlesing av forskjeller i forløper cellenummer og potensial. I tillegg neurospheres er også et nyttig verktøy for å studere iboende spesifikasjon av cellene når det fjernes fra sin normale ytre miljø. Extrinsic signaler kan studeres ved å legge den faktor av interesse for vekstmedium og kvantifisere antallet og størrelsen på neurospheres generert. Den store ulempen med neurospheres er imidlertid at de danner sin egen nisje, med cellene i sentrum av de neurospheres (særlig store neurospheres) blir mer differensiert enn de på overflaten 5. Neurospheres inneholde en blanding av stamceller, begått stamfedre, og differensierte celler og celle-celle interaksjoner innenfor neurospheres motvirke vedlikehold av stamceller. Dette er grunnen til at neurospheres inneholde bare et lite antall av sanne stamceller 6-8.

Adherente monolagskulturer også gi en god in vitro-system for å modellere in vivo spredning. Adherente kulturer, der cellene forblir mer isolert og homogen, kan eliminere den heterogene natur av neurosphere. Under disse vekstforholdene de forløper celler sprer rapidly og nesten alle celler deler seg og uttrykke de karakteristiske nevrale forløper markører Nestin, Sox2, og BLBP. Den store ulempen med monolag-dyrknings-systemet i forhold til den neurosphere analysen er at individuelle forløper-avledede kloner som er i stand til å bli overvåket og kvantifisert.

En ulempe ved de fleste protokoller for begge typer av kulturene har vært nødvendigheten av å bruke forholdsvis store antall av dyr, fordi utbyttet av isolasjons strategiene har ofte vært dårlig. På samme tid er det blitt klart at voksen neurogenesis bidrar til individualisering av hjernen 9, som resulterer i behovet for individuell ex vivo-modeller i tillegg. Disse behovene kan bli møtt av "one-mus-ett-kultur" protokoller som er beskrevet i denne rapporten.

Følgende visuell protokollen beskriver den samtidige generasjon av nevrale forløper kulturer fra både SVZ og DG av individuelle dyr enten som tilhenger monolayers eller som neurospheres. Generering av kulturer fra individuelle dyr som er spesielt nyttig når sammenligninger mellom individuelt behandlede dyr eller en rekke individuelle transgene eller villtype-mus er nødvendig. Denne protokollen inneholder detaljerte instruksjoner for samtidig microdissection av SVZ og DG regioner fra voksne mus, deres dissosiasjon inn i en enkelt celle suspensjon, in vitro kultur som enten heft ettlagskulturer eller neurospheres og analyse av multipotentiality og langsiktig potensial, de to kardinal egenskapene for en ben fide stamcelle.

Protocol

En. Grunnleggende oppsett og klargjøring av Kultur Medium

  1. Minst to dager før du starter eksperimentet, forberede Poly-D-lysin (PDL) / Laminin belagte plater for heft ettlagskulturer. For å forberede brønner / kolber legger nok PDL (10 mg / ml i dH 2 O) for å belegge overflaten og inkuber over natten ved romtemperatur. Fjern løsningen fra fatet og vaske fatet tre ganger med dH 2 O. La det lufttørke. Legg Laminin (5 mg / ml i kaldt DMEM: F12) og inkuberes ved 37 ° C over natten. Fjern Laminin og enten bruke platene umiddelbart eller lagres med Laminin ved -20 ° C inntil behov.
  2. Forbered brann polert pipetter med "middels" og "små" boringer ved å rotere glass Pasteur pipetter i en flamme til kantene blir avrundet. Autoklav å sterilisere.
  3. På dagen for disseksjon, forberede riktig mengde kulturmedium ved å blande Neural Basal Medium med 2% B27, 1x Glutamax, 2 mg / ml heparin, 50 enheter / ml penicillin / streptomycin, 20 ng / ml renset mus-reseptor-grade epidermal vekstfaktor (EGF), og 20 ng / ml rekombinant bovin fibroblast vekstfaktor (FGF-2). Varm kulturmediet til 37 ° C i et vannbad.
  4. For SVZ dissosiasjon, forberede 0,05% Trypsin-EDTA og 0,125 mg / ml trypsin-inhibitor inneholdende 0,01 mg / ml DNaseI. Stabil disse løsningene til 37 ° C.
  5. Sett opp en disseksjon mikroskop og forberede de verktøyene som trengs for å fjerne hjernen (saks og liten slikkepott) og for SVZ og DG disseksjoner (skalpell, 27 G nål festet til en ml sprøyte, 1 x # 7 tang, en x # 5/45 tang) ved soaking i 70% etanol.

2. Høsting av voksne musen Brains og SVZ / DG Microdissections

  1. Anesthetize enslig voksen (8 uker gamle) mus i henhold til de aktuelle institusjonelle retningslinjer. Utfør halshugging.
  2. Spray hodet med 70% etanol for å sterilisere området, og for å minimere mengden av pels som enDheres til saksen og hjernen. Ved hjelp av skarp saks decapitate dyret ved foten av hjernestammen.
  3. Å holde hodet i bunnen av skallen, kuttet skallen mellom de to olfactory pærene ved å plassere en kniv med en liten saks i hvert øye hulrom og kutte coronally. Deretter gjør to laterale kutt i bunnen av skallen, etterfulgt av et langsgående kutt gjennom skallen langs sagittal suturen Forsiktig:. Sikrer vinkelen saksen er så grunt som mulig for å unngå å skade den underliggende hjerne.
  4. Expose hjernen ved å dra vekk skallen med enten bladet av saks eller et par buede tang. Fri hjernen fra hodeskallen ved hjelp av en liten slikkepott og sted inn i kald PBS.
  5. Skyll hjerner med PBS for å fjerne blod og pels.
  6. Overfør hjernen til en 10 cm plast petriskål inneholder PBS
  7. Plasser petriskål inneholder hjernen under en dissekere mikroskop ved lav forstørrelse og plassere brain på sin ventral overflaten. Bruke fin buet tang fjerne olfactory pærer mens du holder hjernen på plass av lillehjernen.
  8. Roter hjernen på dorsal aspekt, og ved hjelp av en skalpell foreta en koronale snitt gjennom hjernen ved nivået for den optiske chiasm
  9. Å microdissect den SVZ (for mer detaljerte instruksjoner, se også Azari et al. 10), plasserer rostral delen av hjernen slik at kuttet koronale overflaten vender oppover og fokusere mikroskopet på en høyere forstørrelse. Fjern og kast septum hjelp av gode buede tang.
  10. Dissekere SVZ (det tynne laget av vevet rundt ventrikkel) ved å plassere spissen av et blad av et par av fine buet pinsettangens i lateral hjørne av den laterale ventrikkel umiddelbart under corpus callosum og de andre lag 1 mm inn i vevet umiddelbart tilstøtende til ventrikkelen. Trykk nedover tang mot bunnen av fatet, og mot den ventrale del av ventricle for å fjerne en liten trekantet stykke vev. Plasser dissekert SVZ inn i en petriskål på is.
  11. Å microdissect DG (for mer detaljerte instruksjoner, se også Hagihara et al. 11), plasserer hale delen av hjernen i petriskål og skjær langs den langsgående sprekken ved hjelp av en skalpell.
  12. Under en disseksjon mikroskop, fjern cerebellum og diencephalon med tang.
  13. Refokusere mikroskopet slik at grensene rundt DG er nå synlig. For å fjerne den dentate gyrus, sette spissen på en 27 G nål og skyv langs grensen mellom DG og Ammons horn. Ved hjelp av de fine tang, fri DG fra omkringliggende vev.

Tre. SVZ Tissue Dissosiasjon

  1. Finhakk vev ved hjelp av en skalpell blad for ca 1 min til det ikke store biter forbli.
  2. Overfør hakket vev til en 15 ml tube bruker en ml prewarmed 0,05% Trypsin-EDTA og inkuberes i 7 min ien vannbad innstilt til 37 ° C.
  3. For å stoppe den enzymatiske reaksjonen, tilsett 1 ml trypsin inhibitor inneholder DNaseI og blande innholdet ved å dra røret.
  4. Pellet suspensjonen ved sentrifugering ved 300 xg i 5 minutter og kast supernatant
  5. Resuspender pellet i 1 ml av vekstmedium og distansere ved forsiktig pipettering opp og ned ca 7-10x ved hjelp av en P1000 pipette Forsiktig:. Løpet triturating kan føre til økt celledød, og vil ha en negativ innvirkning på påfølgende cellevekst.
  6. Legg vekstmedium til et totalt volum på 5 ml, og cellesuspensjonen passerer gjennom en 40 mm sikt for å fjerne rusk og undissociated vev klumper.
  7. Sentrifuger ved 300 xg i 5 minutter, kaste supernatanten og resuspender den resulterende pelleten i 200 ml dyrkningsmedium.

4. DG Tissue Dissosiasjon

  1. Finhakk vev ved hjelp av en skalpell blad for ca 1 min til det ikke store biter forbli og overføringinn forvarmet PDD enzymet Papain blanding (2,5 U / ml, dispase 1 U / ml, DNaseI 250 U / ml). Inkuber i 20 min ved 37 ° C, blandes ved å snu røret hver 3 til 5 min.
  2. Distansere vevet mekanisk med en middels kjedelig, brann polert, Pasteur pipette ved pipettering opp og ned forsiktig 10x.
  3. Inkuber i ytterligere 10 min ved 37 ° C, blandes ved å snu røret hver 3 til 5 min.
  4. Videre distansere vevet mekanisk med en liten diameter, polert brann Pasteur pipette ved pipettering opp og ned forsiktig 10x.
  5. Sentrifuger ved 130 x g i 5 min.
  6. Fjern supernatanten og resuspender pelleten i 1 ml bufferoppløsning (1 x HBSS, 30 mM glukose, 2 mM HEPES (pH 7,4), 26 mM NaHCO3). Fyll opp til 10 ml med buffer-oppløsning.
  7. Sentrifuger ved 130 x g i 5 min.
  8. Fjern supernatant og resuspender pelleten i 5 ml 20% Percoll. (For å fremstille 90% Percoll, tilsett 4,5 ml av 100% Percoll til 0,5 ml av 10x PBS og deretter ytterligere fortynnes til 20%ved å legge 1,1 ml 90% Percoll til 3,9 ml 1x PBS).
  9. Sentrifuger 450 xg i 15 min.
  10. Fjern supernatanten og resuspender pelleten i 10 ml buffer.
  11. Sentrifuger ved 130 x g i 5 min.
  12. Resuspender pelleten i 200 pl vekstmedium.

5. Generering av Heft ettlagskulturer

  1. Plate den dissosierte SVZ eller DG vevet inn i en enkelt PDL / Laminin belagt brønn av en 96-brønns plate og inkuberes ved 37 ° C med 5% CO2.
  2. Omtrent 24 timer etter plating, når cellene er festet til den belagte overflaten, utveksle vekstmedium for å fjerne overskudd av avfall videre.
  3. Hver etterfølgende 3-4 dager, utveksling halvdel av vekstmediet med friskt medium for å supplere de vekstfaktorer.
  4. Gjenta til cellene når ca 80% konfluens og er klar til å bli passaged Obs. Tiden mellom platekledning og den første passasjen kan ta opptil 2-3 uker.
  1. Når kulturene når omtrent 80% konfluens fjernes mediet fra brønnen og vaskes med PBS.
    Merk: Du må ikke la cellene til å overstige 90% confluency da dette kan føre til avløsning av celler og neurosphere dannelse og i tillegg økte nivåer av celledød.
  2. Legg 50 ml Accutase og inkuberes ved 37 ° C i 2-3 min (sjekke for å se om cellene er avrundet og frittliggende).
  3. Fjern cellene til et 15 ml rør og vaskes godt en gang med PBS og overfør til samme rør.
  4. Fortynn cellene til 5 ml med PBS og sentrifugen 300 xg i 5 min.
  5. For det første passasje, fortynn cellene til 1 ml og porsjon til en PDL / Laminin belagt brønn av en 24 brønns plate.
  6. For påfølgende steg, resuspender celler i 200 ml vekstmedium og telle ved hjelp av en hemocytometer. Plate ved 1 x 10 4 celler / cm 2 i passende størrelse belagte brønn eller kolbe. i>

7. Differensiering av Heft ettlagskulturer

  1. For å skille de adherente monolagskulturer, plate prolifererende celler på PDL / laminin belagte dekkglass i en tetthet på 1 x 10 4 celler / cm 2 i dyrkningsmedium inneholdende 20 ng / ml EGF og 10 ng / ml bFGF.
  2. Når cellene når omtrent 80% konfluens (vanligvis 2 dager), erstatte dyrkningsmedium med mediet inneholdende 5 ng / ml bFGF og 0 ng / ml EGF.
  3. Etter 2 dager i 5 ng / ml bFGF, erstatte mediet med vekstmedium i fravær av både mitogener i ytterligere 3 dager. Merk: I denne perioden en betydelig mengde av celledød vil oppstå.
  4. Etter totalt 5 dager, vask de differensierte cellene med PBS for å fjerne døde celler og deretter løse med 4% paraformaldehyd (PFA) i 20 min ved romtemperatur.
  5. Vaskes igjen med PBS for å fjerne eventuelle PFA og lagre Dekk i brønnene i 1 ml PBS ved 4 ° C.
jove_title "> 8. Neurosphere Kultur og Kvantifisering

  1. Fortynn dissosiert SVZ eller DG vev fra et dyr i 20 ml kulturmedium og plate 200 ml / brønn over en 96-brønners plate ved bruk av en 10 ml pipette multidoser.
  2. Inkuber ved 37 ° C med 5% CO2 i 6-7 dager for SVZ-avledet neurospheres og 10 til 12 dager for DG-avledet neurospheres.
    Merk: vekst i lengre tid enn de anbefalte inkubasjonstider vil resultere i overvekst, og vil føre til celledød i sentrum av de neurospheres og / eller, spontan tilknytning og differensiering.
  3. Telle-og måle diameteren av neurospheres ved hjelp av et okular graticule montert på en opprettstående lysmikroskop

9. Passering de neurospheres

Etter at de primære neurospheres er blitt tellet og deres størrelse registreres kan de bli utvidet over flere passasjer som begynner med enten en enkelt neurosphere eller et bulk-kultur.

  1. Bulk kultur neurosphere utvidelse
    1. Til passasje kombin neurospheres som et bulk kultur, fjernes mediet inneholdende de neurospheres fra platen, overfør til en 15 ml rør og sentrifugert ved 300 xg i 5 min.
    2. Kast supernatanten og resuspender neurospheres i 1 ml forvarmet 0,05% Trypsin-EDTA og inkuber ved romtemperatur i 3 min.
    3. Til et likt volum av trypsin-inhibitor inneholdende DNaseI og bland godt.
    4. Sentrifuger i 5 minutter ved 300 xg, fjern supernatanten og tilsett 1 ml av vekstmedium.
    5. Triturer opp og ned ca 10x med en P1000 pipette å distansere de neurospheres.
    6. Fjern 10 ml av cellesuspensjonen og blandes med et likt volum av trypan blå og utføre en levende celletall ved bruk av et hemocytometer.
    7. Reseed celler i en tetthet på 1 x 10 4 celler / cm 2 i passende størrelse cellekultur brønn eller kolbe.
    8. Inkuber ved 37 ° Cmed 5% CO 2 til sekundære neurospheres skjema.
  2. Enkelt neurosphere utvidelse
    1. Til passasje individuelle neurospheres velge brønner som inneholder en enkelt neurosphere og fjern forsiktig og kast cirka 160 mL av vekstmedium fra hver brønn uten å forstyrre neurosphere.
    2. Legg 100 ml av 0,05% Trypsin-EDTA til hver brønn som skal passeres, og inkuber ved værelsetemperatur i 3 min.
    3. Tilsett 100 pl trypsin-inhibitor inneholdende DNaseI for å stoppe reaksjonen.
    4. Triturer ca 10 ganger opp og ned med en P200 pipette å bryte fra hverandre neurosphere.
    5. Overfør 200 ml inneholdende dissosierte neurosphere til en ny brønn på en 24-brønners plate inneholdende 1,5 ml vekstmedium. Inkuber ved 37 ° C med 5% CO2 inntil sekundære neurospheres form.
      Merk: for å bestemme langtids potensial, en av kardinal egenskapene for en ekte nevrale stem celle, bør neurospheres bli passaged i minst 5-10 passasjer. Se også litteratur om delvis kontroversielle tolkning av slike resultater 12-14.

10. Differensiering av Neurosphere kulturer

Primær eller passaged neurospheres kan differensieres for å avgjøre multipotentiality.

  1. Fjern neurospheres i suspensjon fra deres kultur plate eller kolbe og overføre dem til en 10 cm plast petriskål.
  2. Under en disseksjon mikroskop fjerne ca 15-20 neurospheres fra medium med en P20 pipette og overfør til en 24-brønns plate som inneholder kulturmedium uten vekstfaktorer og en PDL / Laminin belagt dekkglass.
  3. Skille i ca 7 dager ved 37 ° C med 5% CO 2.
  4. Vask de differensierte neurospheres med PBS for å fjerne døde celler og deretter løse med 4% PFA i 20 min ved romtemperatur.
  5. Vaskes igjen med PBS for å rEDra eventuelle PFA og lagre Dekk i brønner i en ml PBS ved 4 ° C

11. Farging av Neurosphere og tilhenger kulturer

Merk: For farging med den O4 antistoff utelater Triton fra blokkerings og farging trinn og husk å bruke en passende IgM sekundært antistoff.

  1. Inkuber Dekkglass som inneholder differensierte neurospheres eller adherente monolagskulturer i blokkeringsoppløsning (10% Normal Esel serum i PBS inneholdende 0,2% Triton X-100) i 60 min ved romtemperatur.
  2. Inkuber i frisk blokkeringsoppløsning inneholdende primære BIII-tubulin, Map2a + b, glial fibrillary surt protein (GFAP), eller O4 antistoffer for 60 min ved romtemperatur.
  3. Vask 3x med PBS.
  4. Inkuber i frisk blokkeringsoppløsning inneholdende hensiktsmessige fluorescens konjugerte sekundære antistoffer og 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI; 1:5,000) i 30 min ved romtemperatur i mørke.
  5. Monter Dekk på objektglass med fluoresens montering medium og lufttørke i mørket over natten
  6. Vis og bilde ved hjelp av en fluorescens mikroskop.

Representative Results

Selv om de to nevrogene regioner av voksen musehjerne begge inneholder neurale forløper celler, kan disse cellene oppfører seg helt annerledes når dyrket in vitro. De adherente monolagskulturer som genereres fra begge regioner vises skilles morfologisk (figur 1 A) har imidlertid de SVZ-avledet adherente kulturer spre seg hurtigere og må passaged i gjennomsnitt 1-2 dager tidligere enn de som stammer fra DG. Som neurospheres, de SVZ-avledet forløper celler også spre seg raskere og danne større neurospheres (Figur 1B) enn de DG-avledet forløper celler (figur 1C). Mens SVZ-avledet neurospheres er vanligvis regnet etter 6-7 dager i kultur, er DG-avledet neurospheres vanligvis kvantifisert etter 10-12 dager. I tillegg er et langt større antall neurale forløperceller ligge i SVZ forhold til DG, som gjenspeiles av den nesten ti ganger større antall neurospheres som kan være generated fra denne regionen (SVZ: 1173 ± 74,9 vs DG: 145,3 ± 26,4, p = <0,0001, n = 10 dyr per gruppe, figur 2A).

Studier har vist at de forløper celler innenfor SVZ og DG svare på forskjellige stimuli. De forløper celler i DG blir aktivert ved bestemte typer av spatial læring og ved stimuli slik som miljø-anrikning og fysisk aktivitet, mens SVZ forløper celler aktiveres av olfaktorisk læring og lukte anrikning. I samsvar med dette, og en av oss (TLW) tidligere vist at DG inneholder en befolkning på latent stilk og stamceller som kan aktiveres ved nevrale eksitasjon 15-18. I kontrast, fant vi at de SVZ forløper celler svare ganske forskjellig på denne stimulans, med en nedgang i neurosphere nummer i respons til depolariserende nivåer av KCl 17. Her har vi gjentok dette eksperimentet, Plating halvparten av de isolerte celler avledet fra SVZ og DG individual dyr i depolariserende nivåer av KCl og den andre halvparten i kontroll KCl nivåer. Vi viser, som tidligere, at mens DG forløper celler aktiveres ved depolarisering (101,2 ± 17,4 vs 184,8 ± 12,5, p = 0,005, n = 5 dyr), er spredning av de SVZ-avledede celler i virkeligheten betydelig redusert ( 368,0 ± 62,9 vs 266,6 ± 41,6, p = 0,02, n = 5 dyr, figur 2B).

For å bekrefte langvarig potensial, en av de viktigste karakter av en sann stamcelle, enkelt neurospheres eller adherente monolagskulturer må være i stand til forlenget ekspansjon dvs. over minst 10 passasjer. Ved hver passasje, etter fremstilling av en enkeltcelle-suspensjon, er det antall celler tellet, og folden ekspansjon beregnes. Det teoretiske totale celle blir deretter beregnet ved å multiplisere den fold ekspansjon under denne passasje av det teoretiske totalt fra den tidligere passasje. Dette er disp legges som en linjegraf med passering nummer plottet mot log 10 av den teoretiske totale celletallet (se eksempel figur 3). For å bekrefte multipotentiality, kan både ettlagskulturer og neurospheres differensieres etter mitogen tilbaketrekking og bli vist å gi opphav til både nerveceller og gliaceller (figur 4).

Figur 1
. Figur 1 Voksen mus forløper celler kan dyrkes som heft ettlagskulturer (A) eller som neurospheres (B: SVZ, C: DG).. Scale bar er 50 mm Klikk her for å se større bilde.

load/51225/51225fig2highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51225/51225fig2.jpg "/>
Figur 2. Signifikant flere neurospheres er generert fra SVZ forhold til DG av enkelt mus (A). De SVZ og DG forløper celler reagerer forskjellig på in vitro depolarisering (B).

Figur 3
Figur 3. Å bekrefte langsiktig potensering, er neurospheres utvidet i over 10 passasjer.

Figur 4
Figur 4 neurospheres kan bli differensiert i BIII-Tubu.lin + nevroner (A: rød), GFAP + astrocytter (A: grønn), O4 + oligodendrocytes (B: rød) og Map2ab + nevroner (C: rød). Klikk her for å se større bilde.

Discussion

Dette notatet presenterer en detaljert protokoll for initiering av nevrale forløpere i andre kulturer, både som tilhenger monolayers og neurospheres, fra de to store nevrogene områder av den voksne mus hjernen. Det er et antall viktige punkter som må tas i betraktning når man forsøker en av disse in vitro-kultursystemer. For det første, er valget av dissosiasjon metoden svært viktig og er vevet avhengig. I våre hender, er 0,05% trypsin-EDTA meget effektive for dissosiasjon av SVZ vev, og resulterer i et høyere antall neurospheres enn når man bruker et papain-baserte dissosiasjon teknikk. For dissosiasjon fra DG vev men vi anbefaler på det sterkeste en papain basert dissosiasjon tilnærming. Ved direkte sammenligning av de to dissosiasjon metoder på DG vev, observerte vi en signifikant lavere yield på levedyktige celler og ca 10 ganger færre neurospheres ved bruk av trypsin. Denne forskjell i dissosiasjon kan skyldes forskjellen i vevet composition mellom de to regionene. Den kompakte vev av DG er omgitt av omfattende neuropil og omfattende skader av cellulære prosesser kan oppstå under dissosiasjon.

Et annet viktig punkt å merke seg er at, mens neurosphere assay kan være nyttig for å gjøre kvantitative uttalelser om antall forløper-celler som er tilstede i et gitt vevsprøve, en viss forsiktighet må imidlertid anvendes i tolkningen av disse absolutte tall. Fusjon av neurospheres kan være en stor problemfaktor. Flere studier har vist at nevroner er svært bevegelige og kan smelte sammen, selv under det som er visstnok 'clonal' forhold 7,19. Den resulterende neurosphere frekvens kan være svært avhengig av faktorer, inkludert de mellom komponenter, disseksjon fremgangsmåte og dissosiasjons-prosessen. Selv mellom erfarne teleskopisk del variasjon i antall neurospheres generert fra tilsynelatende identiske prøver er åpenbart (se figur 1A.) Et stoff, er ​​en direkte sammenligning av forløperen frekvens mellom to gitte prøver (dvs. kontroll vs behandlet eller vill-type g. knock-out) som håndteres av en og samme person i et enkelt eksperiment, i stedet for en kvantitativ angivelse av total forløper celle nummer.

Når det avgjøres hvilken av de to kulturmetoder som er mest egnet for et spesielt eksperiment, er det viktig å merke seg at disse to kultursystemer varierer i homogeniteten av de celletyper som genereres. I forhold til former adherente cellekulturer, som viser en forholdsvis homogen forløper celle basseng (~ 98% av cellene er Sox2 +) 20, neurospheres er mer heterogen, og inneholder, i tillegg til prolifererende forløper celler, differensierte neuroner og astrocytter 21,22. Det er viktig at de neurospheres ikke er dyrket i lengre perioder mellom passasjene som jo større neurosphere bli desto mer sannsynlig er det å finne differensierte celletyper i sin kjerne.

Vi tradisjonelt initiere heftmonolags nevrale forløper kulturer fra DG vev på mellom 5-8 mus. Derfor, når man forsøker å etablere de adherente monolagskulturer fra DG eller SVZ av en enkelt mus, må den ytterste forsiktighet for å bli tatt i løpet av vevet dissosiasjon fremgangsmåte for å unngå overdreven celledød forårsaket av over triturering av vevet, eller å ta forlenget perioder mellom disseksjon og endelige dyrkningstrinn. Denne protokollen beskriver, for første gang, generering av heftmonolayer forløper kulturer fra både SVZ og DG hvert enkelt dyr. Det er mange tilfeller hvor sammenligningen av forløperen proliferasjon og differensiering må gjøres på et enkelt dyr basis. Disse inkluderer muligheten til å direkte sammenligne DG og SVZ av individuelle dyr med sammenkoblede statistikk og å koble kultur data med individuelle atferdsmessige eller fysiologiske data ni. Enkelt dyr kulturer også allav bruk av sjeldne transgene dyr, hvor alders matchende en pool av 5-8 donorer per kultur ikke er mulig, samt unike dyr (f.eks F2 krysser eller ut avlet dyr) for genetiske assosiasjonsstudier.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

TLW ble støttet av et Marie Curie International Incoming Fellowship. Dette arbeidet ble også finansiert fra grunnleggende institusjonelle finansiering, für Bundesministerium Bildung og Forschung (BMBF) finansiering og delvis med støtte fra Priority Research Program (SFB) 655 i GK. Forfatterne ønsker å takke Anne Karasinsky for stell og vedlikehold av alle dyr som brukes i denne studien og Odette Leiter, Susann Ruhwald, Fanny Boehme, og Richard Wetzel for cellekultur og mikros assistanse.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Poly-D-lysine Sigma P7280-5MG
Laminin Roche 11243217001
Glass Pastuer pipettes Volac BS5732
DMEM:F12 (1:1) 1x Life Technologies 21331-020
Neural Basal Medium (1x) Life Technologies 21103-049
B27 supplements (50x) Life Technologies 17504-044
GlutaMAX Life Technologies 35050-038
Heparin Sigma H3393
Penacillin/Streptomycin Life Technologies 15140-122
EGF PeproTech AF-100-15
bFGF PeproTech 100-18B
0.05% Trypsin-EDTA Life Technologies 25300-054
Trypsin inhibitor Sigma T6522
DNaseI Roche 10104159001
Accutase PAA L11-007
Papain Worthington LS003120
Dispase Life Technologies 17105-041
Percoll GE Healthcare 17-0891-02
HBSS (with Calcium and Magnesium) Life Technologies 14025-050
Glucose Roth X997.2
HEPES Sigma H3375-500G
NaHCO3 Merck K39347429847
1 ml Syringes  Braun 2016-10
27 G Needles Braun 4657705
Scalpels (#22 disposable) Braun BA222
Dumont #7 forceps FST 11271-30
Dumont 5/45 forceps FST 11251-35
Scissors FST 14060-10
Iris spatula FST 10093-13
70% Ethanol
PBS Life Technologies 14040-091
flasks/well plates TPP 92696
PFA (4%) Sigma P6148
Hemocytometer Marienfeld 650010
Trypan blue (0.4%) Sigma T8154
NDS Millipore 530
TritonX-100 Sigma T9284
Mouse monoclonal bIII-tubulin antibody Promega G712A
Rabbit polyclonal glial fibrillary acidic protein antibody Dako 20334
O4  R&D Systems MAB1326
Map2a+b Sigma M1406
Donkey anti-mouse Cy3 antibody  Jackson ImmunoResearch 715-505-151
Donkey anti-rabbit Alexa488  Dianova 711-545-152
4,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI)  Invitrogen 861405
Aqua Polymount Polysciences Inc 18606
10 ml Combi tips Eppendorf 30089677
Plastic 10 ml and 25 ml serological pipettes Corning 4488/4489
EQUIPMENT
Pipetboy Integra Biosciences 521942
Multidoser pipette Eppendorf
37 °C waterbath
Dissecting microscope
37 °C:5% CO2 incubator
Centrifuge Eppendorf 5810R

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
  2. Reynolds, B. A., Weiss, S. Clonal and population analyses demonstrate that an EGF-responsive mammalian embryonic CNS precursor is a stem cell. Dev. Biol. 175, 1-13 (1996).
  3. Palmer, T. D., Ray, J., Gage, F. H. FGF-2-responsive neuronal progenitors reside in proliferative and quiescent regions of the adult rodent brain. Mol. Cell. Neurosci. 6, 474-486 (1995).
  4. Ray, J., Raymon, H. K., Gage, F. H. Generation and culturing of precursor cells and neuroblasts from embryonic and adult central nervous system. Methods Enzymol. 254, 20-37 (1995).
  5. Bez, A., et al. Neurosphere and neurosphere-forming cells: morphological and ultrastructural characterization. Brain Res. 993, 18-29 (2003).
  6. Babu, H., Cheung, G., Kettenmann, H., Palmer, T. D., Kempermann, G. Enriched monolayer precursor cell cultures from micro-dissected adult mouse dentate gyrus yield functional granule cell-like neurons. PLoS One. 2, (2007).
  7. Jessberger, S., Clemenson, G. D., Gage, F. H. Spontaneous fusion and nonclonal growth of adult neural stem cells. Stem Cells. 25, 871-874 (2007).
  8. Reynolds, B. A., Tetzlaff, W., Weiss, S. A multipotent EGF-responsive striatal embryonic progenitor cell produces neurons and astrocytes. J. Neurosci. 12, 4565-4574 (1992).
  9. Freund, J., et al. Emergence of individuality in genetically identical mice. Science. 340, 756-759 (2013).
  10. Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay. J. Vis. Exp. (2010).
  11. Hagihara, H., Toyama, K., Yamasaki, N., Miyakawa, T. Dissection of hippocampal dentate gyrus from adult mouse. J. Vis. Exp. (2009).
  12. Jensen, J. B., Parmar, M. Strengths and limitations of the neurosphere culture system. Mol. Neurobiol. 34, 153-161 (2006).
  13. Pastrana, E., Silva-Vargas, V., Doetsch, F. Eyes wide open: a critical review of sphere-formation as an assay for stem cells. Cell. Stem Cell. 8, 486-498 (2011).
  14. Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres- re-evaluating the relationship. Nat. Methods. 2, 333-336 (2005).
  15. Walker, T. L., Turnbull, G. W., Mackay, E. W., Hannan, A. J., Bartlett, P. F. The latent stem cell population is retained in the hippocampus of transgenic Huntington's disease mice but not wild-type mice. PLoS One. 6, (2011).
  16. Walker, T. L., et al. Prolactin stimulates precursor cells in the adult mouse hippocampus. PLoS One. 7, (2012).
  17. Walker, T. L., et al. Latent stem and progenitor cells in the hippocampus are activated by neural excitation. J. Neurosci. 28, 5240-5247 (2008).
  18. Walker, T. L., et al. Prominin-1 allows prospective isolation of neural stem cells from the adult murine hippocampus. J. Neurosci. 33, (2013).
  19. Singec, I., et al. Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology. Nat. Methods. 3, 801-806 (2006).
  20. Babu, H., et al. A protocol for isolation and enriched monolayer cultivation of neural precursor cells from mouse dentate gyrus. Front. Neurosci. 5, 89 (2011).
  21. Parmar, M., Sjoberg, A., Bjorklund, A., Kokaia, Z. Phenotypic and molecular identity of cells in the adult subventricular zone in vivo and after expansion in vitro. Mol. Cell Neurosci. 24, 741-752 (2003).
  22. Suslov, O. N., Kukekov, V. G., Ignatova, T. N., Steindler, D. A. Neural stem cell heterogeneity demonstrated by molecular phenotyping of clonal neurospheres. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 14506-14511 (2002).

Erratum

Formal Correction: Erratum: One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice
Posted by JoVE Editors on 11/26/2014. Citeable Link.

A correction was made to One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice. Many micro symbols were changed into milli symbols by accident: In the Protocols, sections 1.1, 1.3, 3.6, 3.7, 6.2, 6.6, 8.1, 9.1.6, 9.2.2, and 9.2.5 need to be fixed, as does Figure 1 description in the Results section.

Protocol section 1.1 was changed from:

At least two days prior to commencing the experiment, prepare Poly-D-lysine (PDL)/Laminin coated plates for adherent monolayer cultures. To prepare wells/flasks add enough PDL (10 mg/ml in dH2O) to coat the surface and incubate overnight at room temperature. Remove the solution from the dish and wash the dish three times with dH2O. Allow to air dry. Add Laminin (5 mg/ml in cold DMEM:F12) and incubate at 37 °C overnight. Remove the Laminin and either use the plates immediately or store with the Laminin at -20 °C until required.

to:

At least two days prior to commencing the experiment, prepare Poly-D-lysine (PDL)/Laminin coated plates for adherent monolayer cultures. To prepare wells/flasks add enough PDL (10 µg/ml in dH2O) to coat the surface and incubate overnight at room temperature. Remove the solution from the dish and wash the dish three times with dH2O. Allow to air dry. Add Laminin (5 µg/ml in cold DMEM:F12) and incubate at 37 °C overnight. Remove the Laminin and either use the plates immediately or store with the Laminin at -20 °C until required.

Protocol section 1.3 was changed from:

On the day of dissection, prepare the appropriate amount of culture medium by mixing Neural Basal Medium with 2% B27, 1x GlutaMAX, 2 µg/ml heparin, 50 units/ml Penicillin/Streptomycin, 20 ng/ml purified mouse receptor-grade epidermal growth factor (EGF), and 20 ng/ml recombinant bovine fibroblast growth factor (FGF-2). Warm the culture medium to 37 °C in a water bath.

to:

On the day of dissection, prepare the appropriate amount of culture medium by mixing Neural Basal Medium with 2% B27, 1x GlutaMAX, 2 mg/ml heparin, 50 units/ml Penicillin/Streptomycin, 20 ng/ml purified mouse receptor-grade epidermal growth factor (EGF), and 20 ng/ml recombinant bovine fibroblast growth factor (FGF-2). Warm the culture medium to 37 °C in a water bath.

Protocol section 3.6 was changed from:

Add growth medium to a total volume of 5 ml and pass the cell suspension through a 40 mm sieve to remove debris and undissociated tissue clumps.

to:

Add growth medium to a total volume of 5 ml and pass the cell suspension through a 40 µm sieve to remove debris and undissociated tissue clumps.

Protocol section 3.7 was changed from:

Centrifuge at 300 x g for 5 min, discard the supernatant and resuspend the resulting pellet in 200 ml growth medium.

to:

Centrifuge at 300 x g for 5 min, discard the supernatant and resuspend the resulting pellet in 200 µl growth medium.

Protocol section 6.2 was changed from:

Add 50 ml Accutase and incubate at 37 °C for 2-3 min (checking to see if the cells are rounded and detached).

to:

Add 50 µl Accutase and incubate at 37 °C for 2-3 min (checking to see if the cells are rounded and detached).

Protocol section 6.6 was changed from:

For subsequent passages, resuspend cells in 200 ml growth medium and count using a hemocytometer. Plate at 1 x 104 cells/cm2 in the appropriate sized coated well or flask.

to:

For subsequent passages, resuspend cells in 200 µl growth medium and count using a hemocytometer. Plate at 1 x 104 cells/cm2 in the appropriate sized coated well or flask.

Protocol section 8.1 was changed from:

Dilute the dissociated SVZ or DG tissue from one animal in 20 ml of culture medium and plate 200 ml/well across a 96-well plate using a 10 ml multidoser pipette.

to:

Dilute the dissociated SVZ or DG tissue from one animal in 20 ml of culture medium and plate 200 µl/well across a 96-well plate using a 10 ml multidoser pipette.

Protocol section 9.1.6 was changed from:

Remove 10 ml of the cell suspension and mix with an equal volume of trypan blue and perform a live cell count using a hemocytometer.

to:

Remove 10 µl of the cell suspension and mix with an equal volume of trypan blue and perform a live cell count using a hemocytometer.

Protocol section 9.2.2 was changed from:

Add 100 ml of 0.05% Trypsin-EDTA to each well to be passaged and incubate at room temperature for 3 min.

to:

Add 100 µl of 0.05% Trypsin-EDTA to each well to be passaged and incubate at room temperature for 3 min.

Protocol section 9.2.5 was changed from:

Transfer the 200 ml containing the dissociated neurosphere to a new well of a 24-well plate containing 1.5 ml of growth medium. Incubate at 37 °C with 5% CO2 until secondary neurospheres form.

to:

Transfer the 200 µl containing the dissociated neurosphere to a new well of a 24-well plate containing 1.5 ml of growth medium. Incubate at 37 °C with 5% CO2 until secondary neurospheres form.

Figure 1 description was updated from:

Figure 1. Adult mouse precursor cells can be cultured as adherent monolayer cultures (A) or as neurospheres (B: SVZ, C: DG). Scale bar is 50 mm.

to:

Figure 1. Adult mouse precursor cells can be cultured as adherent monolayer cultures (A) or as neurospheres (B: SVZ, C: DG). Scale bar is 50 µm.

En mus, to kulturer: Isolation and Culture of Adult nevrale stamceller fra de to nevrogene Soner Individuell Mus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Walker, T. L., Kempermann, G. One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice. J. Vis. Exp. (84), e51225, doi:10.3791/51225 (2014).More

Walker, T. L., Kempermann, G. One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice. J. Vis. Exp. (84), e51225, doi:10.3791/51225 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter