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Biology

इलेक्ट्रॉन क्रायो टोमोग्राफी द्वारा mitochondria में एटीपी synthase dimers के दृश्य

Published: September 14, 2014 doi: 10.3791/51228
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Structural Biology, Max Planck Institute of Biophysics

Summary

हम इकट्ठा और पूरे माइटोकॉन्ड्रिया की प्रक्रिया इलेक्ट्रॉन क्रायो tomograms करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं. तकनीक देशी जैविक झिल्लियों में बड़ी झिल्ली प्रोटीन परिसरों की संरचना, समारोह, और संगठन में विस्तृत अंतर्दृष्टि प्रदान करता है.

Abstract

इलेक्ट्रॉन क्रायो टोमोग्राफी ऐसे आणविक विस्तार में कोशिकाओं, organelles, झिल्ली पुटिकाओं, या वायरस के रूप में जैविक नमूने, के तीन आयामी संरचना visualizing में सक्षम संरचनात्मक जीव विज्ञान में एक शक्तिशाली उपकरण है. इस लक्ष्य को हासिल करने के लिए, जलीय नमूना तेजी से एक बंद करने वाली देशी, स्थिर हाइड्रेटेड राज्य में यह बरकरार रखता है जो तरल एटैन, में vitrified है. इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप में, झुकाव श्रृंखला 3 डी tomograms खंगाला रहे हैं जिसमें से तरल नाइट्रोजन तापमान, पर दर्ज की गई हैं. tomographic मात्रा का संकेत करने वाली शोर अनुपात स्वाभाविक रूप से कम है. पहचानने, आवर्ती सुविधाओं व्यक्ति subvolumes, बाहर कटौती गठबंधन और शोर को कम करने के लिए औसत निकाला जाता है जिसके द्वारा subtomogram औसत से बढ़ा रहे हैं. इस तरह, 3 डी प्राप्त किया जा सकता 2 एनएम या बेहतर के एक संकल्प के साथ नक्शे. 3 डी की मात्रा को उपलब्ध उच्च संकल्प संरचनाओं का एक फिट तो उनके पैतृक वातावरण में प्रोटीन परिसरों के परमाणु मॉडल का उत्पादन. यहाँ हम हम इलेक्ट्रॉन क्रायो tomograp उपयोग कैसे दिखानेहरियाणा माइटोकॉन्ड्रिया में बड़ी झिल्ली प्रोटीन परिसरों के बगल में संगठन का अध्ययन करने के लिए. हम जटिल मैं बेतरतीब ढंग पंक्तियों के दोनों तरफ झिल्ली क्षेत्रों में वितरित किया जाता है, जबकि एटीपी synthases, भीतरी झिल्ली cristae की अत्यधिक घुमावदार apices साथ dimers की पंक्तियों में संगठित कर रहे हैं. Subtomogram औसत से हम cristae झिल्ली के भीतर mitochondrial एटीपी synthase डिमर की एक संरचना प्राप्त की.

Introduction

माइटोकॉन्ड्रिया कोशिका की बिजली घरों हैं. रासायनिक बंधन ऊर्जा में भीतरी mitochondrial झिल्ली भर में एक विद्युत प्रोटॉन ढाल परिवर्तित करके, mitochondrial एटीपी synthase सेलुलर प्रक्रियाओं है कि ड्राइव एटीपी की सबसे पैदा करता है. Mitochondrial ऊर्जा रूपांतरण के पीछे तंत्र को समझने के लिए, हम बगल में एटीपी synthase की संरचना निर्धारित करने के लिए, और यह व्यवस्था की है और भीतरी mitochondrial झिल्ली में वितरित किया जाता है कैसे पता लगाने की जरूरत है. पूरे परिसर 4 की mitochondrial एटीपी synthase घटकों 1-3 और कम संकल्प नक्शे के सबसे उच्च संकल्प संरचनाओं उपलब्ध हैं, यद्यपि यह झिल्ली में काम कर एंजाइम की संरचना और रचना की स्थापना के लिए महत्वपूर्ण है. भीतरी mitochondrial झिल्ली में एटीपी synthase के वितरण में व्यापक रूप से यादृच्छिक मान लिया, लेकिन 6 इस टी नहीं है संकेत दिया कि 5 और हमारे अपने प्रारंभिक परिणाम को खोजने के लिए एक प्रारंभिक किया गया हैवह मामला. इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला के प्रोटॉन पंप या तो किनारे पर स्थित होना दिखाई देते हैं, जबकि बाद के हमारे समूह से अध्ययन और दूसरों 7, एटीपी synthase भीतरी mitochondrial झिल्ली cristae 8 से कसकर घुमावदार लकीरें साथ dimers की लंबी पंक्तियों में व्यवस्था की है कि पुष्टि की है पंक्तियों 9 की. यह व्यवस्था mitochondrial ऊर्जा रूपांतरण के तंत्र के लिए महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है.

हम इस व्यवस्था का निर्धारण किया जाता है तकनीक इलेक्ट्रॉन क्रायो टोमोग्राफी (क्रायो ईटी) है. क्रायो एट वर्तमान में आणविक प्रस्ताव पर कोशिकाओं, सेलुलर डिब्बों या organelles की सटीक तीन आयामी (3 डी) संस्करणों उद्धार कि एकमात्र तरीका है. झिल्ली अच्छा विपरीत के साथ दिखाई देते हैं और 3 डी tomographic मात्रा में पता लगाने के लिए आसान कर रहे हैं क्योंकि क्रायो एट, जैविक झिल्लियों में बड़े परिसरों के अध्ययन के लिए विशेष रूप से उपयुक्त है.

अन्य तरीकों कोशिकाओं या organell की 3 डी संरचना का अध्ययन करने के लिएतों आणविक विस्तार प्रदान नहीं करते हैं. सुपर संकल्प प्रकाश माइक्रोस्कोपी 10, 11 स्थिति या एनएम के दसियों की एक परिशुद्धता के साथ ब्याज की प्रोटीन से जुड़े प्रकाश उत्सर्जक लेबल के बीच दूरी खुलासा में शानदार है, लेकिन यह भी कम संकल्प पर, प्रोटीन खुद की संरचना प्रकट नहीं करता . प्लास्टिक एम्बेडेड जैविक नमूने की इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी 13 को स्कैन करके धारावाहिक वर्गों 12 या ब्लॉक चेहरा इमेजिंग के ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी सेलुलर मात्रा के कम संकल्प विचार प्रदान करते हैं लेकिन इसी तरह आणविक विस्तार प्रकट नहीं करते. परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी 14 सिद्धांत में आणविक या यहां तक कि परमाणु संकल्प उद्धार, लेकिन केवल एक atomically फ्लैट, ठोस समर्थन पर वस्तुओं की सतह पर कर सकते हैं. अंत में, एक्स रे टोमोग्राफी 15 या मुक्त इलेक्ट्रॉन लेजर से तीव्र एक्स रे दालों के बिखरने 16 ऐसे मीटर की ऊंचाई पर पूरे कोशिकाओं या अंगों के रूप में बड़े, जटिल, aperiodic वस्तुओं की संरचना को प्रकट करने की संभावना नहीं हैनिकट भविष्य में olecular संकल्प. इस प्रकार वर्तमान में, नैनोमीटर प्रस्ताव पर कोशिकाओं या अंगों के 3D संरचना के अध्ययन के लिए एट क्रायो का कोई विकल्प नहीं है.

क्रायो एट परमाणु ताकना जटिल 17, इन्फ्लूएंजा कील 18 परिसरों सहित झिल्ली जुड़े प्रोटीन विधानसभाओं की संरचना और रचना की जांच के लिए पसंद की विधि, और flagella मोटर प्रोटीन 22, 23 बल्कि पूरे बैक्टीरियल कोशिकाओं 19 का संगठन है कोशिकाओं 20-23 में एचआईवी जैसे रोगजनक वायरस की और प्रवेश. क्रायो एट एक्टिन तंतु 24 या axonemes 25 सहित filamentous प्रोटीन और सेल में उनकी बातचीत, दृश्यमान करने के लिए अमूल्य है. संकल्प दोहराया, नियमित रूप से सुविधाओं की subvolumes एकल कण छवि समर्थक द्वारा एक tomographic मात्रा से बाहर कटौती और औसत निकाला जाता है जिससे subtomogram, 26 के औसत से 2 एनएम या बेहतर करने के लिए बढ़ाया जा सकता हैcessing तकनीक.

क्रायो एट एक संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (मंदिर) में अलग झुकाव कोण पर लिया एक पतली नमूना (<250nm) के प्रक्षेपण छवियों की एक श्रृंखला का अधिग्रहण शामिल है. मामले से दृढ़ता से बातचीत जो इलेक्ट्रॉनों, एक बार से अधिक नहीं हुए हैं कि इतने नमूना पतली होना चाहिए. एकाधिक बिखरने की व्याख्या करने के लिए जिसके परिणामस्वरूप छवियों कठिन बना देता है और इसके विपरीत कम कर देता है. चयनित नमूना क्षेत्र की छवियाँ एक दूसरे के सापेक्ष गठबंधन और नमूना की एक 3 डी मात्रा पैदा करने, एक उपयुक्त कंप्यूटर प्रोग्राम द्वारा एक 3 डी अंतरिक्ष में पेश कर रहे हैं. छवियों के संरेखण ठंड से पहले नमूने के साथ मिलाया जाता है जो सोने मापकला मार्करों, द्वारा सहायता प्राप्त है. आदर्श रूप में 10 या उससे अधिक समान रूप से वितरित मापकला मार्कर एक अच्छा संरेखण को प्राप्त करने के लिए प्रत्येक छवि में मौजूद होना चाहिए.

आणविक विस्तार का पालन करने के लिए, नमूने डुबकी जमी उनके देशी हाइड्रेटेड राज्य को बरकरार रखता है, जो तरल एटैन में हैं. तरल में ठंडएटैन इतनी जल्दी है (~ 5 ° 10 सी / सेकंड) पानी मणिभ लेकिन एक vitrified, कांच की तरह राज्य में रहता नहीं है कि 27. आइस क्रिस्टल गठन हर्जाना संवेदनशील जैविक संरचनाओं. जैविक नमूने विकिरण क्षति से पीड़ित के रूप में, नमूना बर्दाश्त कर सकते हैं बिखरने घटनाओं की कुल संख्या की एक सीमा होती है. छवियाँ इस प्रकार कम खुराक मोड में अर्जित कर रहे हैं: ब्याज की एक क्षेत्र 1 ई नीचे एक इलेक्ट्रॉन खुराक के साथ कम बढ़ाई (1,500X) में पहचाना जाता है - / एनएम 2 (खोज मोड). छवि तो ब्याज (फोकस मोड) के क्षेत्र से दूर, एक उच्च बढ़ाई केंद्रित है. एक छवि का अधिग्रहण किया है, केवल जब ब्याज के क्षेत्र में एक उच्च इलेक्ट्रॉन खुराक (जोखिम मोड) के साथ विकिरणित है.

यहाँ, हम एक उदाहरण के रूप में आंतरिक mitochondrial झिल्ली में एटीपी synthase dimers का उपयोग, इकट्ठा करने और प्रक्रिया इलेक्ट्रॉन क्रायो tomograms करने का एक सिंहावलोकन प्रस्तुत करते हैं. निम्नलिखित प्रोटोकॉल क्रायो एट के लिए माइटोकॉन्ड्रिया तैयार करने के लिए कैसे का वर्णन करता है, कैसे स्थापित करने के लिएऔर एक विशिष्ट कुल इलेक्ट्रॉन खुराक, और कैसे ब्याज के क्षेत्र की एक 3 डी की मात्रा प्राप्त करने के लिए झुकाव श्रृंखला पर कार्रवाई करने के साथ एक झुकाव श्रृंखला इकट्ठा. प्रक्रिया का अवलोकन चित्रा 1 में सचित्र है.

Protocol

विभेदकों centrifugation द्वारा कोशिकाओं या ऊतकों से माइटोकॉन्ड्रिया के 1. तैयारी

यह खंड यूकेरियोटिक जीवों से बरकरार माइटोकॉन्ड्रिया के अलगाव के लिए एक सामान्य प्रक्रिया का वर्णन करता है. बफर घटकों और centrifugation गति सटीक प्रत्येक ऊतक के लिए अनुकूलित करने की आवश्यकता / प्रजातियों का अध्ययन किया.

  1. Isotonic बफर में कोशिकाओं को तोड़ (जैसे, 250 मिमी सूक्रोज, 10 मिमी HEPES पीएच 7.4), एक गिलास मनका मिल का उपयोग (फंगल फुई) 28, enzymatic सेल दीवार (Saccharomyces cerevisiae) 29, एक खील homogenizer के पाचन (एकल सेल यूकैर्योसाइटों / संस्कृति कोशिकाओं / नेमाटोड) 30, या एक ब्लेंडर (जानवर या संयंत्र के ऊतकों) 31.
  2. कम गति centrifugation (2,000 XG, 4 डिग्री सेल्सियस, 10 मिनट) के बाद मलमल के माध्यम से निस्पंदन द्वारा सेल मलबे को हटाने.
  3. 9000 XG, 4 डिग्री सेल्सियस (उच्च गति centrifugation द्वारा सतह पर तैरनेवाला और गोली माइटोकॉन्ड्रिया लीजिए, 10 मिनट).
  4. जहां आवश्यक हो, mitochondrial अंश 32 के अतिरिक्त शुद्धि के लिए एक isotonic घनत्व कदम ढाल का उपयोग करें.

इलेक्ट्रॉन क्रायो टोमोग्राफी के लिए माइटोकॉन्ड्रिया के 2. तैयारी

निम्नलिखित खंड क्रायो एट के लिए जमे हुए हाइड्रेटेड नमूने प्राप्त करने के लिए कैसे करें. नोट: विधि गंभीर त्वचा जलता पैदा कर सकता है जो बेहद ठंडे तरल नाइट्रोजन और एटैन का उपयोग शामिल है. सुरक्षा काले चश्मे और क्रायो संरक्षण दस्ताने पहनना आवश्यक है. भी ज्वलनशील है जो तरल एटैन, एक धूआं हुड में नियंत्रित किया जाना चाहिए.

  1. 250 मिमी Trehalose, लगभग 5 मिलीग्राम / एमएल कुल प्रोटीन की एक एकाग्रता के लिए 7.4 पीएच में 10 मिमी HEPES बफर में pelleted माइटोकॉन्ड्रिया Resuspend.
  2. ग्लो निर्वहन छेददार कार्बन ईएम ग्रिड, निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक वैक्यूम डिवाइस में कार्बन तरफ ऊपर,.
  3. एक तरल नाइट्रोजन शांत के भीतर की ओर पर एटैन गैस की एक धारा का निर्देशन द्वारा एटैन के कुछ मिलीलीटर दव्रएड एल्यूमीनियम कंटेनर.
  4. Mitochondrial निलंबन के साथ 1 और तुरंत चिमटी में आयोजित एक चमक निर्वहन ईएम ग्रिड से 3 μl लागू होते हैं: प्रोटीन एक संयुग्मित सोने मापकला निलंबन 1 मिलाएं.
  5. एक कांच में रूपांतर डिवाइस, जैसे, एक घर का बना गिलोटिन में चिमटी रखें. फिल्टर पेपर की एक कील के साथ (~ 5 सेकंड या तरल बंद हो जाता है फैल जब तक) और तुरंत ट्रिगर जारी करके तरल एटैन में ग्रिड उतर अतिरिक्त तरल बंद दाग.
  6. तरल नाइट्रोजन में तरल एटैन से ग्रिड स्थानांतरण. स्थानांतरण के दौरान, फिल्टर पेपर के साथ ग्रिड से अतिरिक्त एटैन हटा दें. तरल एटैन में फिल्टर पेपर के एक पच्चर के आकार का टुकड़ा की नोक रखें. तरल एटैन बढ़ जाता है, धीरे फिल्टर पेपर ऊपर ग्रिड खींचें लेकिन तरल सामने नीचे रहते हैं. तरल एटैन केशिका क्रिया द्वारा ग्रिड से हटा दिया है और सभी तरल एटैन हटा दिया गया है एक बार, तुरंत तरल नाइट्रोजन में ग्रिड हस्तांतरण है.
  7. एक ग्रिड भंडारण बॉक्स में vitrified ग्रिड जगह एकएन डी के रूप में उपयुक्त बाद में उपयोग के लिए तरल नाइट्रोजन के तहत दुकान.

Tomographic ज़ोर सीरीज के 3 रिकॉर्डिंग

निम्न अनुभाग की स्थापना की और एक के बाद स्तंभ ऊर्जा फिल्टर और सीसीडी कैमरा से लैस एक Polara इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के साथ एक माइटोकांड्रिया की एक tomographic झुकाव श्रृंखला एकत्र करने के लिए कैसे करें. इसी तरह के प्रोटोकॉल सीसीडी या प्रत्यक्ष इलेक्ट्रॉन डिटेक्टर कैमरों से लैस सभी इलेक्ट्रॉन क्रायो सूक्ष्मदर्शी के साथ किया जाता है.

  1. माइक्रोस्कोप संरेखित
    1. परीक्षण डालें नमूना जैसे, ग्रेफाइट और छेददार कार्बन फिल्म पर सोने द्वीप.
    2. माइक्रोस्कोप की कम खुराक प्रणाली में चयन खोज मोड.
    3. Eucentric ऊंचाई को नमूना ले आओ. नमूना धारक झुकने जब यह न्यूनतम XY आंदोलन की बात है. , 0 ° झुकाव पर ब्याज की एक बिंदु का केंद्र 20 डिग्री करने के लिए मंच झुकाव और जेड ऊंचाई बदलकर बिंदु केंद्र रहे हैं. 0 ° पर लौटें और पार्श्व ऑफसेट कम से कम है जब तक दोहराएँ.
    4. चयन करेंजोखिम मोड. एक रण इकट्ठा करने के लिए वांछित बढ़ाई चुनें (उदाहरण के लिए, पिक्सेल आकार नमूना एनएम डिटेक्टर ≈ 0.6 पर 25,000X).
    5. एक छोटे कंडेनसर एपर्चर (50-70 मिमी) चुनें और किरण इमेजिंग डिवाइस से सिर्फ व्यापक है और 60 ए के एक पिक्सेल पढ़ने देता है ताकि एक स्थान आकार और किरण तीव्रता का चयन - / पिक्सेल (सीसीडी) या 14 ई - / पिक्सेल / सेक (प्रत्यक्ष इलेक्ट्रॉन डिटेक्टर, गिनती मोड).
    6. केंद्र कंडेनसर एपर्चर.
    7. गाऊसी फोकस जैसे, कम से कम इसके विपरीत की बात का पता लगाएं. रीसेट माइक्रोस्कोप defocus पढ़ने और सही धुरी अंक और निर्माता के निर्देशों के अनुसार रोटेशन केंद्र.
    8. रण रिकॉर्डिंग के लिए वांछित defocus में डायल. नोट: कम defocus (2-4 माइक्रोन) विपरीत की कीमत पर संकल्प बढ़ जाती है, जबकि उच्च defocus (8 माइक्रोन), इसके विपरीत बढ़ जाती है लेकिन संकल्प कम कर देता है.
    9. एक खाली छेद पर, के अनुसार निर्माता की एक नई लाभ संदर्भ पैदा करते हैं और ऊर्जा फिल्टर संरेखितनिर्देश.
    10. खोज और प्रदर्शन मोड संरेखित करें. जोखिम मोड में, ब्याज की एक बिंदु केंद्र और मोड खोज करने के लिए स्विच. चयन 1,500X की बढ़ाई (डिटेक्टर पर नमूना के 0.033 माइक्रोन / पिक्सेल) और (बढ़ा विपरीत के लिए) 100 माइक्रोन के defocus. छवि पारी coils का उपयोग केंद्र के लिए ब्याज वापस की बात लाओ.
    11. / पिक्सेल (सीसीडी) या ~ 8 - ए - बीम इमेजिंग डिवाइस से सिर्फ व्यापक है और 20 ई ~ के एक पिक्सेल पढ़ने देता है तो खोज मोड में, स्थान आकार और किरण तीव्रता को समायोजित / पिक्सेल / सेक (प्रत्यक्ष इलेक्ट्रॉन डिटेक्टर, ) मोड गिनती.
  2. एक अच्छा नमूना क्षेत्र ढूँढना
    1. तरल नाइट्रोजन तापमान में इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप में जमी हाइड्रेटेड माइटोकॉन्ड्रिया के साथ ग्रिड डालें (ईएम निर्माता के निर्देशों को देखें).
    2. खोज मोड में, उचित बर्फ मोटाई और नमूना गुणवत्ता के क्षेत्रों के लिए ग्रिड खोज. रण संग्रह के लिए उपयुक्तता का निर्धारण करने के लिए आशाजनक क्षेत्रों में से एक 6 सेकंड खोज छवि ले लो. बीओटीज भीतरी और बाहरी mitochondrial झिल्ली इस बढ़ाई दिखाई जानी चाहिए.
  3. एक tomographic ज़ोर सीरीज की रिकॉर्डिंग
    1. एक अच्छा नमूना क्षेत्र में पाया जाता है एक बार 60 डिग्री के जोखिम के किसी भी बाधा के बिना उपलब्ध है कि अधिक से अधिक झुकाव सीमा निर्धारित या ग्रिड सलाखों या बर्फ गांठ से क्षेत्र ध्यान केंद्रित करने के लिए ±, चरण झुकाव.
    2. / CCDs या 6-8 ई के लिए पिक्सेल - - इसी तरह की उपस्थिति के पास बर्फ से भरे छेद पर है, इसलिए प्रत्येक दर्ज की छवि 30-50 ई के एक इलेक्ट्रॉन खुराक है बीम तीव्रता या छवि अधिग्रहण के समय जोखिम मोड को बदलने के लिए और समायोजित / पिक्सेल / मोड गिनती प्रत्यक्ष इलेक्ट्रॉन डिटेक्टरों है.
    3. एक 60 डिग्री छवि के साथ कि 0 डिग्री पर हासिल कर ली 1 सेकंड छवि के लिए औसत इलेक्ट्रॉन गिनती विभाजित करके खुराक वितरण अनुपात (मैं 0 / मैं 60) की गणना. इस अनुपात (जोखिम समय = 1 / सी झुकाव कोण में वृद्धि के साथ छवि प्रति एक निरंतर इलेक्ट्रॉन गिनती बनाए रखने के लिए आवश्यक समय जोखिम में वृद्धि का वर्णनओएस (α) एन जहां (मैं 0 / मैं 60) = 2 एन). अनुपात भी बर्फ की मोटाई का एक अच्छा संकेत के रूप में कार्य करता है. माइटोकॉन्ड्रिया का अच्छा tomograms आमतौर पर एक मैं 0 / मैं 60 = 2.3-2.6 के साथ दर्ज हैं.
    4. एक खाली छेद पर, जोखिम मोड में एक 1 सेकंड छवि हासिल करने और एक 2 प्रति इलेक्ट्रॉन गिनती ध्यान दें. खाते में खुराक वितरण अनुपात ले रहा है, एक विशिष्ट कुल इलेक्ट्रॉन खुराक के लिए दर्ज किया जा सकता है कि छवियों की कुल संख्या की गणना (जैसे, <40 ई - संरचना निर्धारण के लिए / A 2 और ~ 160 ई - आकृति विज्ञान के लिए / A 2).
    5. कुल झुकाव रेंज विभाजित करके रण संग्रह के लिए उपयुक्त झुकाव अंतराल का निर्धारण करते हैं (उदाहरण के लिए, ± 60 डिग्री के लिए 120 डिग्री) 3.3.4 में गणना की छवियों की कुल संख्या से.
  4. सेट अप और उपयुक्त स्वत: डेटा संग्रह सॉफ्टवेयर का उपयोग 3 ऊपर निर्धारित मापदंडों के साथ एक रण रिकॉर्ड3, 34. ज़ोर श्रृंखला आमतौर पर ± 20 डिग्री पर शुरू कर दिया और बढ़ती इलेक्ट्रॉन खुराक द्वारा नष्ट हो जाता है जो कम झुकाव छवियों की जानकारी सामग्री को अधिकतम करने के लिए उच्च tilts तक पहुँचने से पहले 0 डिग्री के माध्यम से जाना जाता है.

4 निर्माण और tomographic वॉल्यूम की विभाजन

इस अनुभाग में माइटोकॉन्ड्रिया की tomographic संस्करणों झुकाव श्रृंखला और मात्रा सामान्य को देखने के लिए मौजूद हैं, कैसे से उत्पन्न कर रहे हैं कैसे करें.

  1. एक उपयुक्त निर्देशिका के लिए tomographic झुकाव श्रृंखला बचाओ. एक छवि ढेर पैदा करते हैं और मलेरिया अनुसंधान केंद्र के ढेर को .dm3, .dm4 या .tif फ़ाइलों को परिवर्तित जो ऐसे dm2mrc या tif2mrc (IMOD पैकेज) के रूप में खुला स्रोत सॉफ्टवेयर, के साथ एक उपयुक्त फ़ाइल स्वरूप, की. एमआरसी के ढेर IMOD 35 के साथ tomographic पुनर्निर्माण के लिए आवश्यक हैं. अन्य संकुल के विभिन्न स्वरूपों की आवश्यकता होती है.
  2. (छवियों को संरेखित और IMOD ट्यूटोरियल में विस्तृत चरण का पालन करते हुए एक रण उत्पन्न
  3. IMOD साथ वितरित गैर रेखीय anisotropic प्रसार फिल्टर का उपयोग रण के विपरीत बढ़ाएँ. इस फिल्टर झिल्ली और ऐसे एटीपी synthase रूप झिल्ली जुड़े कणों के लिए अच्छी तरह से काम करता है.
  4. दृश्य के लिए, मैन्युअल खंड रण, जैसे अमीरा व्यावसायिक रूप से उपलब्ध कार्यक्रमों का उपयोग. भीतरी या बाहरी झिल्ली को इसी voxels निरुपित और एक सतह उत्पन्न करते हैं. AMIRA 36 के लिए EM-पैकेज प्लगइन में क्लिकर विकल्प का प्रयोग एटीपी synthase कणों के स्थान चिह्नित.

5 Subtomogram एटीपी synthase dimers की औसत और एक्स रे संरचनाएं की फिटिंग

निम्नलिखित खंड एटीपी synthase dimers की subtomogram मूविंग प्राप्त किया जा सकता कैसे करें.

  1. जैसे 'भाग के रूप में इनपुट और एक उपयुक्त सॉफ्टवेयर पैकेज के रूप में चिह्नित कणों का उपयोगइलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी 'कार्यक्रम के लिए ICLE आकलन, एक subtomogram औसत की गणना.
  2. एक संकल्प आकलन के लिए, फूरियर खोल सहसंबंध 37 से दो स्वतंत्र रूप से निर्धारित subtomogram मूविंग की तुलना करें.
  3. कठोर शरीर द्वारा subtomogram औसत में उपलब्ध, गोदी में जाना एक्स रे संरचनाओं, या तो स्वयं फिटिंग या इस तरह के कार्यक्रम कल्पना 38 में उन के रूप में स्वत: अनुक्रमिक डॉकिंग दिनचर्या का उपयोग करें.

Representative Results

माइटोकॉन्ड्रिया के इलेक्ट्रॉन क्रायो tomograms स्पष्ट रूप से (चित्रा 2) organelle की 3 डी आकारिकी प्रकट करते हैं. एक tomographic मात्रा में झिल्लियों के मैनुअल विभाजन एक माइटोकांड्रिया में cristae की संरचना को दिखाता है. कुछ प्रोटीन घटकों की कमी है कि अलग खमीर पीटकर उपभेदों से माइटोकॉन्ड्रिया इमेजिंग द्वारा, cristae आकारिकी पर इन प्रोटीन के प्रभाव का आकलन करके कर सकते हैं. 3 एटीपी synthase सबयूनिट ई की कमी एक खमीर तनाव से एक माइटोकांड्रिया से पता चलता है. एटीपी synthase परिसर के इस घटक mitochondrial एटीपी synthase के dimerization के लिए आवश्यक है. इस तनाव से mitochondria (चित्रा 2) wildtype माइटोकॉन्ड्रिया के सामान्य तहदार cristae कमी और बजाय भीतरी झिल्ली डिब्बों की एक संख्या में होते हैं. इन डिब्बों cristae की या तो रहित हैं या छोटे गुब्बारे के आकार झिल्ली invaginations (चित्रा 3) के होते हैं.

टॉम मेंograms इस मामले एटीपी synthase dimers में अच्छा इसके विपरीत, बड़े mitochondrial प्रोटीन परिसरों, साथ, आसानी से दिखाई दे रहे हैं (चित्रा 4, मूवी 1). (; मूवी 2 चित्रा 5) परिसरों की संरचनाओं subtomogram औसत से 2-3 एनएम संकल्प पर निर्धारित किया जा सकता है. (; मूवी 3 चित्रा 6) औसत मात्रा में झिल्ली में एक दूसरे के रिश्तेदार और अन्य प्रोटीन परिसरों को व्यक्तिगत परिसरों के संगठन का आकलन करने के क्रम में रण में वापस रखा जा सकता है.

चित्रा 1
इलेक्ट्रॉन क्रायो टोमोग्राफी के चरणों दिखा 1 फ्लो चार्ट चित्रा. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.


Wildtype एस. Cerevisiae से एक माइटोकांड्रिया चित्रा 2 आकृति विज्ञान. एक wildtype एस के tomographic मात्रा के माध्यम से केन्द्रीय टुकड़ा cerevisiae माइटोकांड्रिया (बाएं) और इसी सतह प्रदान की गई मात्रा (दाएं). बाहरी झिल्ली की खंडों मात्रा ग्रे में दिखाया गया है और आंतरिक सीमा की मात्रा और हल्के नीले रंग में झिल्ली cristae है. डेविस एट अल 8 से अनुकूलित. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 3
एक एस से 3 माइटोकांड्रिया चित्रा. Cerevisiae तनाव के लिए आवश्यक एक सबयूनिट कमीएटीपी synthase dimerization. Tomographic मात्रा (बाएं) और एक एस से एक माइटोकांड्रिया की सतह प्रदान की गई मात्रा (दाएं) के साथ के माध्यम से टुकड़ा. एटीपी synthase dimerization के लिए आवश्यक प्रोटीन सबयूनिट ई कमी cerevisiae तनाव. चित्रा 2 के साथ तुलना में, उत्परिवर्ती तनाव से माइटोकांड्रिया wildtype माइटोकॉन्ड्रिया के सामान्य तहदार cristae का अभाव है. इसके बजाय, माइटोकांड्रिया कोई cristae या गुब्बारे के आकार का cristae या तो साथ कई भीतरी झिल्ली डिब्बों है. इस प्रकार इलेक्ट्रॉन क्रायो टोमोग्राफी जीन विलोपन के कारण झिल्ली आकारिकी में परिवर्तन पर प्रकाश डाला गया. डेविस एट अल 8 से अनुकूलित. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 4
Figurकवक पी से ई 4 माइटोकांड्रिया anserina. filamentous कवक पी से एक माइटोकांड्रिया की tomographic मात्रा (बाएं) और (दाएं) साथ सतह प्रदान की मात्रा के माध्यम से टुकड़ा anserina. इस रण में, 10 एनएम कणों (पीले तीर) की पंक्तियों भीतरी झिल्ली cristae में अत्यधिक घुमावदार झिल्ली लकीरें ऊपर स्थित हैं (1 मूवी देखें). इन कणों subtomogram औसत से एटीपी synthase dimers के रूप में पहचान की गई. डेविस एट अल 9. से बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 5
Mitochondrial एटीपी synthase की चित्रा 5 संरचना और संगठन. साइड और एस से एक एटीपी synthase डिमर का इलेक्ट्रॉन घनत्व दिखा शीर्ष देखें ग erevisiae सज्जित परमाणु मॉडल (बाएं) के साथ subtomogram औसत से निर्धारित रूप में. पंक्तियाँ (दाएं) में एटीपी synthase dimers के संगठन दिखा mitochondrial भीतरी झिल्ली पुटिका. आंकड़ा औसतन दौरान गणना निर्देशांक का उपयोग कर, झिल्ली पुटिका के खंडों मात्रा में एटीपी synthase डिमर की subtomogram औसत स्थिति से उत्पन्न किया गया था. डेविस एट अल 8 से अनुकूलित. परमाणु मॉडल: एफ 1 / रोटर अंगूठी [PDB: 2WPD] 39 (नीले और बैंगनी); संवेदनशील प्रदान प्रोटीन OSCP oligomycin [PDB: 2BO5] 40 (हरा); परिधीय डंठल टुकड़ा [PDB: 2CLY] से एन टर्मिनल अवशेषों के साथ 1 [PDB: 2WSS] 2 (पीले और लाल) (2 मूवी देखें). बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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एक पी से 6 चित्रा पृथक शिखा पुटिका anserina माइटोकांड्रिया. स्लाइस पी से एक शिखा पुटिका के tomographic मात्रा (बाएं) और (दाएं) साथ सतह प्रदान की गई मात्रा से anserina. झिल्ली से फैलने वाला प्रोटीन घनत्व स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे हैं. subtomogram औसत से पहचान के रूप में पीले तीर द्वारा संकेत घनत्व, एटीपी synthase dimers हैं. ग्रीन तीर NADH डिहाइड्रोजनेज के रूप में एंटीबॉडी लेबलिंग से पहचान घनत्व को इंगित (1 जटिल; विवरण 9 देखने के लिए). प्रोटीन घनत्व का विभाजन (देखें पंक्तियों के दोनों तरफ झिल्ली क्षेत्रों में अत्यधिक घुमावदार cristae लकीरें साथ पंक्तियों के गठन (लाल और पीले) एटीपी synthase dimers और NADH डिहाइड्रोजनेज परिसरों (हरा) के साथ, cristae में उनके संगठन का पता चलता है मूवी 3). डेविस एट अल 9 से.28 / 51228fig7highres.jpg "लक्ष्य =" _blank "> बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

एक पी की मूवी 1 इलेक्ट्रॉन क्रायो रण anserina माइटोकांड्रिया. फिल्म filamentous कवक पी से एक माइटोकांड्रिया का लिया एक tomographic मात्रा के माध्यम से लगातार स्लाइस से पता चलता है anserina. एटीपी synthase की पंक्तियां पीले तीर द्वारा संकेत कर रहे हैं. सतह से गाया, खंडों मात्रा 3 डी cristae संरचना के संबंध में एटीपी synthase (पीले क्षेत्रों) के स्थान से पता चलता है. बाहरी झिल्ली, ग्रे; आंतरिक सीमा झिल्ली, पारदर्शी नीले; झिल्ली, अपारदर्शी नीले cristae. डेविस एट अल 9 से. यह भी 4 आंकड़ा देखें. वीडियो देखने के लिए यहां क्लिक करें.

एस से mitochondrial एटीपी synthase डिमर की मूवी 2 Subtomogram औसत. सज्जित परमाणु मॉडल के साथ cerevisiae. औसत था121 subvolumes से गणना की. घनत्व तीन समोच्च स्तर पर प्रदर्शित किया जाता है: 1s - मेष, 2s - प्रकाश ग्रे और 3S - डार्क ग्रे. परमाणु मॉडल कल्पना में अनुक्रमिक फिट दिनचर्या का उपयोग घनत्व में लगाया गया. परमाणु मॉडल: एफ 1 / रोटर अंगूठी [PDB: 2WPD] 39 (नीले और बैंगनी); संवेदनशील प्रदान प्रोटीन OSCP oligomycin [PDB: 2BO5] 40 (हरा); परिधीय डंठल टुकड़ा [PDB: 2CLY] से एन टर्मिनल अवशेषों के साथ 1 [PDB: 2WSS]. 2 (पीले और लाल) वीडियो देखने के लिए यहां क्लिक करें.

डेविस एट अल 8 से अनुकूलित. भी 5 आंकड़ा देखें.

एक पी से मूवी 3 पृथक cristae पुटिका anserina माइटोकांड्रिया. के बाद एक स्लाइस tomographic मात्रा के माध्यम से खंडित सतह प्रदान की मात्रा द्वारा पीछा किया, दिखाया जाता है. Membran से फैलने वाला प्रोटीन घनत्वई स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे हैं. लाल और पीले घनत्व एटीपी synthase dimers हैं. ग्रीन घनत्व एंटीबॉडी लेबलिंग द्वारा निर्धारित NADH डिहाइड्रोजनेज (जटिल मैं) कर रहे हैं. डेविस एट अल 9 से. भी 6 आंकड़ा देखें. वीडियो देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Discussion

यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल और माइटोकॉन्ड्रिया की subtomogram औसतन एट क्रायो के लिए एक परिचय प्रदान करता है, लेकिन अनिवार्य रूप से एक ही प्रक्रिया किसी भी अन्य सेल कम्पार्टमेंट या झिल्ली के लिए लागू किया जा सकता है. सबसे अच्छा संभव डेटा प्राप्त करने के लिए प्रक्रिया के दौरान महत्वपूर्ण कदम नमूना तैयार करने, डुबकी जमने की प्रक्रिया और डाटा अधिग्रहण रणनीति है. सफलता के लिए महत्वपूर्ण है जो नमूना गुणवत्ता, अच्छी छवि के विपरीत के लिए सर्वोपरि महत्व का है, जो उपयुक्त बर्फ की मोटाई, यह सुनिश्चित करने के लिए एक अनुकूलित ठंड प्रोटोकॉल पर निर्भर करता है. इष्टतम डाटा अधिग्रहण रणनीति साधन और नमूना पर निर्भर करता है. अनुकूलित किया जाना पैरामीटर छवि प्रति इलेक्ट्रॉन खुराक, झुकाव योजना और defocus शामिल हैं. एक अच्छा नमूना का एक अच्छा रण हासिल सब आगे की प्रक्रिया आसान कदम और एक संतोषजनक अंत परिणाम सुनिश्चित करता है.

क्रायो एट subtomogram औसत और परमाणु मॉडल फिटिंग के साथ संयुक्त प्रोटीन परिसरों वीं में व्यवस्थित कर रहे हैं कि कैसे की जानकारी प्रदान करता हैEIR देशी सेलुलर वातावरण. तकनीक ऐसी सांस की श्रृंखला supercomplexes (1.7 एमडीए), एटीपी synthase dimers (2x500 केडीए), या परमाणु ताकना जटिल (~ 120 एमडीए) 8, 9, 17 के रूप में बड़े झिल्ली प्रोटीन परिसरों की संरचना की जांच के लिए समान रूप से उपयुक्त है. डिमर पंक्तियों अलगाव में एक आवश्यक कदम है जो डिटर्जेंट निकासी, द्वारा बाधित कर रहे हैं क्योंकि पंक्तियों में एटीपी synthase dimers के संगठन, एक्स रे क्रिस्टलोग्राफी, एनएमआर या एकल कण क्रायो ईएम के रूप में उच्च संकल्प तकनीक से देखा नहीं जा सकता और झिल्ली प्रोटीन परिसरों की शुद्धि.

cristae लकीरें साथ dimers की पंक्तियों में एटीपी synthase की व्यवस्था सभी प्रजातियों में माइटोकॉन्ड्रिया की एक सार्वभौमिक आयोजन सिद्धांत है. इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला के प्रोटॉन पंप परिसरों, विशेष रूप से जटिल में मैं (NADH डिहाइड्रोजनेज), दोनों ओर पंक्तियों 8 की झिल्ली क्षेत्रों में स्थित हैं9. सांस की श्रृंखला के इस संगठन mitochondrial बायोइनरजेटिक्स पर गहरा प्रभाव पड़ता है. डिमर पंक्तियों के कारण डिमर विशेष प्रोटीन के अभाव के फार्म नहीं कर सकते, तो चित्रा 3 41 में दिखाया खमीर उत्परिवर्ती में मनाया के रूप में, सेल, अब पीढ़ी समय और कम सेलुलर फिटनेस दिखा रहे हैं. माइटोकॉन्ड्रियल बीमारियों में बढ़ती रुचि के साथ एक विस्तृत माइटोकॉन्ड्रियल फैटी और समारोह गवर्निंग आणविक आधार को समझने के लिए सबसे ज्यादा महत्वपूर्ण है. इलेक्ट्रॉन क्रायो टोमोग्राफी नैनोमीटर के पैमाने पर झिल्ली में प्रोटीन उच्च संकल्प तरीकों से निर्धारित संरचना, और वितरण और इन प्रोटीनों की व्यवस्था के बीच एक लिंक प्रदान करता है. इस क्रायो एट स्वास्थ्य और रोग में mitochondrial संरचना और समारोह को समझने के लिए एक अनिवार्य उपकरण बनाती है.

क्रायो एट में आगे तकनीकी विकास और सुधार protei की स्थिति की पहचान करने के लिए प्रोटीन लेबलिंग रणनीति में शामिलmacromolecular परिसर में एन सब यूनिटों या कोशिकाओं में छोटे या कम विशिष्ट प्रोटीन का स्थान (<0.5 एमडीए). इसके अलावा, एक कण विश्लेषण या पेचदार पुनर्निर्माण साथ subtomogram औसतन गठबंधन जो संकर ईएम प्रसंस्करण विधियों, हाल ही में प्रोटीन संरचनाओं निर्धारित किया है एक 42, 43 8 ~ करने के लिए. ये प्रसंस्करण विधियों वर्तमान में अच्छी तरह से बर्फ में अलग या पेचदार विधानसभाओं फार्म और वर्तमान में माइटोकॉन्ड्रिया की तरह भीड़ सेलुलर वातावरण के लिए लागू नहीं कर रहे हैं और झिल्ली cristae रहे हैं जो शुद्ध प्रोटीन, तक ही सीमित हैं. डेटा संग्रह के लिए, नई कंप्यूटिंग और हार्डवेयर उपकरणों, स्वचालित रण अधिग्रहण सक्षम छवि के विपरीत बढ़ाने के लिए और कुल आवश्यकता इलेक्ट्रॉन खुराक को कम करने के लिए विकसित किया जा रहा है. क्रायो एट में केवल बुनियादी सीमा इलेक्ट्रॉन बीम द्वारा नमूना के लिए विकिरण क्षति है. यह केवल बहुत कम इलेक्ट्रॉन खुराक गरीब संकेत टी, जिसके परिणामस्वरूप एक tomographic झुकाव श्रृंखला के प्रत्येक छवि को रिकॉर्ड करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैओ शोर अंततः प्राप्त संकल्प है कि सीमा अनुपात. एक साल पहले की तुलना में कम जारी नए प्रत्यक्ष इलेक्ट्रॉन डिटेक्टरों, वर्तमान एकल कण क्रायो ईएम 44, 45 के क्षेत्र में क्रांति कर रहे हैं. इन नए डिटेक्टरों कम इलेक्ट्रॉन मात्रा में उच्च विपरीत और बेहतर समाधान प्रदान करते हैं. इलेक्ट्रॉन क्रायो टोमोग्राफी के लिए, यह अत्यधिक विकिरण क्षति (एक सीसीडी छवि 5 प्रत्यक्ष इलेक्ट्रॉन डिटेक्टर छवियों इलेक्ट्रॉन खुराक में बराबर है) के बारे में चिंताओं के बिना एकत्र किया जा सकता है छोटे कदम आकार या भी दोहरी अक्ष tomograms साथ कि झुकाव श्रृंखला का मतलब है. इन डिटेक्टरों द्वारा उत्पादित डेटा की विशाल मात्रा को पार करना होगा, जो डेटा को संभालने, प्रसंस्करण और भंडारण में उनकी खुद की चुनौतियों, बनाएँ.

इसके अलावा, चरण विपरीत बढ़ाने के लिए प्रकाश माइक्रोस्कोपी में नियमित तौर पर इस्तेमाल उन लोगों के रूप में इसी तरह के सिद्धांतों पर काम जो चरण प्लेटें, वर्तमान ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी 46, 4 के लिए विकसित किया जा रहा है7. इस tomograms ध्यान केंद्रित करने के लिए करीब एकत्र की है और इसलिए उच्च संकल्प पर, एक ही समय में कम संकल्प जबकि संरक्षण संरेखण और tomographic संस्करणों की व्याख्या के लिए आवश्यक सुविधाओं करने की अनुमति चाहिए. साथ में ले ली, इन तकनीकी विकास बहुत क्रायो ईटी ने संबोधित किया जा सकता है कि जैविक सवालों की सीमा का विस्तार होगा.

Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषणा.

Acknowledgments

इस काम के मैक्स प्लैंक सोसायटी (KMD, बीडी, AWM, टीबी, TBB, DJM, और विकेटकीपर), ड्यूश Forschungsgemeinschaft (विकेटकीपर) और एक postdoctoral EMBO दीर्घकालिक द्वारा वित्त पोषित उत्कृष्टता फ्रैंकफर्ट "macromolecular परिसर" के क्लस्टर द्वारा समर्थित किया गया फैलोशिप (VAMG).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sucrose Roth 4621.2
Trehalose Sigma-Aldrich T9449
HEPES Sigma-Aldrich H3375
Zymolase biomol Z1000.1
Density gradient medium Sigma-Aldrich D1556 or P1644
Protein A gold Aurion 810.111 10 nm
Ethane Air Liquide P0502S02R0A001
Nitrogen Air Liquide I4150RG
Consumables
Filter paper Whatman, GE Healthcare 1004 090 Nr 4
Tweezers Dumont T506 Non-magnetic, pattern #5
EM combined test grid Plano GmbH S142 grapite and gold islands on holey carbon film
Holey carbon grids Quantifoil Micro Tools GmbH or C-flat R2/2 300 Cu mesh
Cryo grid boxes Plano GmbH 160-42 Alternative home-made metal boxes
Potter Sigma-Aldrich P7984
Blender Waring 8011S
Glass bead mill - bead beater BioSpec Products 1107900-105 Including 0.5 mm beads
Ball-bearing (Balch) homogeniser isobiotec H8
Centrifuge Thermo Scientific 46915 Sorvall RC6+
Glow-discharge apparatus Bal-Tec A.G. CTA 010
Grid vitrification device FEI, Gatan or Leica Alternative home-made plunger
Transmission electron microscope FEI or Jeol 300 keV
Direct electron detector Gatan K2 summit 4k x 4k pixels, counted mode
Charge coupled device (CCD) Gatan US4000 4k x 4k pixels (alternative to Direct electron detector)
Energy filter Gatan or Jeol
Software
Image acquisition software Gatan
Tomogram acquisition software Gatan, FEI, USCF, or UC-Boulder 4 alternatives
Tomogram processing software FEI, UCSF or UC-Boulder 3 alternatives
Subtomogram averaging software UC-Boulder, or University of Basel 2 alternatives
Tomogram visualization software UC-Boulder, FEI, or University of Utah 3 alternatives
Visualization software plugin Goethe university http://www.biophys.uni-frankfurt.de/frangakis/
Structure visualization software UCSF http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/
Numerical calculation software MathWorks http://www.mathworks.de/academia/

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