Summary
Vi præsenterer en protokol, hvordan de skal indsamle og bearbejde elektron kryo-tomogrammer af hele mitokondrier. Teknikken giver detaljerede indsigt i struktur, funktion og organisering af store membran protein komplekser i native biologiske membraner.
Abstract
Electron cryo-tomografi er et kraftfuldt værktøj i strukturel biologi, er i stand til at visualisere tredimensionale struktur af biologiske prøver, såsom celler, organeller, membranvesikler eller virus ved molekylær detaljer. For at opnå dette, er vandige prøve hurtigt forglasset i flydende ethan som bevarer det i et tæt-på-nativ, frosne hydreret tilstand. I elektronmikroskop, registreres tilt serier ved flydende kvælstof temperatur, hvorfra 3D tomogrammer er rekonstrueret. Signal-til-støj-forholdet for tomografiske volumen er i sagens natur lav. Genkendelige, tilbagevendende funktioner er forstærket af subtomogram udligning, hvorved de enkelte subvoluminer er skåret ud og justeret, og i gennemsnit at reducere støj. På denne måde, 3D-kort med en opløsning på 2 nm eller bedre kan opnås. Et anfald af eksisterende strukturer i høj opløsning til 3D volumen derefter producerer atomare modeller af protein komplekser i deres oprindelige miljø. Her viser vi, hvordan vi bruger elektron kryo-tomography at studere in situ for tilrettelæggelse af store membran protein komplekser i mitokondrier. Vi finder, at ATP synthaser er organiseret i rækker af dimerer langs stærkt buede spidser af den indre membran cristae, mens komplekse jeg tilfældigt fordelt i regionerne membran på begge sider af rækkerne. Ved subtomogram gennemsnit opnåede vi en struktur af mitokondrie ATP-syntase-dimer i cristae membran.
Introduction
Mitokondrier er de power-huse i cellen. Ved at konvertere en elektrokemisk protongradient over den indre mitokondrielle membran ind kemisk binding energi, mitochondrial ATP-syntase producerer de fleste af ATP, der driver cellulære processer. For at forstå mekanismerne bag mitokondrie energi konvertering, er vi nødt til at bestemme strukturen af ATP syntase in situ, og at finde ud af, hvordan det er indrettet og distribueres i den indre mitokondrielle membran. Selv om strukturer af de fleste af de mitokondrie ATP synthase komponenter 1-3 og kort lav opløsning af hele komplekset 4 høj opløsning er til rådighed, er det vigtigt at fastsætte strukturen og formen af den erhvervsaktive enzymet i membranen. Fordelingen af ATP-syntase i den indre mitokondrielle membran har været almindeligt antaget at være tilfældig, men en tidlig finde 5 og vores egne indledende resultater 6 vist, at dette ikke er than tilfælde. Efterfølgende studier fra vores gruppe og andre 7 har bekræftet, at ATP-syntase er anbragt i lange rækker af dimerer langs stramt buede kamme i den indre mitokondriemembran cristae 8, mens protonpumper elektron transportkæden synes at være placeret på begge sider af rækkerne 9. Dette arrangement har store konsekvenser for mekanismerne i mitokondrie energi konvertering.
Den teknik, som vi har anvendt til at bestemme dette arrangement er elektron cryo-tomografi (kryo-ET). Cryo-ET er i øjeblikket den eneste metode, der leverer nøjagtige tredimensionale (3D) mængder af celler, cellulære rum eller organeller på molekylær opløsning. Cryo-ET er især velegnet til at studere store komplekser i biologiske membraner, fordi membranerne ser med god kontrast og er nemme at spore i 3D tomografiske mængder.
Andre fremgangsmåder til at undersøge 3D-struktur af celler eller organelles giver ikke molekylær detalje. Super-opløsning lysmikroskopi 10, 11 er fremragende på at afsløre positionen eller afstande mellem lysemitterende etiketter til proteiner af interesse med en præcision på snesevis af nm, men det ikke afslører strukturen af selve proteinet, selv ved lav opløsning . Transmission elektronmikroskopi af serielle sektioner 12 eller blok-ansigt billeddannelse ved scanning elektronmikroskopi 13 plastik-embedded biologiske prøver har udsigt over cellulære mængder med lav opløsning, men heller ikke afsløre molekylær detalje. Atomarkraftmikroskopi 14 kan i princippet levere molekylær eller endda atomar opløsning, men kun på overfladen af objekter på en atomisk fladt, fast underlag. Endelig røntgentomografi 15 eller spredning af intense røntgen-pulser fra fri-elektron-lasere 16 er usandsynligt at afsløre strukturen af store, komplekse aperiodiske genstande som hele celler eller organeller ved molecular opløsning i en overskuelig fremtid. Således på nuværende tidspunkt, er der intet alternativ til cryo-ET til undersøgelser af 3D-strukturen af celler eller organeller i nanometer opløsning.
Cryo-ET er den foretrukne metode til at undersøge strukturen og formen af membran-associeret protein forsamlinger, herunder den komplekse kerneporen 17, influenza-spike komplekser 18, og flagellerne motoriske proteiner 22, 23 men også organiseringen af hele bakterieceller 19 og opførelse af sygdomsfremkaldende vira som HIV i til celler 20-23. Cryo-ET er uvurderlig til visualisering af trådformede proteiner og deres samspil i cellen, herunder actinfilamenter 24 eller axonemes 25. Resolutionen kan forbedres til 2 nm eller bedre ved subtomogram gennemsnit 26, hvorved subvoluminer gentagne, regelmæssige træk er skåret ud af en tomografi volumen og gennemsnit ved en enkelt-partikel billedet proikke beskadiger teknikker.
Cryo-ET indebærer erhvervelse af en serie af projektion billeder af en tynd prøve (<250 nm), der træffes på forskellige tilt vinkler i en transmissions elektron mikroskop (TEM). Prøven skal være tynd, så elektroner, der interagerer kraftigt med stof, er spredt mere end én gang. Multipel spredning gør resulterende billeder vanskelige at fortolke og reducerer kontrast. Billeder af det valgte prøve-området er justeret i forhold til hinanden og projiceret ind i et 3D-rum med et egnet computerprogram, generering af et 3D volumen af prøven. Tilpasningen af billederne er hjulpet af guld fiducial markører, som er blandet med prøven inden frysning. Ideelt 10 eller mere jævnt fordelt fiducial markører bør være til stede i hvert billede for at opnå en god tilpasning.
At observere molekylær detalje, prøver springet frosset i flydende ethan som bevarer deres oprindelige hydreret tilstand. Frysning i flydendeethan er så hurtig (~ 10 5 ° C / sek) 27, at vand ikke krystalliserer, men forbliver i en forglasset, glas-lignende tilstand. Iskrystaldannelse skader følsomme biologiske strukturer. Da biologiske prøver lider skade stråling, er der en grænse for det totale antal lysspredende begivenheder prøven kan tåle. Billeder er således erhvervet i lavdosis-mode: Et område af interesse identificeret ved lav forstørrelse (1,500X) med en elektron dosis under 1 e - / nm 2 (søgemodus). Billedet er så fokuseret på et højere forstørrelse, fra området af interesse (fokus-funktion). Kun når et billede er erhvervet, er området af interesse bestrålet med en højere dosis elektron (eksponering tilstand).
Her præsenterer vi et overblik over, hvordan de skal indsamle og bearbejde elektron cryo-tomogrammer, ved hjælp af ATP syntase dimerer i den indre mitokondrielle membran som et eksempel. Følgende protokol beskriver, hvordan man forbereder mitochondrier til cryo-ET, hvordan du opsætterog indsamle en tilt serie med en specifik samlet elektron dosis, og hvordan at behandle tilt serie til opnåelse af et 3D volumen af området af interesse. En oversigt over den procedure, er illustreret i figur 1.
Protocol
1. Fremstilling af mitokondrier fra celler eller væv fra differentialcentrifugering
Dette afsnit beskriver en generel procedure til isolering af intakte mitokondrier fra forskellige eukaryote organismer. Den præcise pufferkomponenter og centrifugering hastigheder skal optimeres for hvert væv / arter undersøgt.
- Break celler i isotonisk puffer (fx 250 mM saccharose, 10 mM HEPES pH 7,4) ved anvendelse af en glas-kuglemølle (svampemycelium) 28, enzymatisk nedbrydning af cellevæggen (Saccharomyces cerevisiae) 29, et kugleleje homogenisator (enkelt -celle eukaryoter / Kultur celler / nematoder) 30, eller en blender (animalsk eller plantevæv) 31.
- Fjern cellerester ved filtrering gennem musselin efterfulgt af lav hastighed centrifugering (2.000 x g, 4 ° C, 10 min).
- Samle bundfald og pellet mitokondrier ved høj hastighed centrifugering (9.000 xg, 4 ° C, 10 min).
- Hvor det er nødvendigt, skal du bruge en isotonisk skridt tæthedsgradient for yderligere oprensning af mitochondriefraktionen 32.
2. Fremstilling af mitokondrier for Electron Cryo-tomografi
Det følgende afsnit beskriver, hvordan man opnår frosne hydreret prøver til cryo-ET. BEMÆRK: Fremgangsmåden involverer anvendelse af meget kolde flydende nitrogen og ethan, som kan forårsage alvorlige forbrændinger. Beskyttelsesbriller og cryo-beskyttelseshandsker skal anvendes. Flydende ethan, som også er brandfarligt, skal håndteres i et stinkskab.
- Resuspender pelleterede mitokondrier i 250 mM trehalose, 10 mM HEPES-buffer ved pH 7,4 til en koncentration på cirka 5 mg / ml totalt protein.
- Glødeudladnings- vandudtryk kulstof EM gitre, carbon side op, i en vakuum-enhed ifølge producentens anvisninger.
- Liquefy nogle ml ethan ved at lede en strøm af ethan gas på den indvendige side af en flydende nitrogen køligted aluminium beholder.
- Bland protein A-konjugeret guld fiducial suspension 1: 1 med mitokondrie affjedring og straks anvende 3 pi for en glødeudladnings- EM gitter afholdt i pincet.
- Placér pincetten i en forglasning enhed, fx en hjemmelavet guillotinen. Dup overskydende væske med en kile af filtrerpapir (~ 5 sek eller indtil væsken stopper spredning), og straks kaster nettet i flydende ethan ved at slippe aftrækkeren.
- Overfør gitteret fra flydende ethan i flydende kvælstof. Under overførslen fjerne overskydende ethan fra nettet med filtrerpapir. Placér spidsen af et kileformet stykke filterpapir i den flydende ethan. Da den flydende ethan stiger, skal du trække forsigtigt gitteret op filtrerpapiret men holde det under væskens front. Flydende ethan fjernes fra nettet ved kapillarvirkning, og når al væske ethan er blevet fjernet straks overføre gitteret i flydende nitrogen.
- Placer vitrificerede gitter i et gitter opbevaringskasse, etnd opbevares under flydende nitrogen til senere anvendelse som relevant.
3. Registrering af Tomografisk Tilt serien
Det følgende afsnit beskriver, hvordan du opretter og samle en tomografisk tilt serie af et mitokondrie med et Polara elektronmikroskop udstyret med en post-kolonne energi filter og CCD-kamera. Tilsvarende protokoller bruges med alle elektron cryo-mikroskoper er udstyret med CCD eller direkte elektron detektor kameraer.
- Juster mikroskop
- Indsæt prøvelegeme fx grafit og guld øer på Holey kulstof film.
- Vælg søgetilstand i mikroskopet lavdosis-system.
- Bring prøven eucentric højde. Det er det punkt minimal xy bevægelse, når vippe prøveholderen. Centrer et interessepunkt ved 0 ° hældning, vippe scenen til 20 ° og re-center punktet ved at ændre z-højde. Retur til 0 ° og gentag indtil sideværts forskydning minimeres.
- Vælgeksponering tilstand. Vælg den ønskede forstørrelse for indsamling af en tomogram (f.eks 25,000X på detektor ≈ 0,6 nm aftryk pixelstørrelse).
- Vælg en lille kondensator blænde (50-70 mm), og vælg et spot størrelse og stråle intensitet således at bjælken er bare bredere end den billeddannende enhed og giver en pixel læsning af 60 E - / pixel (CCD) eller 14 e - / pixel / sek (direkte elektron detektor, tælle tilstand).
- Center kondensator blænde.
- Find Gaussisk fokus fx punkt minimal kontrast. Nulstil mikroskop Defocus læsning og korrekte omdrejningspunkter og rotation center i henhold til producentens anvisninger.
- Dial i ønsket Defocus til optagelse tomogram. BEMÆRK: Høj Defocus (8 um) øger kontrasten, men reducerer opløsning, mens lav Defocus (2-4 um) øger opløsning på bekostning af kontrast.
- Over en tom hul, generere en ny gevinst reference og tilpasse energi filter i henhold til producentensinstruktioner.
- Juster søgning og eksponeringsmetoder. I eksponering tilstand centrere et punkt af interesse og skifte til søgetilstand. Vælg forstørrelse på 1,500X (0,033 um / pixel prøve på detektor) og Defocus på 100 um (for øget kontrast). Bring interessepunkt tilbage til centrum ved hjælp af billedet shift spoler.
- I søgetilstand, justere spot størrelse og stråle intensitet således at bjælken er bare bredere end den billeddannende enhed og giver en pixel læsning af ~ 20 E - / pixel (CCD) eller ~ 8 E - / pixel / sek (direkte elektron detektor, optælling funktion).
- Find en god Prøve-området
- Sæt gitteret med frosne hydreret mitokondrier ind i elektronmikroskop ved flydende nitrogens temperatur (se EM producentens anvisninger).
- I søgetilstand, søg på nettet for områder af passende isens tykkelse og prøve kvalitet. Tag en 6 sek søgning billede af lovende områder for at afgøre egnethed til tomogram samling. Both indre og ydre mitokondriske membran skal være synlige i denne forstørrelse.
- Optagelse af en Tomografisk Tilt serien
- Når en god eksemplar område er fundet, vippe scenen ± 60 ° for at bestemme den maksimale hældning område, der er tilgængelige uden nogen obstruktion af eksponering eller fokus område ved grid barer eller isklumper.
- På en nærliggende isfyldte hul af lignende udseende, skifte til eksponering mode og justere strålen intensitet eller billede erhvervelse tid, så hver optagede billede har en elektron dosis på 30-50 E - / pixel for CCD'er eller 6-8 e - / pixel / r direkte elektron detektorer, tælle tilstand.
- Beregn dosis fordelingsforhold (I 0 / I 60) ved at dividere den gennemsnitlige elektron tæller til 1 sek billedet erhvervet ved 0 ° med det 60 ° billede. Dette forhold beskriver den øgede eksponering tid, der kræves for at opretholde en konstant elektron tæller pr billede med stigende hældningsvinkel (eksponeringstid = 1 / COS (α) n, hvor (I 0 / I 60) = 2 n). Forholdet fungerer også som en god indikation af isens tykkelse. Gode tomogrammer af mitokondrier er normalt optaget med et I 0 / I 60 = 2,3-2,6.
- Over en tom hul, erhverve en 1 sek billede i eksponering mode og bemærk elektron tæller pr Å2. Under hensyntagen til den dosis fordelingsforholdet beregne det samlede antal billeder, der kan optages til en specifik samlet elektron dosis (fx <40 E - / en 2 for struktur beslutsomhed & ~ 160 E - / en 2 for morfologi).
- Bestemme den passende hældning interval for tomogram samling ved at dividere den samlede tilt rækkevidden (f.eks 120 ° for ± 60 °) ved det samlede antal billeder, der er beregnet i 3.3.4.
- Opsætning og optage en tomogram med parametrene ovenfor bestemte anvendelse af passende automatisk dataindsamling software 33, 34. Tilt serien er normalt startet ved ± 20 ° og gå gennem 0 ° før de nåede høje hældninger for at maksimere de oplysninger, indhold af lav tilt billeder, som er ødelagt af stigende elektron dosis.
4. Etablering og segmentering af tomografiske Mængder
Dette afsnit beskriver hvordan tomografiske mængder af mitokondrier er genereret ud fra tilt-serien, og hvordan de mængder, der er til stede til almindelig visning.
- Gem tomografiske tilt-serien til en passende mappe. Generer en billedstak og konvertere til et passende filformat med open source software, såsom dm2mrc eller tif2mrc (israelske forsvarsminister pakke), som konverterer .dm3, .dm4 eller .tif filer til MRC stakke. Der kræves MRC stakke til tomografisk rekonstruktion med israelske forsvarsminister 35. Andre pakker kræver forskellige formater.
- Juster billederne og generere en tomogram ved at følge trinene beskrevet i israelske forsvarsminister tutorial (
- Forbedre kontrast tomogram ved hjælp af den ikke-lineære anisotropisk diffusion filter distribueret med israelske forsvarsminister. Dette filter fungerer godt for membraner og membran-associerede partikler, såsom ATP-syntase.
- Til visualisering, manuelt segmentere tomogram anvendelse af kommercielt tilgængelige programmer f.eks Amira. Tildel voxels, der svarer til den indre eller ydre membran og generere en overflade. Brug klikkeren indstilling i EM-pakke plugin til AMIRA 36 markere placeringen af ATP syntase partikler.
5. Subtomogram Midling af ATP-syntase Dimerer og montering af røntgenstrukturer
Det følgende afsnit beskriver, hvordan subtomogram gennemsnit af ATP syntase dimerer kan opnås.
- Brug af afmærkede partikler som input og en passende software-pakke såsom "Delkel skøn for Electron Tomography 'program, beregne en subtomogram gennemsnit.
- Til beslutning skøn, sammenligne to uafhængigt bestemmes subtomogram gennemsnit per Fourier shell korrelation 37.
- Hvis den er tilgængelig, havne kendte X-ray strukturer i gennemsnit subtomogram med stive legeme montering, enten manuelt eller ved hjælp af automatiske sekventielle docking rutiner som dem i programmet Chimera 38.
Representative Results
Electron cryo-tomogrammer af mitochondrier viser klart 3D morfologi organel (figur 2). Manuel segmentering af membranerne i en tomografisk volumen illustrerer strukturen af cristae i et mitokondrie. Af imaging mitokondrier fra forskellige gær knockout-stammer, som mangler visse proteinholdige komponenter, kan effekten af disse proteiner på cristae fysik ved vurderet. Figur 3 viser en mitokondrie fra en gær stamme, der mangler ATP-syntase-underenheden e. Denne bestanddel af ATP-syntase kompleks er nødvendige for dimerisering af mitokondrie ATP-syntase. Mitokondrier fra denne stamme mangler den normale lamellare cristae af vildtype-mitochondrier (figur 2) og i stedet indeholder et antal indvendige membran rum. Disse rum er enten blottet for cristae eller indeholder små ballon-formet membran invaginationer (Figur 3).
Tomograms med god kontrast, store mitokondrieprotein komplekser, i dette tilfælde ATP syntase dimerer, er let synlige (figur 4; Movie 1). Strukturerne af komplekserne kan bestemmes på 2-3 nm opløsning ved subtomogram gennemsnit (figur 5; Movie 2). De gennemsnitlige mængder kan placeres tilbage i tomogram for at vurdere organisering af individuelle komplekser i forhold til hinanden og til andre protein-komplekser i membranen (figur 6, Movie 3).
Figur 1. Flow-diagram, der viser stadier elektron kryo-tomografi. Klik her for at se et større billede.
Figur 2. Morfologi en mitokondrie fra vildtype-S. Cerevisiae. Centrale skive gennem et tomografisk volumen af en vildtype S. cerevisiae mitokondrie (venstre) og tilsvarende overflade-renderet volumen (højre). Den segmenterede volumen af den ydre membran er gråt og mængderne af den indre grænse og cristae membraner i lyseblå. Tilpasset fra Davies et al. 8 Klik her for at se et større billede.
Figur 3. Mitochondrion fra en S. cerevisiae. Stamme, der mangler en underenhed er nødvendig forATP-syntase dimerisering. Skære gennem tomografisk volumen (til venstre) og ledsagende overflade-afsmeltet volumen (til højre) af et mitochondrie fra en S. cerevisiae. Stamme mangler proteinunderenheden e kræves for ATP syntase dimerisering. Sammenlignet med figur 2, mangler mitokondrier fra mutantstammen normal lamellare cristae af vildtype-mitochondrier. I stedet mitochondriet har mange indre membran rum med enten ingen cristae eller ballon-formet cristae. Således elektron kryo-tomografi fremhæver ændringer i membran morfologi grund gendeletioner. Tilpasset fra Davies et al. 8 Klik her for at se et større billede.
Figure 4. Mitochondrion fra svampen P. anserina. Skær igennem tomografisk volumen (til venstre) og tilhørende overflade-renderet volumen (højre) af en mitokondrie fra trådsvampen P. anserina. I denne tomogram er rækker af 10 nm partikler (gule pilespidser) placeret over stærkt buede membran kamme i den indre membran cristae (se Film 1). Disse partikler blev identificeret som ATP synthase dimerer efter subtomogram gennemsnitsberegning. Fra Davies et al. 9 Klik her for at se et større billede.
Figur 5. Struktur og organisering af mitokondrie ATP-syntase. Side og ovenfra viser elektron tætheden af en ATP-syntase dimer fra S. C erevisiae som bestemt ved subtomogram gennemsnitsberegning med monteret atomare modeller (til venstre). Mitokondrie indre membranvesikel viser organiseringen af ATP synthase dimerer i rækker (til højre). Figuren blev genereret ved at placere gennemsnittet af ATP-syntase-dimer subtomogram i den segmenterede volumen af membranvesikel, ved hjælp af koordinaterne beregnet under gennemsnittet. Tilpasset fra Davies m.fl. 8. Atomic modeller: F 1 / rotor-ring [FBF: 2WPD] 39 (blå og lilla); oligomycin følsom overdragelse protein-OSCP [FBF: 2BO5] 40 (grøn); perifer stilk fragment [FBF: 2CLY] 1 med N-terminale rester fra [FBF: 2WSS] 2 (gul og rød) (se Movie 2). Klik her for at se et større billede.
_upload / 51228 / 51228fig6highres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 6. Isoleret crista vesikel fra en P. anserina mitokondrie. Skiver fra et tomografisk volumen (til venstre) og tilhørende overflade-renderet volumen (højre) af en crista vesikel fra P. anserina. Protein tætheder stikker ud fra membranen er klart synlige. De tætheder angivet med gule pile er ATP synthase dimerer som identificeret ved subtomogram gennemsnitsberegning. Grønne pilespidser peger på tætheder identificeret ved antistofmærkning som NADH dehydrogenase (kompleks 1, for detaljer se 9). Segmentering af protein tætheder afslører deres organisation i cristae, med ATP syntase dimererne (rød og gul) danner rækker langs de stærkt buede cristae forhøjningerne og NADH dehydrogenase komplekser (grøn) i membranen regionerne på begge sider af rækkerne (se Movie 3). Fra Davies m.fl. 9.28 / 51228fig7highres.jpg "target =" _blank "> Klik her for at se et større billede.
Movie 1. Electron cryo-tomogram af P. anserina mitokondrie. Filmen viser successive skiver gennem en tomografisk volumen taget af et mitokondrie fra trådsvampen P. anserina. Rækker af ATP-syntase, er angivet med gule pilespidser. Overfladen-gjort, segmenteret volumen viser placeringen af ATP-syntase (gule kugler) i forhold til 3D cristae struktur. Ydre membran, grå; indre grænse membran, transparent blå; cristae membraner, uigennemsigtig blå. Fra Davies m.fl. 9. Se figur 4. Klik her for at se video.
Movie 2. Subtomogram gennemsnit af mitokondrie ATP-syntase dimer fra S. cerevisiae. Med monteret atomare modeller. Gennemsnittet varberegnet ud fra 121 subvoluminer. Tætheden vises på tre kontur niveauer: 1s - mesh, 2s - lysegrå og 3s - mørkegrå. Atomic modeller blev monteret i densitet ved hjælp af den sekventielle pasform rutine Chimera. Atomic modeller: F 1 / rotor-ring [FBF: 2WPD] 39 (blå og lilla); oligomycin følsom overdragelse protein-OSCP [FBF: 2BO5] 40 (grøn); perifer stilk fragment [FBF: 2CLY] 1 med N-terminale rester fra [FBF: 2WSS]. 2 (gul og rød) Klik her for at se video.
Tilpasset fra Davies m.fl. 8. Se også figur 5.
Movie 3. Isoleret cristae vesikel fra en P. anserina mitokondrie. Skiftende skiver gennem tomografiske volumen vises, efterfulgt af den segmenterede overflade-renderet volumen. Protein tætheder stikker ud fra membrane er klart synlige. Røde og gule tætheder er ATP syntase dimerer. Grønne tætheder er NADH-dehydrogenase (kompleks I) som bestemt ved antistof-mærkning. Fra Davies m.fl. 9. Se også figur 6. Klik her for at se video.
Discussion
Protokollen præsenteres her giver en introduktion til kryo-ET og subtomogram midling af mitokondrier, men i det væsentlige den samme procedure kan anvendes til en anden celle rum eller membran. For at opnå de bedst mulige data, kritiske trin under proceduren er prøveforberedelse, springet nedfrysningsprocessen og data opkøbsstrategi. Prøve kvalitet, som er afgørende for succes, afhænger af en optimeret nedfrysning for at sikre passende isens tykkelse, som er af afgørende betydning for et godt billede kontrast. Den optimale opkøbsstrategi data afhænger af instrumentet og prøve. Parametre, der skal optimeres omfatter elektron dosis pr billede, tilt ordningen og Defocus. Erhvervelse en god tomogram af en god prøve gør hele yderligere behandling skridt lettere og sikrer et tilfredsstillende slutresultat.
Cryo-ET kombineret med subtomogram udjævning og atommodel montering indeholder oplysninger om, hvordan protein-komplekser er arrangeret i their Native cellulære miljø. Teknikken er velegnet til at undersøge strukturen af store membranprotein komplekser, såsom respiratoriske kæde supercomplexes (1,7 MDA), ATP synthase dimerer (2x500 kDa) eller kerneporen kompleks (~ 120 MDa) 8, 9, 17. Organiseringen af ATP synthase dimerer i rækker ikke kan observeres ved hjælp af teknikker med høj opløsning, såsom røntgenkrystallografi, NMR eller single-partikel kryo-EM, fordi dimeren rækker er forstyrret af detergentekstraktion, hvilket er et nødvendigt skridt i isolation og oprensning af membran-proteinkomplekser.
Arrangementet af ATP syntase i rækker af dimerer langs cristae kamme er et universelt organisationsprincip i mitokondrier i alle arter. Proton-pumpende komplekser af elektron transportkæde, især komplekse I (NADH dehydrogenase), er placeret i membranen områder på hver side af rækkerne 8,9. Denne organisation af det respiratoriske kæde har dybtgående indvirkning på mitokondrie bioenergetik. Hvis dimer rækker ikke kan dannes på grund af fravær af dimer-specifikke protein-subunits, cellerne udviser længere generation og færre cellulære egnethed, som observeret i gærmutant vist i figur 3 41. Med den stigende interesse for mitokondrie-sygdomme en detaljeret forståelse af det molekylære grundlag regulerer mitokondrie ultrastruktur og funktion er af afgørende betydning. Electron cryo-tomografi giver en sammenhæng mellem proteinstruktur bestemt ved høj opløsning metoder, og fordelingen og arrangementet af disse proteiner i membranen på omfanget af nanometer. Dette gør cryo-ET et vigtigt redskab til at forstå mitokondrie struktur og funktion i sundhed og sygdom.
Yderligere tekniske udviklinger og forbedringer i cryo-ET omfatter protein-mærkning af strategier til at identificere placeringen af Protein underenheder i makromolekylære komplekser eller placeringen af mindre eller mindre distinkte proteiner (<0,5 MDA) i celler. Desuden har hybrid EM forarbejdningsmetoder, der kombinerer subtomogram gennemsnitsberegning med enkelt partikel analyse eller spiralformet rekonstruktion nylig fastsat proteinstrukturer til ~ 8 A 42, 43. Disse forarbejdningsmetoder er i øjeblikket begrænset til oprensede proteiner, der er godt adskilt i is eller danner spiralformede forsamlinger og er i øjeblikket ikke anvendelse på overfyldte cellulære miljøer som mitokondrier og cristae membraner. For dataindsamling er nye computing og hardware værktøjer blive udviklet til at muliggøre automatiseret tomogram erhvervelse, øge billedets kontrast og reducere det samlede krævede elektron dosis. Den eneste grundlæggende begrænsning i kryo-ET er stråleskader til prøven af elektronstrålen. Dette betyder, at doser kun meget lave elektron kan bruges til at optage hvert billede af en tomografisk tilt serie, hvilket resulterer i dårligt signal-to-støj-forhold, som i sidste ende begrænser den opnåelige opløsning. De nye direkte elektron detektorer, udgivet mindre end et år siden, er i øjeblikket revolutionere området for enkelt-partikel kryo-EM 44, 45. Disse nye detektorer giver højere kontrast og bedre opløsning ved lavere doser elektron. For elektron kryo-tomografi, betyder det, at tilt-serie med mindre skridt størrelser eller endda dobbelt akse tomogrammer kan indsamles uden bekymringer om overdreven stråleskader (en CCD-billedsensor er tilsvarende i elektron dosis til 5 direkte elektron detektor billeder). De enorme mængder af data, der produceres af disse detektorer skabe deres egne udfordringer i data håndtering, forarbejdning og oplagring, der bliver nødt til at blive overvundet.
Desuden faseplader, der arbejder på de samme principper som dem, der anvendes rutinemæssigt i lysmikroskopi at forbedre fasekontrast, bliver i øjeblikket udviklet til transmission elektronmikroskopi 46, 47.. Dette skulle give tomogrammer skal indsamles nærmere at fokusere og dermed en højere opløsning, mens den på samme tid bevarer lav opløsning funktioner der er nødvendige for tilpasning og fortolkning af tomografiske mængder. Tilsammen vil disse teknologiske fremskridt i høj grad udvide den række af biologiske spørgsmål, der kan løses ved cryo-ET.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Max Planck Society (KMD, BD, AWM, tuberkulose, TBB, DJM, og WK), Cluster Excellence Frankfurt "makromolekylære Komplekser" finansieret af Deutsche Forschungsgemeinschaft (WK) og en postdoc EMBO Langsigtet Fellowship (VAMG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sucrose | Roth | 4621.2 | |
| Trehalose | Sigma-Aldrich | T9449 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Zymolase | biomol | Z1000.1 | |
| Density gradient medium | Sigma-Aldrich | D1556 or P1644 | |
| Protein A gold | Aurion | 810.111 | 10 nm |
| Ethane | Air Liquide | P0502S02R0A001 | |
| Nitrogen | Air Liquide | I4150RG | |
| Consumables | |||
| Filter paper | Whatman, GE Healthcare | 1004 090 | Nr 4 |
| Tweezers | Dumont | T506 | Non-magnetic, pattern #5 |
| EM combined test grid | Plano GmbH | S142 | grapite and gold islands on holey carbon film |
| Holey carbon grids | Quantifoil Micro Tools GmbH or C-flat | R2/2 300 Cu mesh | |
| Cryo grid boxes | Plano GmbH | 160-42 | Alternative home-made metal boxes |
| Potter | Sigma-Aldrich | P7984 | |
| Blender | Waring | 8011S | |
| Glass bead mill - bead beater | BioSpec Products | 1107900-105 | Including 0.5 mm beads |
| Ball-bearing (Balch) homogeniser | isobiotec | H8 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 46915 | Sorvall RC6+ |
| Glow-discharge apparatus | Bal-Tec A.G. | CTA 010 | |
| Grid vitrification device | FEI, Gatan or Leica | Alternative home-made plunger | |
| Transmission electron microscope | FEI or Jeol | 300 keV | |
| Direct electron detector | Gatan | K2 summit | 4k x 4k pixels, counted mode |
| Charge coupled device (CCD) | Gatan | US4000 | 4k x 4k pixels (alternative to Direct electron detector) |
| Energy filter | Gatan or Jeol | ||
| Software | |||
| Image acquisition software | Gatan | ||
| Tomogram acquisition software | Gatan, FEI, USCF, or UC-Boulder | 4 alternatives | |
| Tomogram processing software | FEI, UCSF or UC-Boulder | 3 alternatives | |
| Subtomogram averaging software | UC-Boulder, or University of Basel | 2 alternatives | |
| Tomogram visualization software | UC-Boulder, FEI, or University of Utah | 3 alternatives | |
| Visualization software plugin | Goethe university | http://www.biophys.uni-frankfurt.de/frangakis/ | |
| Structure visualization software | UCSF | http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ | |
| Numerical calculation software | MathWorks | http://www.mathworks.de/academia/ | |
References
- Dickson, V. K., Silvester, J. A., Fearnley, I. M., Leslie, A. G., Walker, J. E. On the structure of the stator of the mitochondrial ATP synthase. The EMBO journal. 25, 2911-2918 (2006).
- Rees, D. M., Leslie, A. G., Walker, J. E. The structure of the membrane extrinsic region of bovine ATP synthase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 21597-21601 (2009).
- Watt, I. N., Montgomery, M. G., Runswick, M. J., Leslie, A. G., Walker, J. E. Bioenergetic cost of making an adenosine triphosphate molecule in animal mitochondria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 16823-16827 (2010).
- Baker, L. A., Watt, I. N., Runswick, M. J., Walker, J. E., Rubinstein, J. L. Arrangement of subunits in intact mammalian mitochondrial ATP synthase determined by cryo-EM. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 11675-11680 (2012).
- Allen, R. D., Schroeder, C. C., Fok, A. K. An investigation of mitochondrial inner membranes by rapid-freeze deep-etch techniques. The Journal of cell biology. 108, 2233-2240 (1989).
- Strauss, M., Hofhaus, G., Schroder, R. R., Kühlbrandt, W. Dimer ribbons of ATP synthase shape the inner mitochondrial membrane. The EMBO journal. 27, 1154-1160 (2008).
- Dudkina, N. V., Oostergetel, G. T., Lewejohann, D., Braun, H. P., Boekema, E. J. Row-like organization of ATP synthase in intact mitochondria determined by cryo-electron tomography. Biochimica et biophysica acta. 1797, 272-277 (2010).
- Davies, K. M., Anselmi, C., Wittig, I., Faraldo-Gomez, J. D., Kühlbrandt, W. Structure of the yeast F1Fo-ATP synthase dimer and its role in shaping the mitochondrial cristae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 13602-13607 (2012).
- Davies, K. M., et al. Macromolecular organization of ATP synthase and complex I in whole mitochondria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 14121-14126 (2011).
- Wurm, C. A., et al. Nanoscale distribution of mitochondrial import receptor Tom20 is adjusted to cellular conditions and exhibits an inner-cellular gradient. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 13546-13551 (2011).
- Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. The Journal of cell biology. 190, 165-175 (2010).
- Austin, J. R. 2nd, Staehelin, L. A. Three-dimensional architecture of grana and stroma thylakoids of higher plants as determined by electron tomography. Plant physiology. 155, 1601-1611 (2011).
- Ohta, K., et al. Beam deceleration for block-face scanning electron microscopy of embedded biological tissue. Micron. 43, 612-620 (2012).
- Buzhynskyy, N., Sens, P., Prima, V., Sturgis, J. N., Scheuring, S. Rows of ATP synthase dimers in native mitochondrial inner membranes. Biophysical journal. 93, 2870-2876 (2007).
- Larabell, C. A., Nugent, K. A. Imaging cellular architecture with X-rays. Current opinion in structural biology. 20, 623-631 (2010).
- Miao, J., Hodgson, K. O., Sayre, D. An approach to three-dimensional structures of biomolecules by using single-molecule diffraction images. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 6641-6645 (2001).
- Maimon, T., Elad, N., Dahan, I., Medalia, O. The human nuclear pore complex as revealed by cryo-electron tomography. Structure. 20, 998-1006 (2012).
- Meyerson, J. R., et al. Determination of molecular structures of HIV envelope glycoproteins using cryo-electron tomography and automated sub-tomogram averaging. Journal of visualized experiments : JoVE. (58), (2011).
- Chen, S., et al. Electron cryotomography of bacterial cells. Journal of visualized experiments : JoVE. (39), (2010).
- Bharat, T. A., et al. Structural dissection of Ebola virus and its assembly determinants using cryo-electron tomography. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 4275-4280 (2012).
- Bennett, A. E., et al. Ion-abrasion scanning electron microscopy reveals surface-connected tubular conduits in HIV-infected macrophages. PLoS pathogens. 5, e1000591 (2009).
- Liu, J., et al. Cellular architecture of Treponema pallidum: novel flagellum, periplasmic cone, and cell envelope as revealed by cryo electron tomography. Journal of molecular biology. 403, 546-561 (2010).
- Liu, J., et al. Intact flagellar motor of Borrelia burgdorferi revealed by cryo-electron tomography: evidence for stator ring curvature and rotor/C-ring assembly flexion. Journal of bacteriology. 191, 5026-5036 (2009).
- Patla, I., et al. Dissecting the molecular architecture of integrin adhesion sites by cryo-electron tomography. Nature cell biology. 12, 909-915 (2010).
- Heuser, T., et al. Cryoelectron tomography reveals doublet-specific structures and unique interactions in the I1 dynein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, E2067-E2076 (2012).
- Briggs, J. A. Structural biology in situ-the potential of subtomogram averaging. Current opinion in structural biology. 23, (2013).
- Cheng, D., Mitchell, D. R. G., Shieh, D. B., Braet, F. Current Microscopy Contributions to Advances in Science and Technology. Méndez-Vilas, A. 2, Formatex. (2012).
- Brust, D., et al. Cyclophilin D links programmed cell death and organismal aging in Podospora anserina. Aging cell. 9, 761-775 (2010).
- Gregg, C., Kyryakov, P., Titorenko, V. I. Purification of mitochondria from yeast cells. Journal of visualized experiments : JoVE. (30), (2009).
- Bhaskaran, S., et al. Breaking Caenorhabditis elegans the easy way using the Balch homogenizer: an old tool for a new application. Analytical biochemistry. 413, 123-132 (2011).
- Pavlov, P. F., Rudhe, C., Bhushan, S., Glaser, E. In vitro and in vivo protein import into plant mitochondria. Methods in molecular biology. 372, 297-314 (2007).
- Graham, J. M., et al. Ch. 3, Current protocols in cell biology. Bonifacino, J. S. , John Wiley and Sons. (2001).
- Zheng, S. Q., et al. UCSF tomography: an integrated software suite for real-time electron microscopic tomographic data collection, alignment, and reconstruction. Journal of structural biology. 157, 138-147 (2007).
- Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. Journal of structural biology. 152, 36-51 (2005).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of structural biology. 116, 71-76 (1996).
- Pruggnaller, S., Mayr, M., Frangakis, A. S. A visualization and segmentation toolbox for electron microscopy. Journal of structural biology. 164, 161-165 (2008).
- Scheres, S. H., Chen, S. Prevention of overfitting in cryo-EM structure determination. Nature methods. 9, 853-854 (2012).
- Pettersen, E. F., et al. UCSF Chimera--a visualization system for exploratory research and analysis. Journal of computational chemistry. 25, 1605-1612 (2004).
- Dautant, A., Velours, J., Giraud, M. F. Crystal structure of the Mg.ADP-inhibited state of the yeast F1c10-ATP synthase. The Journal of biological chemistry. 285, 29502-29510 (2010).
- Carbajo, R. J., et al. Structure of the F1-binding domain of the stator of bovine F1Fo-ATPase and how it binds an alpha-subunit. Journal of molecular biology. 351, 824-838 (2005).
- Paumard, P., et al. The ATP synthase is involved in generating mitochondrial cristae morphology. The EMBO journal. 21, 221-230 (2002).
- Bharat, T. A., et al. Structure of the immature retroviral capsid at 8 A resolution by cryo-electron microscopy. Nature. 487, 385-389 (2012).
- Bartesaghi, A., Lecumberry, F., Sapiro, G., Subramaniam, S. Protein secondary structure determination by constrained single-particle cryo-electron tomography. Structure. 20, 2003-2013 (2012).
- Bai, X. C., Fernandez, I. S., McMullan, G., Scheres, S. H. Ribosome structures to near-atomic resolution from thirty thousand cryo-EM particles. eLife. 2, e00461 (2013).
- Li, X., et al. Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM. Nature methods. , (2013).
- Danev, R., Nagayama, K. Optimizing the phase shift and the cut-on periodicity of phase plates for TEM. Ultramicroscopy. 111, 1305-1315 (2011).
- Walter, A., et al. Practical aspects of Boersch phase contrast electron microscopy of biological specimens. Ultramicroscopy. 116, 62-72 (2012).
