Summary
We presenteren een protocol over hoe om te verzamelen en te verwerken elektronen cryo-tomogrammen van hele mitochondriën. De techniek biedt gedetailleerd inzicht in de structuur, functie en organisatie van grote membraan eiwitcomplexen in de moedertaal van biologische membranen.
Abstract
Electron cryo-tomografie is een krachtig instrument in de structurele biologie, kan visualiseren de driedimensionale structuur van biologische monsters, zoals cellen, organellen, membraan vesicles, of virussen op moleculair detail. Om dit te bereiken, wordt het waterige monster snel verglaasd in vloeibare ethaan, waardoor het in een close-to-native, bevroren-gehydrateerde toestand behoudt. In de elektronenmicroscoop, zijn tilt-serie opgenomen temperatuur van vloeibare stikstof, waaruit 3D tomogrammen worden gereconstrueerd. De signaal-ruisverhouding van het tomografische volume inherent laag. Herkenbare, steeds terugkerende kenmerken worden versterkt door subtomogram middeling, waardoor individuele subvolumes zijn uitgesneden, uitgelijnd en gemiddeld om ruis te verminderen. Zo 3D kaarten met een resolutie van 2 nm of beter worden verkregen. Een vlaag van beschikbare hoge-resolutie structuren om het 3D-volume produceert dan atoommodellen van eiwitcomplexen in hun eigen omgeving. Hier laten we zien hoe we gebruiken elektronen cryo-tomography het in situ organisatie van grote membraaneiwit complexen in mitochondriën. We vinden dat ATP synthase georganiseerd in rijen dimeren langs sterk gebogen toppen van de binnenste membraan cristae, terwijl complex I willekeurig verdeeld in de membraan gebieden aan weerszijden van de rijen. Door subtomogram middeling verkregen we een structuur van het mitochondriale ATP synthase dimeer in de cristae membraan.
Introduction
Mitochondriën zijn de energie-huizen van de cel. Door het omzetten van een elektrochemische proton gradiënt over het binnenste mitochondriale membraan in chemische binding energie, de mitochondriale ATP synthase produceert het grootste deel van de ATP die cellulaire processen drijft. Om de mechanismen achter mitochondriale energieconversie begrijpen, moeten we de structuur van de ATP synthase in situ te bepalen en om te zien hoe het wordt aangebracht en verdeeld in het binnenste mitochondriale membraan. Hoewel hoge-resolutie structuur van de meeste van de mitochondriale ATP synthase componenten 1-3 en lage resolutie kaarten van het gehele complex 4 beschikbaar zijn, is het belangrijk om de structuur en conformatie van de werkende enzym vast in het membraan. De verdeling van de ATP synthase in het binnenste mitochondriale membraan werd algemeen aangenomen willekeurig zijn, maar een vroege vinden 5 en eigen eerste resultaten 6 aangegeven dat dit niet tHij case. Latere studies van onze onderzoeksgroep en andere 7 hebben bevestigd dat de ATP synthase is aangebracht in lange rijen dimeren langs de strak gekromde randen van de binnenste mitochondriale membraan cristae 8, terwijl de protonpomp van het elektron transport keten lijken zich aan weerszijden van de rijen 9. Deze regeling heeft belangrijke implicaties voor de mechanismen van mitochondriale energie-omzetting.
De techniek die we hebben gebruikt om deze regeling te bepalen is electron cryo-tomografie (cryo-ET). Cryo-ET is momenteel de enige methode die nauwkeurige driedimensionale (3D) volumes van cellen, cellulaire compartimenten of organellen levert bij moleculaire resolutie. Cryo-ET is bijzonder geschikt voor het bestuderen van grote complexen in biologische membranen, omdat de membranen weergegeven met een goed contrast en zijn gemakkelijk terugvinden in 3D tomografie volumes.
Andere methoden om de 3D structuur van cellen of organell studiees niet voorzien moleculair detail. Super-resolutie lichtmicroscopie 10, 11 is super bij het openbaren van de positie of de afstanden tussen lichtgevende labels aan eiwitten van belang met een nauwkeurigheid van enkele tientallen nm, maar het is niet de structuur van het eiwit zelf onthullen, zelfs bij lage resolutie . Transmissie elektronenmicroscopie van seriële secties 12 of block-face beeldvorming door scanning elektronenmicroscopie 13 van kunststof-ingebedde biologische monsters met een lage resolutie uitzicht op cellulaire volumes, maar ook niet de moleculaire details zichtbaar. Atomic force microscopie 14 kan in principe leveren moleculaire of atomaire resolutie, maar alleen op het oppervlak van objecten op atomair vlak, een vaste drager. Tenslotte röntgenstralen 15 of verstrooiing van intense X-ray pulsen van vrije elektronen lasers 16 waarschijnlijk niet de structuur van grote, complexe, aperiodische objecten visualiseren zoals hele cellen of organellen bij molecular resolutie in de nabije toekomst. Dus op dit moment is er geen alternatief voor de cryo-ET voor studies van de 3D-structuur van cellen of organellen op nanometer resolutie.
Cryo-ET is de methode voor het onderzoek van de structuur en conformatie van membraan-geassocieerd eiwit samenstellingen waaronder de nucleaire porie complex 17, het influenzavirus aar complexen 18 en de flagella motor eiwitten 22, 23 maar ook de organisatie van hele bacteriecellen 19 en opneming van pathogene virussen zoals HIV in cellen 20-23. Cryo-ET onschatbare waarde voor het visualiseren filamenteuze eiwitten en hun interacties in de cel, zoals actine filamenten 24 of axonemes 25. De resolutie kan tot 2 nm of beter worden verbeterd door subtomogram gemiddelde 26, waarbij subvolumes van herhaalde, regelmatige trekken zijn gesneden uit een tomografische volume en gemiddeld door enkele deeltjes het proverwerking technieken.
Cryo-ET om de verwerving van een reeks projectie beelden van een specimen dunne (<250 nm) genomen op verschillende hellingshoeken in een transmissie elektronenmicroscoop (TEM). Het monster moet dun zijn, zodat elektronen, die sterk interageren met materie, zijn niet meer dan een keer verspreid. Meervoudige verstrooiing maakt de resulterende beelden moeilijk te interpreteren en vermindert het contrast. Foto's van de geselecteerde monster stippellijn zijn uitgelijnd ten opzichte van elke andere en geprojecteerd in een 3D-ruimte met een geschikt computerprogramma, het genereren van een 3D-volume van het monster. De uitlijning van de beelden wordt bevorderd door goud ijkmarkeringen, die gemengd met het monster voor het invriezen. Idealiter 10 of meer gelijkmatig verdeeld ijkmarkeringen aanwezig moeten zijn in elke afbeelding om een goede afstemming te bereiken.
Om moleculaire detail te observeren, monsters zijn duik-ingevroren in vloeibare ethaan, die hun geboorteland gehydrateerde toestand behoudt. Invriezen in vloeibaarethaan is zo snel (~ 10 5 ° C / sec) 27 dat water niet kristalliseren, maar blijft in een verglaasd, glas-achtige toestand. Ijskristal vorming schade gevoelige biologische structuren. Al biologische monsters lijden stralingsschade er een limiet aan het totaal aantal verstrooiingsgebeurtenissen het monster kan verdragen. Afbeeldingen worden dan overgenomen in een lage dosis mode: Een gebied van de rente wordt vastgesteld bij een lage vergroting (1,500X) met een elektron dosis onder de 1 e - / nm 2 (zoekmodus). Het beeld wordt dan gericht op een grotere vergroting van het gebied van belang (scherpstelling). Alleen wanneer een beeld wordt verkregen, is het gebied van belang bestraald met een hogere dosis elektronen (belichting).
Hier presenteren we een overzicht van hoe het verzamelen en verwerken elektronen cryo-tomogrammen, met behulp van ATP synthase dimeren in het binnenste mitochondriale membraan als een voorbeeld. Het volgende protocol beschrijft hoe mitochondriën voor cryo-ET voor te bereiden, het opzetten vanen laat een tilt serie met een specifieke totale elektronen dosis en hoe de tilt serie een 3D volume van het gebied van belang te verkrijgen verwerken. Een overzicht van de procedure is weergegeven in figuur 1.
Protocol
1 Bereiding van Mitochondriën uit cellen of weefsels door differentiële centrifugatie
Dit hoofdstuk beschrijft een algemene procedure voor de isolatie van intacte mitochondriën uit verschillende eukaryote organismen. De precieze buffer componenten en centrifugeren snelheden moeten worden geoptimaliseerd voor elk type weefsel / soorten onderzocht.
- Breek cellen in isotone buffer (zoals 250 mM sucrose, 10 mM HEPES pH 7,4) met een glas-parelmolen (schimmel mycelium) 28, enzymatische digestie van de celwand (Saccharomyces cerevisiae) 29, een kogellager homogenisator (single -cell eukaryoten / cultuur cellen / nematoden) 30, of een blender (dierlijke of plantaardige weefsels) 31.
- Verwijder de celresten door filtratie door mousseline gevolgd door lage-snelheid centrifugatie (2000 xg, 4 ° C, 10 min).
- Verzamel supernatant en pellet mitochondria door centrifugatie bij hoge snelheid (9.000 xg, 4 ° C, 10 min).
- Waar nodig, gebruik maken van een isotone dichtheid stapgradiënt voor extra zuivering van het mitochondriale fractie 32.
2 Voorbereiding van Mitochondriën voor Electron Cryo-tomografie
De volgende paragraaf beschrijft hoe bevroren gehydrateerd monsters te verkrijgen voor cryo-ET. OPMERKING: De werkwijze omvat het gebruik van extreem koude vloeibare stikstof en ethaan, die ernstige brandwonden kunnen veroorzaken. Veiligheidsbril en cryo-handschoenen moeten worden gedragen. Liquid ethaan, die ook ontvlambaar, moet een zuurkast worden behandeld.
- Resuspendeer pellet mitochondria tot 250 mM trehalose, 10 mM HEPES buffer bij pH 7,4 tot een concentratie van ongeveer 5 mg / ml totaal eiwit.
- Glow-ontlading essen carbon EM roosters, carbon kant naar boven, in een vacuüm apparaat volgens de instructies van de fabrikant.
- Vloeibaar enkele milliliters ethaan door het richten van een stroom van ethaan gas op de binnenzijde van een vloeibare stikstof koeled aluminium container.
- Mix proteïne A-geconjugeerde gold de vaste suspensie 1: 1 met mitochondriale suspensie en 3 ui onmiddellijk toepassen op een glow-ontlading EM rooster gehouden in pincet.
- Leg de pincet in een vitrificatie-apparaat, bijvoorbeeld een zelfgemaakte guillotine. Dep het overtollige vloeistof met een wig van filterpapier (~ 5 seconden of totdat er geen vloeistof meer verspreiden) en meteen duiken de grid in vloeibare ethaan door het loslaten van de trekker.
- Breng het rooster van vloeibare ethaan in vloeibare stikstof. Tijdens de overdracht, verwijderen overtollige ethaan uit het rooster met filter papier. Plaats de punt van een wigvormig stuk filtreerpapier in de vloeibare ethaan. Als de vloeibare ethaan stijgt zachtjes sleept het net boven het filter papier, maar hou het onder de vloeistof voorzijde. Vloeibare ethaan wordt uit het net door capillaire werking en zodra alle vloeibare ethaan is verwijderd, onmiddellijk het rooster zetten in vloeibare stikstof.
- Plaats het verglaasde rooster in een raster opbergdoos, eennd opslaan onder vloeibare stikstof om later te gebruiken naargelang het geval.
3 Opname van Tomographic Tilt Series
In de volgende sectie wordt beschreven hoe op te zetten en het verzamelen van een tomografische tilt serie van een mitochondrion met een Polara elektronenmicroscoop uitgerust met een post-column energie filter en CCD-camera. Soortgelijke protocollen worden gebruikt bij alle cryo elektronen-microscopen met CCD of directe elektronendetector camera.
- Lijn de Microscoop
- Steek proefstuk bijvoorbeeld grafiet en goud eilanden op essen carbon folie.
- Selecteer de zoekmodus in lage dosis systeem van de microscoop.
- Breng monster eucentrische hoogte. Dit is het punt van minimale xy beweging bij het kantelen van de monsterhouder. Midden een punt van belang bij 0 ° kantelen, kantel het podium tot 20 ° en opnieuw midden het punt door het veranderen van de z-hoogte. Keer terug naar 0 ° en herhaal tot laterale offset wordt geminimaliseerd.
- Selecteerbelichting. Kies de gewenste vergroting voor het verzamelen van een tomogram (bijvoorbeeld 25,000X op detector ≈ 0,6 nm specimen pixelgrootte).
- Kies een kleine condensator diafragma (50-70 mm) en selecteer een spot grootte en intensiteit van de lichtbundel dat de balk is gewoon breder dan de imaging-apparaat en geeft een pixel lezing van 60 e - / pixel (CCD) of 14 e - / pixel / sec (directe elektron detector, het tellen van de modus).
- Centrum van de condensator.
- Zoek Gauss nadruk bijvoorbeeld punt van minimaal contrast. Reset microscoop defocus lezen en correct draaipunten en rotatiecentrum volgens de instructies van de fabrikant.
- Dial in de gewenste defocus voor het opnemen tomogram. OPMERKING: Hoge defocus (8 micrometer) verhoogt het contrast, maar vermindert de resolutie, terwijl lage defocus (2-4 micrometer) verhoogt resolutie ten koste van het contrast.
- Meer dan een leeg gat, het genereren van een nieuwe aanwinst referentie en uitlijnen energie filter volgens de fabrikantinstructies.
- Lijn zoek-en belichtingsinstellingen. In de belichtingsstand, midden een punt van belang en over te schakelen naar de modus zoeken. Kies een vergroting van 1,500X (0,033 micrometer / pixel van specimen op detector) en defocus van 100 micrometer (voor een beter contrast). Breng bezienswaardigheid terug naar centrum met behulp van image shift spoelen.
- In de zoekmodus aanpassen spot grootte en intensiteit van de lichtbundel dat de balk is gewoon breder dan de imaging-apparaat en geeft een pixel lezing van ~ 20 e - / pixel (CCD) of ~ 8 e - / pixel / sec (directe elektron detector, het tellen van de modus).
- Het vinden van een Good Specimen Area
- Plaats de raster met bevroren gehydrateerd mitochondriën in de elektronenmicroscoop temperatuur van vloeibare stikstof (raadpleeg de instructies van EM van de fabrikant).
- Op zoek naar de modus zoeken op het net voor de gebieden van de juiste ijsdikte en specimen kwaliteit. Neem een 6 sec zoeken beeld van kansrijke gebieden om de geschiktheid voor tomogram collectie bepalen. Both de binnenste en buitenste mitochondriale membraan moet zichtbaar zijn op deze vergroting zijn.
- Het opnemen van een Tomographic Tilt Series
- Zodra een goed exemplaar gebied wordt gevonden, kantel het podium ± 60 ° om de maximale tilt bereik dat beschikbaar is te bepalen zonder enige belemmering van de belichting of focus gebied door spijlen of brokken ijs.
- Op een nabijgelegen-ijs gevulde gat van hetzelfde uitzien, veranderen om belichting en stel de lichtintensiteit of de afbeelding acquisitie tijd, zodat elke opname heeft een elektron dosis van 30-50 e - / pixel voor CCD's of 6-8 e - / pixel / s direct elektron detectoren, het tellen van de modus.
- Bereken de dosisverdeling ratio (I 0 / I 60) van het gemiddelde aantal elektronen indelen voor een 1 sec beeld verkregen bij 0 ° met die van een beeld 60 °. Deze verhouding wordt de toename van de blootstelling tijd die nodig is om een constante elektron telling per beeld te behouden met toenemende hellingshoek (belichtingstijd = 1 / cos (α) n waarbij (I 0 / I 60) = 2 n). De verhouding dient ook een goede indicatie van ijsdikte. Goede tomogrammen van mitochondriën worden meestal opgenomen met een I 0 / I 60 = 2,3-2,6.
- Meer dan een leeg gat, een 1 sec afbeelding in belichting te verkrijgen en noteer het aantal elektronen per Å 2. Rekening houdend met de verdeling van de dosis-ratio, berekent het totale aantal beelden dat kan worden opgenomen voor een specifieke totale elektron dosis (bijvoorbeeld <40 e - / A 2 voor structuurbepaling & ~ 160 e - / a 2 voor de morfologie).
- Bepaal de juiste tilt interval tomogram verzamelen door het totale tilt bereik (120 ° gedurende ± 60 °) door het totale aantal afbeeldingen berekende 3.3.4.
- Opzetten en het opnemen van een tomogram met de bovenstaande parameters met behulp van geschikte automatische gegevensverzameling software 3 bepaald3, 34. Tilt series worden gewoonlijk gestart bij ± 20 ° en 0 ° doorlopen voordat hoog kantelt om de informatie-inhoud van laag tilt beelden die wordt vernietigd door verhoging elektronen dosis maximaliseren.
4 Creatie en segmentatie van Tomographic Volumes
Dit hoofdstuk beschrijft hoe tomographic hoeveelheden mitochondria worden gegenereerd uit tilt serie en hoe de volumes voor de algemene kijkervaring zijn aanwezig.
- Sla de tomografie-tilt-serie naar een geschikte map. Genereer een beeld stack en converteren naar een geschikt bestandsformaat met open-source software, zoals dm2mrc of tif2mrc (IMOD pakket), die .dm3, .dm4 of tif-bestanden te converteren naar mrc stacks. mrc stapels zijn vereist voor tomografische reconstructie met IMOD 35. Andere pakketten vereisen verschillende formaten.
- Lijn de beelden en het genereren van een tomogram door de stappen beschreven in de IMOD zelfstudie (
- Vergroot het contrast van de tomogram met behulp van de niet-lineaire anisotrope diffusie filter verdeeld met IMOD. Dit filter werkt goed voor membranen en membraan-geassocieerde deeltjes zoals ATP synthase.
- Voor visualisatie handmatig segment het tomogram de handel verkrijgbare programma bijvoorbeeld Amira. Voxels die overeenkomen met de binnenste of buitenste membraan toe te wijzen en het genereren van een oppervlak. Het gebruik van de clicker optie in het EM-pakket plugin voor AMIRA 36 markeren de locatie van ATP synthase deeltjes.
5 Subtomogram Middeling van ATP synthase dimeren en montage van X-Ray Structuren
De volgende paragraaf beschrijft hoe subtomogram gemiddelden van ATP synthase dimeren kan worden verkregen.
- Met behulp van de gemarkeerde deeltjes als input en een geschikt softwarepakket zoals de 'Partkel Schatting voor electron tomography 'programma, berekent een subtomogram gemiddelde.
- Voor een schatting resolutie, vergelijking van twee onafhankelijk van elkaar bepaald subtomogram gemiddelden door Fourier shell correlatie 37.
- Indien beschikbaar, een dok bekende X-ray structuren in de subtomogram gemiddeld star lichaam aanbrengen, zowel handmatig als met behulp van automatische sequentiële docking routines zoals die in het programma Chimera 38.
Representative Results
Electron cryo-tomogrammen mitochondria duidelijk het 3D morfologie van het organel (figuur 2). Handmatige segmentatie van de membranen in een tomografisch volume illustreert de structuur van de cristae in een mitochondrion. Door afbeelden mitochondriën uit gist knockout stammen die bepaalde eiwitcomponenten ontbreekt, kan het effect van deze eiwitten op cristae morfologie door geëvalueerd. Figuur 3 toont een mitochondrion van een giststam ontbreekt ATP synthase subunit e. Deze component van de ATP synthase complex is vereist voor de dimerisatie van het mitochondriale ATP synthase. Mitochondriën uit deze stam ontbreekt het normale lamellaire cristae van de wildtype mitochondria (figuur 2) en een aantal inwendige membraancompartimenten plaats bevatten. Deze compartimenten zijn ofwel zonder cristae of bevatten kleine ballon-vormige membraan invaginations (figuur 3).
In tomograms met een goed contrast, grote mitochondriale eiwitcomplexen, in casu ATP synthase dimeren, duidelijk zichtbaar (Figuur 4; Film 1). De structuren van de complexen kan worden bepaald bij 2-3 nm resolutie van subtomogram gemiddelde (Figuur 5; Film 2). De gemiddelde volumes kan terug in het tomogram worden geplaatst om de organisatie van afzonderlijke complexen ten opzichte van elkaar en andere eiwitcomplexen in het membraan bepalen (Figuur 6; Film 3).
Figuur 1 Flow-grafiek met de stadia van elektronen cryo-tomografie. Klik hier voor grotere afbeelding.
Figuur 2.Morfologie van een mitochondrion van wild-type S. Cerevisiae. Centrale slice door een tomografie volume van een wild-type S. cerevisiae mitochondrion (links) en overeenkomstige oppervlak rendered volume (rechts). De gesegmenteerde volume van de buitenste membraan wordt getoond in grijs en de volumes van de binnenste grens en cristae membranen in lichtblauw. Aangepast van Davies et al 8. Klik hier voor grotere afbeelding.
Figuur 3 Mitochond van een S. Cerevisiae stam ontbreekt een subunit die nodig is voorATP synthase dimerisatie. Doorklief tomografische volume (links) en bijbehorende oppervlak rendered volume (rechts) van een mitochondrion van een S. Cerevisiae stam ontbreekt het eiwit subunit e nodig voor ATP synthase dimerisatie. In vergelijking met figuur 2, de mitochondrion van de mutante stam mist de normale lamellaire cristae van wildtype mitochondria. In plaats daarvan, het mitochondrion vele binnenmembraan vakken met ofwel zonder cristae of ballonvormige cristae. Aldus cryo-electron tomografie belicht veranderingen in morfologie membraan door gendeleties. Aangepast van Davies et al 8. Klik hier voor grotere afbeelding.
Figure 4 Mitochond uit de schimmel P. anserina. Doorklief tomografische volume (links) en bijbehorende oppervlak rendered volume (rechts) van een mitochondrion van de filamenteuze fungus P. anserina. In dit tomogram, rijen van 10 nm deeltjes (geel pijlpunten) liggen boven diepgebogen membraan richels in de binnenmembraan cristae (zie Film 1). Deze deeltjes werden geïdentificeerd als ATP synthase dimeren door subtomogram middeling. Van Davies ea 9. Klik hier voor grotere afbeelding.
Figuur 5 Structuur en organisatie van het mitochondriale ATP synthase. Zijaanzicht en bovenaanzicht dat de elektronendichtheid van een ATP synthase dimeer van S. c erevisiae zoals bepaald door subtomogram middeling met ingebouwde atoommodellen (links). Mitochondriale binnenmembraan vesicle toont de organisatie van ATP synthase dimeren in rijen (rechts). De figuur werd gegenereerd door het zo subtomogram gemiddelde van de ATP synthase dimeer in de gesegmenteerde volume van de vesicle membraan, met de coördinaten berekend tijdens gemiddeld. Aangepast van Davies et al 8. Atomic modellen: F 1 / rotor-ring [PDB: 2WPD] 39 (blauw en paars); oligomycin gevoelige verlenen eiwit-OSCP [PDB: 2BO5] 40 (groen); perifere steel fragment [VOB: 2CLY] 1 met N-terminale residuen van [VOB: 2WSS] 2 (geel en rood) (zie Movie 2). Klik hier voor grotere afbeelding.
_upload / 51228 / 51228fig6highres.jpg "width =" 500 "/>
Figuur 6 Geïsoleerde crista blaasje van een P. anserina mitochondrion. Segmenten van een tomografische volume (links) en bijbehorende oppervlak rendered volume (rechts) van een crista vesicle van P. anserina. Eiwit dichtheden uitsteekt uit het membraan zijn duidelijk zichtbaar. De aangegeven met gele pijlen dichtheden ATP synthase dimeren, zoals geïdentificeerd door subtomogram middeling. Groen pijlpunten wijzen naar dichtheden geïdentificeerd door antilichaam labeling als NADH dehydrogenase (complex 1, voor details zie 9). Segmentatie van het eiwit dichtheden toont de organisatie in de cristae, de ATP synthase dimeren (rood en geel) die rijen langs de sterk gekromde cristae richels en NADH dehydrogenase complex (groen) in het membraan gebieden aan beide zijden van de rijen (zie Film 3). Van Davies c.s. 9.28 / 51228fig7highres.jpg "target =" _blank "> Klik hier voor een grotere afbeelding.
Film 1 Electron cryo-tomogram van een P. anserina mitochondrion. De film toont opeenvolgende plakjes door een tomografie volume genomen van een mitochondrion van de filamenteuze schimmel P. anserina. Rijen van ATP synthase zijn aangegeven met gele pijlen. Het oppervlak gesmolten, gesegmenteerde volume toont de locatie van ATP synthase (gele bolletjes) met betrekking tot de 3D cristae structuur. Buitenste membraan, grijs; binnengrens membraan transparant blauw; cristae membranen, ondoorzichtig blauw. Van Davies c.s. 9. Zie ook Figuur 4. Klik hier om video te bekijken.
Movie 2 Subtomogram gemiddelde van de mitochondriale ATP synthase dimeer van S. Cerevisiae met ingebouwde atoommodellen. Het gemiddelde wasberekend 121 subvolumes. De dichtheid wordt weergegeven op drie contour niveaus: 1s - mesh, 2s - lichtgrijs en 3s - donkergrijs. Atomic modellen werden geplaatst in de dichtheid met de sequentiële fit routine in Chimera. Atomic modellen: F 1 / rotor-ring [PDB: 2WPD] 39 (blauw en paars); oligomycin gevoelige verlenen eiwit-OSCP [PDB: 2BO5] 40 (groen); perifere steel fragment [VOB: 2CLY] 1 met N-terminale residuen van [VOB: 2WSS]. 2 (geel en rood) Klik hier om video te bekijken.
Aangepast van Davies et al 8. Zie ook figuur 5.
Movie 3 Geïsoleerde cristae blaasje van een P. anserina mitochondrion. opeenvolgende segmenten via tomografische volume zijn vertegenwoordigd, gevolgd door het gesegmenteerde oppervlak gesmolten volume. Eiwit dichtheden uitsteken van de membraame zijn duidelijk zichtbaar. Rode en gele dichtheden ATP synthase dimeren. Green dichtheden NADH dehydrogenase (complex I) zoals bepaald door antilichaam labeling. Van Davies c.s. 9. Zie ook figuur 6. Klik hier om video te bekijken.
Discussion
De hier gepresenteerde protocol geeft een introductie cryo-ET en subtomogram middeling van mitochondria, maar in wezen dezelfde procedure kan worden toegepast op andere cel compartiment of membraan. Om de best mogelijke gegevens te verkrijgen, kritische stappen in de procedure zijn monstervoorbereiding, de sprong te wagen invriezen en data-acquisitie strategie. Sample kwaliteit, wat essentieel is voor succes, afhankelijk van een geoptimaliseerde invriesprotocol geschikte ijsdikte, dat van het grootste belang voor een goede beeldcontrast waarborgen. De optimale data-acquisitie strategie hangt af van het instrument en monster. Parameters optimaliseren omvat elektron dosis per beeld, tilt regeling en defocus. Het verwerven van een goede tomogram van een goede steekproef maakt alle verdere verwerking stappen makkelijker en zorgt voor een bevredigend eindresultaat.
Cryo-ET gecombineerd met subtomogram middeling en atoommodel montage geeft details over hoe eiwitcomplexen zijn gerangschikt in thEIR inheemse cellulaire omgeving. De techniek is geschikt voor het onderzoeken van de structuur van grote membraaneiwit complexen, zoals de ademhalingsketen supercomplexen (1,7 MDa), ATP synthase dimeren (2x500 kDa) of de nucleaire porie complex (~ 120 MDa) 8, 9, 17. De organisatie van ATP synthase dimeren in rijen kunnen niet worden waargenomen door hoge-resolutie technieken zoals röntgenkristallografie, NMR of single-deeltjes cryo-EM, omdat het dimeer rijen verstoord detergentextractie, hetgeen een noodzakelijke stap in het isoleren en zuivering van membraaneiwit complexen.
De opstelling van de ATP synthase in rijen langs dimeren cristae richels is een universeel organiserend beginsel van mitochondria in alle soorten. De proton-pompen complexen van de elektronentransport keten, met name complex I (NADH dehydrogenase), zijn in het membraan gebied weerszijden van de rijen 8,9. Deze organisatie van de respiratoire keten heeft grote invloed op de mitochondriale bio-energetica. Als het dimeer rijen niet kan vormen door de afwezigheid van dimeer-specifiek eiwit subeenheden, de cellen vertonen langere generatietijden en verminderde cellulaire film, zoals waargenomen in de gist mutant figuur 3 41. Met de groeiende belangstelling in mitochondriale ziekten, een gedetailleerde begrip van de moleculaire basis voor mitochondriale ultrastructuur en de functie is van het grootste belang. Electron cryo-tomografie een koppeling tussen eiwitstructuur bepaald met hoge-resolutie methoden, en de verdeling en plaatsing van deze eiwitten in het membraan op de schaal van nanometers. Dit maakt cryo-ET een essentieel instrument voor het begrijpen van mitochondriale structuur en functie in gezondheid en ziekte.
Verdere technische ontwikkelingen en verbeteringen in de cryo-ET bevatten eiwit-labeling strategieën om de positie van Protei identificerenn subeenheden in macromoleculaire complexen of de plaats van kleinere of minder duidelijk eiwitten (<0,5 MDa) in cellen. Bovendien hebben hybride EM verwerkingsmethoden die subtomogram gemiddelde combineren deeltje analyse of schroefvormige reconstructie recent vastgestelde eiwitstructuren naar ~ 8 A 42, 43. Deze verwerkingsmethoden zijn momenteel beperkt tot gezuiverde eiwitten, die goed gescheiden zijn in ijs of vormen spiraalvormige assemblages en zijn niet van toepassing op drukke cellulaire omgevingen zoals mitochondriën en cristae membranen. Voor het verzamelen van gegevens, zijn nieuwe computer-en hardware-instrumenten worden ontwikkeld om geautomatiseerde tomogram overname mogelijk te maken, verhogen het contrast en de totale benodigde elektronen dosis te verminderen. De enige fundamentele beperking in cryo-ET is stralingsschade aan het monster door de elektronenbundel. Dit betekent dat slechts zeer lage elektron doses kunnen worden gebruikt om de afbeelding van een tomografische tilt serie opnemen, wat resulteert in slechte signaal-to-ruisverhouding die uiteindelijk beperkt de haalbare resolutie. De nieuwe directe elektron detectoren, minder dan een jaar geleden uitgebracht, zijn op dit moment een revolutie op het gebied van single-deeltje cryo-EM 44, 45. Deze nieuwe detectoren bieden een hogere contrast en betere resolutie bij lagere doses elektronen. Voor elektronen cryo-tomografie, betekent dit dat tilt serie met kleinere stapgrootte of tweeassige tomogram kan worden verzameld zonder zorgen over de hoge stralingsschade (een CCD gelijk in electron dosis 5 rechtstreekse beelden elektron detector). De enorme hoeveelheden gegevens die door deze detectoren creëren hun eigen uitdagingen in data handling, bewerking en opslag, die moeten worden overwonnen.
Bovendien faseplaten die werken soortgelijke principes als die routinematig gebruikt in lichtmicroscopie om fasecontrast verbeteren, zijn in ontwikkeling voor transmissie elektronenmicroscopie 46, 47. Dit moet tomogrammen dichter verzamelen richten en derhalve een hogere resolutie, terwijl tegelijkertijd behouden lage resolutie nodig uitgelijnd zijn en interpretatie van tomografische volumes heeft. Tezamen zullen deze technologische vooruitgang sterk uitbreiden van het bereik van de biologische vragen die door cryo-ET kan worden aangepakt.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door het Max-Planck-Gesellschaft (KMD, BD, AWM, TB, TBB, DJM, en WK), de Cluster of Excellence Frankfurt "macromoleculaire complexen" gefinancierd door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (WK) en een postdoctoraal EMBO Long-Term Fellowship (VAMG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sucrose | Roth | 4621.2 | |
| Trehalose | Sigma-Aldrich | T9449 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Zymolase | biomol | Z1000.1 | |
| Density gradient medium | Sigma-Aldrich | D1556 or P1644 | |
| Protein A gold | Aurion | 810.111 | 10 nm |
| Ethane | Air Liquide | P0502S02R0A001 | |
| Nitrogen | Air Liquide | I4150RG | |
| Consumables | |||
| Filter paper | Whatman, GE Healthcare | 1004 090 | Nr 4 |
| Tweezers | Dumont | T506 | Non-magnetic, pattern #5 |
| EM combined test grid | Plano GmbH | S142 | grapite and gold islands on holey carbon film |
| Holey carbon grids | Quantifoil Micro Tools GmbH or C-flat | R2/2 300 Cu mesh | |
| Cryo grid boxes | Plano GmbH | 160-42 | Alternative home-made metal boxes |
| Potter | Sigma-Aldrich | P7984 | |
| Blender | Waring | 8011S | |
| Glass bead mill - bead beater | BioSpec Products | 1107900-105 | Including 0.5 mm beads |
| Ball-bearing (Balch) homogeniser | isobiotec | H8 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 46915 | Sorvall RC6+ |
| Glow-discharge apparatus | Bal-Tec A.G. | CTA 010 | |
| Grid vitrification device | FEI, Gatan or Leica | Alternative home-made plunger | |
| Transmission electron microscope | FEI or Jeol | 300 keV | |
| Direct electron detector | Gatan | K2 summit | 4k x 4k pixels, counted mode |
| Charge coupled device (CCD) | Gatan | US4000 | 4k x 4k pixels (alternative to Direct electron detector) |
| Energy filter | Gatan or Jeol | ||
| Software | |||
| Image acquisition software | Gatan | ||
| Tomogram acquisition software | Gatan, FEI, USCF, or UC-Boulder | 4 alternatives | |
| Tomogram processing software | FEI, UCSF or UC-Boulder | 3 alternatives | |
| Subtomogram averaging software | UC-Boulder, or University of Basel | 2 alternatives | |
| Tomogram visualization software | UC-Boulder, FEI, or University of Utah | 3 alternatives | |
| Visualization software plugin | Goethe university | http://www.biophys.uni-frankfurt.de/frangakis/ | |
| Structure visualization software | UCSF | http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ | |
| Numerical calculation software | MathWorks | http://www.mathworks.de/academia/ | |
References
- Dickson, V. K., Silvester, J. A., Fearnley, I. M., Leslie, A. G., Walker, J. E. On the structure of the stator of the mitochondrial ATP synthase. The EMBO journal. 25, 2911-2918 (2006).
- Rees, D. M., Leslie, A. G., Walker, J. E. The structure of the membrane extrinsic region of bovine ATP synthase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 21597-21601 (2009).
- Watt, I. N., Montgomery, M. G., Runswick, M. J., Leslie, A. G., Walker, J. E. Bioenergetic cost of making an adenosine triphosphate molecule in animal mitochondria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 16823-16827 (2010).
- Baker, L. A., Watt, I. N., Runswick, M. J., Walker, J. E., Rubinstein, J. L. Arrangement of subunits in intact mammalian mitochondrial ATP synthase determined by cryo-EM. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 11675-11680 (2012).
- Allen, R. D., Schroeder, C. C., Fok, A. K. An investigation of mitochondrial inner membranes by rapid-freeze deep-etch techniques. The Journal of cell biology. 108, 2233-2240 (1989).
- Strauss, M., Hofhaus, G., Schroder, R. R., Kühlbrandt, W. Dimer ribbons of ATP synthase shape the inner mitochondrial membrane. The EMBO journal. 27, 1154-1160 (2008).
- Dudkina, N. V., Oostergetel, G. T., Lewejohann, D., Braun, H. P., Boekema, E. J. Row-like organization of ATP synthase in intact mitochondria determined by cryo-electron tomography. Biochimica et biophysica acta. 1797, 272-277 (2010).
- Davies, K. M., Anselmi, C., Wittig, I., Faraldo-Gomez, J. D., Kühlbrandt, W. Structure of the yeast F1Fo-ATP synthase dimer and its role in shaping the mitochondrial cristae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 13602-13607 (2012).
- Davies, K. M., et al. Macromolecular organization of ATP synthase and complex I in whole mitochondria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 14121-14126 (2011).
- Wurm, C. A., et al. Nanoscale distribution of mitochondrial import receptor Tom20 is adjusted to cellular conditions and exhibits an inner-cellular gradient. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 13546-13551 (2011).
- Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. The Journal of cell biology. 190, 165-175 (2010).
- Austin, J. R. 2nd, Staehelin, L. A. Three-dimensional architecture of grana and stroma thylakoids of higher plants as determined by electron tomography. Plant physiology. 155, 1601-1611 (2011).
- Ohta, K., et al. Beam deceleration for block-face scanning electron microscopy of embedded biological tissue. Micron. 43, 612-620 (2012).
- Buzhynskyy, N., Sens, P., Prima, V., Sturgis, J. N., Scheuring, S. Rows of ATP synthase dimers in native mitochondrial inner membranes. Biophysical journal. 93, 2870-2876 (2007).
- Larabell, C. A., Nugent, K. A. Imaging cellular architecture with X-rays. Current opinion in structural biology. 20, 623-631 (2010).
- Miao, J., Hodgson, K. O., Sayre, D. An approach to three-dimensional structures of biomolecules by using single-molecule diffraction images. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 6641-6645 (2001).
- Maimon, T., Elad, N., Dahan, I., Medalia, O. The human nuclear pore complex as revealed by cryo-electron tomography. Structure. 20, 998-1006 (2012).
- Meyerson, J. R., et al. Determination of molecular structures of HIV envelope glycoproteins using cryo-electron tomography and automated sub-tomogram averaging. Journal of visualized experiments : JoVE. (58), (2011).
- Chen, S., et al. Electron cryotomography of bacterial cells. Journal of visualized experiments : JoVE. (39), (2010).
- Bharat, T. A., et al. Structural dissection of Ebola virus and its assembly determinants using cryo-electron tomography. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 4275-4280 (2012).
- Bennett, A. E., et al. Ion-abrasion scanning electron microscopy reveals surface-connected tubular conduits in HIV-infected macrophages. PLoS pathogens. 5, e1000591 (2009).
- Liu, J., et al. Cellular architecture of Treponema pallidum: novel flagellum, periplasmic cone, and cell envelope as revealed by cryo electron tomography. Journal of molecular biology. 403, 546-561 (2010).
- Liu, J., et al. Intact flagellar motor of Borrelia burgdorferi revealed by cryo-electron tomography: evidence for stator ring curvature and rotor/C-ring assembly flexion. Journal of bacteriology. 191, 5026-5036 (2009).
- Patla, I., et al. Dissecting the molecular architecture of integrin adhesion sites by cryo-electron tomography. Nature cell biology. 12, 909-915 (2010).
- Heuser, T., et al. Cryoelectron tomography reveals doublet-specific structures and unique interactions in the I1 dynein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, E2067-E2076 (2012).
- Briggs, J. A. Structural biology in situ-the potential of subtomogram averaging. Current opinion in structural biology. 23, (2013).
- Cheng, D., Mitchell, D. R. G., Shieh, D. B., Braet, F. Current Microscopy Contributions to Advances in Science and Technology. Méndez-Vilas, A. 2, Formatex. (2012).
- Brust, D., et al. Cyclophilin D links programmed cell death and organismal aging in Podospora anserina. Aging cell. 9, 761-775 (2010).
- Gregg, C., Kyryakov, P., Titorenko, V. I. Purification of mitochondria from yeast cells. Journal of visualized experiments : JoVE. (30), (2009).
- Bhaskaran, S., et al. Breaking Caenorhabditis elegans the easy way using the Balch homogenizer: an old tool for a new application. Analytical biochemistry. 413, 123-132 (2011).
- Pavlov, P. F., Rudhe, C., Bhushan, S., Glaser, E. In vitro and in vivo protein import into plant mitochondria. Methods in molecular biology. 372, 297-314 (2007).
- Graham, J. M., et al. Ch. 3, Current protocols in cell biology. Bonifacino, J. S. , John Wiley and Sons. (2001).
- Zheng, S. Q., et al. UCSF tomography: an integrated software suite for real-time electron microscopic tomographic data collection, alignment, and reconstruction. Journal of structural biology. 157, 138-147 (2007).
- Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. Journal of structural biology. 152, 36-51 (2005).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of structural biology. 116, 71-76 (1996).
- Pruggnaller, S., Mayr, M., Frangakis, A. S. A visualization and segmentation toolbox for electron microscopy. Journal of structural biology. 164, 161-165 (2008).
- Scheres, S. H., Chen, S. Prevention of overfitting in cryo-EM structure determination. Nature methods. 9, 853-854 (2012).
- Pettersen, E. F., et al. UCSF Chimera--a visualization system for exploratory research and analysis. Journal of computational chemistry. 25, 1605-1612 (2004).
- Dautant, A., Velours, J., Giraud, M. F. Crystal structure of the Mg.ADP-inhibited state of the yeast F1c10-ATP synthase. The Journal of biological chemistry. 285, 29502-29510 (2010).
- Carbajo, R. J., et al. Structure of the F1-binding domain of the stator of bovine F1Fo-ATPase and how it binds an alpha-subunit. Journal of molecular biology. 351, 824-838 (2005).
- Paumard, P., et al. The ATP synthase is involved in generating mitochondrial cristae morphology. The EMBO journal. 21, 221-230 (2002).
- Bharat, T. A., et al. Structure of the immature retroviral capsid at 8 A resolution by cryo-electron microscopy. Nature. 487, 385-389 (2012).
- Bartesaghi, A., Lecumberry, F., Sapiro, G., Subramaniam, S. Protein secondary structure determination by constrained single-particle cryo-electron tomography. Structure. 20, 2003-2013 (2012).
- Bai, X. C., Fernandez, I. S., McMullan, G., Scheres, S. H. Ribosome structures to near-atomic resolution from thirty thousand cryo-EM particles. eLife. 2, e00461 (2013).
- Li, X., et al. Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM. Nature methods. , (2013).
- Danev, R., Nagayama, K. Optimizing the phase shift and the cut-on periodicity of phase plates for TEM. Ultramicroscopy. 111, 1305-1315 (2011).
- Walter, A., et al. Practical aspects of Boersch phase contrast electron microscopy of biological specimens. Ultramicroscopy. 116, 62-72 (2012).
