Summary
Dit werk beschrijft een nieuwe werkwijze voor het selectief richten subcellulaire organellen in planten, bepaald met de BioRad Gene Gun.
Abstract
Om een enkel eiwit op meerdere subcellulaire organellen richten, planten typisch dupliceren de relevante genen, en een automatische elk gen afzonderlijk met behulp van complexe regulerende strategieën, inclusief differentiële promotors en / of signaal sequenties. Metabole ingenieurs en synthetische biologen vindt het richten enzymen een bepaalde organel staan voor een uitdaging voor een eiwit dat moet worden gelokaliseerd in meer dan een organel, moet de technicus hetzelfde gen klonen meerdere keren. Dit werk brengt een oplossing voor deze strategie: evaluatie van alternatieve splitsing van mRNA. Deze technologie maakt gebruik van gevestigde chloroplast en peroxisoom targeting sequenties en combineert ze tot een enkel mRNA dat alternatieve wijze wordt gesplitst. Sommige splice varianten naar de chloroplast, wat het peroxisoom en genen tot het cytosol. Hier het systeem is ontworpen voor meerdere organel richt met alternatieve splicing. In dit werk werd GFP verwacht expr zijnEssed in de chloroplast, cytosol en peroxisomen door een reeks van rationeel ontworpen 5 'mRNA tags. Deze tags hebben het potentieel om de hoeveelheid klonen vereist wanneer heterologe genen moeten worden uitgedrukt in verschillende subcellulaire organellen verminderen. De constructen werden ontworpen eerder werk 11 en werden gekloneerd middels Gibson samenstel, een ligatie onafhankelijke klonen methode die restrictie-enzymen vereist. De resulterende plasmiden werden geïntroduceerd in Nicotiana benthamiana epidermale blad cellen met een gemodificeerd Gene Gun protocol. Tenslotte werden getransformeerd bladeren waargenomen met confocale microscopie.
Introduction
Dit werk is een metabole engineering / synthetische biologie project waarin plantencellen zijn ontworpen om een reporter eiwit tot expressie in meerdere organellen, maar met slechts een enkele DNA-construct.
Een benadering om eiwitten te richten op meerdere locaties omvat klonen meerdere genetische kopieën, die elk een andere lokalisatie peptide. Elk exemplaar moet worden ingevoerd door de opeenvolgende retransformation, of als alternatief, door terugkruisen enkele transformaties 1. Dit houdt extra klonen, en wordt beperkt door een lokalisatie tag per eindpunt.
Een andere manier om een proteïne te lokaliseren op meerdere locaties is door alternatieve splicing 2-5. RNA wordt getranscribeerd vanaf een enkel gen, maar verschillende exemplaren van het transcript verschillend verwerkt, vaak meer dan een manier per cel. Dit kan leiden tot meer dan een boodschapper-RNA in de cel getranscribeerd uit een gen. Deze verschillende messenger RNA kan coderen voor verschillende isovormen van hetzelfde eiwit of in het geval van een frameshift, een ander eiwit helemaal. Hoewel alternatieve splicing is in de literatuur beschreven voor vele jaren, de werkingsmechanismen en geconserveerde donor en receptor splice sites worden alleen wordt meer recent opgehelderd 6. Omdat deze sites worden beter beschreven, zij schept kansen voor engineering.
Plant metabole ingenieurs staan voor een uitdaging bij een eiwit tot expressie in meerdere organellen. Voor een eiwit dat moet worden gelokaliseerd meerdere organel, moet de technicus hetzelfde gen klonen meerdere malen, elk met een aparte signaalsequentie richten aan het organel plaats. Voor een enkel gen in drie organellen, dit gewoon drie genen. Maar voor een zes-gen metabole route, dit uitgebreid tot 18 genen, een aanzienlijke inspanning klonen. Combineren van meerdere lokalisatie sequenties in een enkele, alternatief-gesplitste gen tekenificantly vermindert deze inspanning. Bijvoorbeeld, re-engineering fotorespiratie 7,8 en isoprenoide synthese 9,10 omvat zowel de chloroplasten en peroxisomen. In ons geval hebben we geprofiteerd van spliceplaatsen zoals waargenomen in een natuurlijke Arabidopsis thaliana systeem eerder beschreven 6. We rationeel herontworpen de mRNA-sequentie alleen achter de natuurlijke splitsingsplaatsen, maar geplaatst sequenties die chloroplast-of peroxisoom targeting markeringen zouden coderen in de alternatieve splicing introns (Figuur 1). Het tot expressie gebrachte eiwit kan al dan niet een label, naargelang de pre-mRNA dat gecodeerd werd uitgesneden als een intron (figuren 1g en 1h). Voor meer informatie over het ontwerp van de constructies die in dit werk, zie het begeleidend artikel 11.
Omdat dit nog steeds een aanzienlijke inspanning klonen, Gibson samenstel, een nieuwe methode voor het kloneren van DNA-constructen, is used in de bouw. De Gibson werkwijze kan worden gebruikt voor elke sequentie, ongeacht restrictieplaatsen (figuur 2) 12-14. De specifieke combinatie van enzymen maakt een stap isotherm montage. Bij deze werkwijze worden meerdere dubbelstrengs lineaire DNA delen, dat zij overlappende sequenties van ~ 50 bp gemaakt. De Gibson assemblage enzym mix gedeeltelijk verteert het lineair DNA delen, het blootstellen van enkele strengen van homologe sequenties. Deze gedeeltelijke enkelstrengs sequenties worden opnieuw gegloeid in het reactiemengsel, waardoor een snelle, een-stap sequentie-onafhankelijke ligatie vrij subklonering reactie.
Dit werk beschrijft 1) rationeel ontwerp alternatief verbonden constructen voor expressie in planten chloroplasten, peroxisomen, en cytosols, 2) hun klonen met behulp van de nieuwe-ligatie vrije methode van Gibson assemblage, 3) de levering ervan in tabaksbladeren cellen met de Gene Gun, en 4) resultaten tonen organel targeting, zoals waargenomen met GFPen confocale microscopie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Ontwerp van alternatief-gesplitst Sequences voor Multiple Organel Targeting
- Bepaal de locaties voor uiteindelijke eiwitexpressie. Voor dit werk, de rente is de gerichtheid op de chloroplasten, peroxisomen, en cytosol.
- Gebruik de literatuur om eiwitten en DNA-sequenties bekend om proteïnen te richten op organellen van belang vast te stellen. In dit geval een chloroplast-gerichte sequentie van Arabidopsis thaliana L-isoaspartate methyltransferase 6,15 en een peroxisoom targeting sequentie van Arabidopsis thaliana transthyretine-als S-allantoïne synthase 16,17 bepaald.
- Identificeer een-alternatieve splicing regime dat de eiwitten van belang moet richten op de juiste organellen. Voor dit werk, splicingplaatsen zoals waargenomen in een natuurlijke Arabidopsis systeem 6. De mRNA-sequentie werd herontworpen nalatende het natuurlijk splice sites, maar sequenties werden geplaatst codering chloroplast-of peroxisomenome-targeting-tags binnen het alternatief-splicing introns (figuur 1).
2. Gibson Vergadering van DNA Parts
Zie ook figuur 2.
De Gibson montagemethode is afhankelijk van de werking van verschillende enzymen in een vooraf gemaakte mengsel 1) gedeeltelijk verteren de uiteinden van het dubbelstrengs DNA met enkelvoudige strengen en 2) gloeien gratis basenparen van DNA naburige onderdelen. Dit maakt klonering van DNA-fragmenten niet de specifieke restrictieplaatsen.
- Kies een volgorde van de elementen in het DNA-plasmide-construct. Als voorbeeld TriTag-1 heeft elementen: a) een plasmide vector (porie met een GFP-construct bekend te werken in planten, een kanamycine resistentie merker, en oorsprong van replicatie voor E. coli en Agrobacterium tumefaciens systemen), b) een promotersequentie (P ENTCUP2 getoond constitutief te zijn in planten), C) een chloroplast-gerichte sequentie (CTS), c) een peroxisoom targeting sequentie (PTS), en d) een aantal splitsingsplaatsen zoals eerder beschreven 6.
- Ontwerpen van het construct base-voor-base met in silico ontwerpsoftware. ApE is een open source freeware pakket nuttig is voor dit werk.
Opmerking: TriTag-1, heeft de volgorde: plasmidevector, promoter, ATG, splitsingdonorplaats, chloroplast doelsequentie splitsingdonorplaats, neutraal site splice acceptor site peroxisoom doelsequentie, splice acceptor site GFP vervat in plasmidevector .- Het ontwerp van de in silico DNA-construct, zodanig dat er een 50-bp overlap tussen de stukken bij het bestellen van primers voor PCR. Het is mogelijk om de 50 bp overlap als primers gebruikt: 25 bp beide richtingen.
- Zorg ervoor dat u bij te houden van de oorsprong van elk van de reeks stukken. Is als: een plasmide worden gekweekt en miniprepped; een lineaire reeks die kan worden gebruikt als PCR-matrijs; of een sequentie die zal moeten wordencommercieel gesynthetiseerd? Verschillende bedrijven bieden goedkope DNA-synthese diensten voor fragmenten <500 bp. In dit geval, de TriTag zelf is 437 bp dus het voordelig het commercieel bestellen.
- De beste resultaten komen als alle fragmenten PCR-geamplificeerd en gezuiverd uit de matrijs DNA. De weerstand marker is een goede plek om deze grote DNA te splitsen in twee kleinere sjablonen die gemakkelijker PCR-versterkt zijn.
- Restrictie restrictie-enzymen DpnI knipt gemethyleerd DNA. Als de PCR-matrijs was een miniprep van E. coli, zal DpnI behandeling de verontreinigende template DNA te verwijderen.
- Het ontwerp van de in silico DNA-construct, zodanig dat er een 50-bp overlap tussen de stukken bij het bestellen van primers voor PCR. Het is mogelijk om de 50 bp overlap als primers gebruikt: 25 bp beide richtingen.
- Zuiveren van alle DNA-sequenties apart en elueren in water, TE of Buffer EB.
- Pore vector deel 1, ~ 3000 bp (groene pijlen). PCR geamplificeerd en Dpnl behandeld.
- Pore vector deel 2, ~ 3000 bp (zwarte pijlen). PCR geamplificeerd en Dpnl behandeld.
- TriTag insert, 437 bp (blauwe pijlen). Commercieel besteld. Resuspend in DDH 2 O.
- P ENTCUP promotor, ~ 750 bp (oranje pijlen). PCR-geamplificeerd en Dpnl behandeld.
- Meet de concentratie van elk van de DNA delen. Streven naar 150 ng / ul van de vector stukken.
- Neem een hoeveelheid van de Gibson assemblage mix uit de vriezer en ontdooien op ijs. Dit is in de handel verkrijgbaar, maar ook eenvoudig te maken in het lab 12-14.
- Er zijn twee stappen om dit recept: een stroperige 5x master mix en 15 ul reactie-formaat 1,33 x porties. De 5x master mix bevat: 3 ml 1 M Tris-HCl pH 7,5, 300 ul 1 M MgCl2, 600 pi 10 mM van elk dNTP, 300 ul 1 M DTT, 1,5 g PEG-8000, 20 mg NAD, en DDH 2 O 6 ml. Bereid 320 ul aliquots (18) en vries na alle bij -20 ° C. De oplossing zal heel viskeus. Label deze "5X isotherm buffer"
- Aan de ene resterende (320 pl), voeg 1,2 pl T5 Exonuclease, 20 pl Phusion High-Fidelity DNA Polymerase, 160 ul Taq DNA Ligase en 700 ul DDH 2 O. Bereid 15 pi aliquots (~ 80) op ijs in PCR buizen en bewaar bij -20 ° C.
- Bepaal volumes equimolaire hoeveelheden van elk van de fragmenten. Er zijn een paar online calculators, waaronder Gibthon.org. Er moet een totaal van 5 ul van de DNA delen worden. Voeg ze toe aan de 15 ul Gibson mix aliquot. Indien vereist volumes te klein om pipet verdunnen DNA fragmenten en / of gebruiken meer dan een aliquot.
- Vergeet niet om een controle van de vector DNA alleen voor te bereiden (bijvoorbeeld het DNA-deel dat de resistentie tegen antibiotica marker) en vul aan met water.
- Incubeer de buizen in een thermische cycler bij 50-55 ° C gedurende 30-60 minuten. Vervang op ijs en transformeren in E. coli via warmte-shock chemisch competente cellen. Gebruik geen elektrocompetente cellen. De hoge zoutconcentratie en de relatief lage DNA concentratiekan de cellen boog.
- Breng alle 20 ul van een commerciële bereiding van 200 pl calciumchloride competent E. coli.
Incubeer op ijs 30 min en hitteschok 60 sec bij 42 ° C - Terug naar ijs 2 minuten, de 750 pi SOC of LB-medium en terug te schudden in een microcentrifugebuis 30 minuten bij 37 ° C. Plaat van het mengsel en geschikte verdunningen op LB + Kan (of andere geschikte antibiotica). Dit kan resulteren in hogere achtergrond (en een hoger aantal niet-doelwit recombinatie) dan traditionele-ligatie gebaseerde klonen maar verdient het aanbeveling scherm ongeveer 10 kolonies.
- Breng alle 20 ul van een commerciële bereiding van 200 pl calciumchloride competent E. coli.
- Bevestig kloon via sequentie en slaan een monster bij -80 ° C
3. Biolistische Transfectie van tabak met de Gene Gun
Dit is een techniek die wordt opgericht in Jupiter 18,19. De belangrijkste stappen en verschillen worden hierna beschreven.
- Groeien 50-100 ml E. coli of 200 ml Agrobacterium. Maxi-prep de cultuur. Een concentratie van ongeveer 1500 ng / ul moet gaan.
- Bereid gen kogels zoals eerder beschreven. Plaats ze in de Gene Gun.
- Voor transfectie van Nicotiana benthamiana tabaksblad epidermale weefsel, kiest een groot blad dicht bij de basis van een 3 maanden oude plant. Snijd het zorgvuldig en leg het ondersteboven neer op nat papier handdoeken in een 15 cm petrischaal.
- Stel de He druk voor de Gene Gun 200-250 psi.
- Doel voorzichtig Gene Gun tussen ribben op de onderzijde van een blad, ongeveer 3-5 cm erboven. Laat de veiligheid en leveren de deeltjes aan het blad. Elke kogel kan tweemaal worden gebruikt op dezelfde plaats op het blad. Als het blad explodeert, weggooien en een nieuw blad-er enige variatie in blad taaiheid door groeiomstandigheden zoals leeftijd, vocht, enz. Voor een 12-cm blad verwachten ongeveer 6 opnamen passen.
- Sla het blad, bedekt met de bovenkant van eenPetrischaal voor 2-3 dagen bij weinig licht op de bank.
- Onderzoek het blad in een dissectiemicroscoop uitgerust met UV-fluorescentie, en zoeken naar individuele cellen die GFP. Ontleden 5-10 mm delen van blad.
- Dompel het blad in een diepe put microscoop dia onder ~ 200 ul 0,1% Triton X-100. Het wasmiddel voorkomt luchtbellen vormen op het oppervlak, en deepwell objectglaasje maakt een groter weefsel beeldgebied.
4. Confocale microscopie van Getransfecteerde Tissue
Deze instructies variëren voor elk instrument, dus is het essentieel om goed getraind.
- Voor fluorescentie detectie experimenten, stelt de excitatie laser 489 nm, en stel de photomultiplier detectoren 500-569 nm voor GFP-fluorescentie en 630-700 nm voor chlorofyl auto-fluorescentie. Afbeelding cellen met behulp van een 40x water-immersie objectief.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het ontwerp inspanning was een gevolg van aanzienlijke planning. Novel dit project is het gebruik van alternatieve splicing van een pre-mRNA dat vertaald in differentieel tot expressie gebrachte eiwitten te creëren. Deze eiwitten worden uitgedrukt in verschillende organellen, in dit geval de chloroplast, peroxisoom en / of cytosol. Wij aangepast natuurlijke Arabidopsis gen dat alternatieve wijze wordt gesplitst 6 en geplaatste bekende chloroplast 6 en peroxisoom 17 targeting sequenties in alternatieve exons (TriTag-1 en TriTag-2). TriTag-3 bestaat uit een peroxisoom signaal ingebed in een lage complexiteit gebied van de chloroplast sequentie. Deze werden in frame met GFP (Figuur 1).
De natieve alternatieve splicing overschakelen van de PIMT2 gen 6, chloroplast en peroxisoom-gerichte sequenties, GFP en een plasmideskelet: De plasmiden die in deze studie dus verscheidene elementen. Aangezien elk zeer specific vereiste sequentie, een sequentie-onafhankelijke methode noodzakelijk. De Gibson samenstel 12,13 protocol kan worden gebruikt op elke sequenties zolang de componenten ervan zijn ontworpen met sequentie-overeenkomst met elkaar, en hebben herhalende sequenties bevatten. In het kort worden lineaire DNA-fragmenten vervaardigd (hetzij via PCR amplificatie, commerciële synthese of digestie van een vooraf gemaakte plasmide) zodat zij ~ 50 bp overlappende homologe sequentie (Figuur 2). Equimolaire hoeveelheden van de DNA-fragmenten worden gecombineerd in een enkele buis met de Gibson samenstel mix geïncubeerd bij 50 ° C gedurende een uur, en getransformeerd in E. coli. De plasmiden verkregen uit het Gibson samenstel protocol werden bevestigd door Sanger sequentiebepaling.
In deze studie werden drie verschillende GFP-constructen gericht organel opzichte ongelabelde GFP en een Rubisco-gelabeld GFP. Confocale microscopie werd gebruikt om GFP fluorescentie te detecteren in de single cellen tijdelijk getransformeerd. In controle-experimenten, de tijdelijke expressie waargenomen werd gecorreleerd aan de chloroplasten (gemakkelijk door de rode autofluorescentie chlorofyl), de kernen (grote organel die geen chloroplast en slechts een per cel) en / of kleine organellen geacht worden peroxisomen. Groen (GFP) en rode (chlorofyl autofluorescentie) kanalen werden bedekt om intracellulaire lokalisatie (figuur 3) te bestuderen. Voor een meer volledige bespreking van deze resultaten, zie onze begeleidend artikel 11.
Zoals voorspeld, in alle drie dubbele constructen gericht, GFP waargenomen in de chloroplasten (figuur 4) in overlay confocale microfoto. TriTag-1 en-2 TriTag doel het GFP ook de cytosol en de kleine organel vermoedelijk het peroxisoom (figuren 4a en 4b respectievelijk) zijn. TriTag-3 richt zich op de GFP alleen de chloroplast en de peroxisomen, maar niethet cytosol (figuur 4c). Een samenvatting van de resultaten wordt schematisch weergegeven (figuur 5).
Figuur 1. Ontwerp van alternatieve splicing constructen voor differentiële organel expressie in Nicotiana benthamiana. Splice diagrammen van (a) TriTag-1, (b) TriTag-2, en (c) TriTag-3 het vertonen van niet-targeting sequenties (grijs), chloroplast gerichte sequenties (lichtgroen), peroxisoom-gerichte sequenties (oranje), en de GFP coderende sequentie in transiënte expressie-experimenten. TriTag-1 en TriTag-2 bestaan uit alternatieve splicing constructen; TriTag-3 bestaat uit een peroxisoom signaal ingebed in een lage complexiteit gebied van de chloroplast sequentie. Sequenties van
Figuur 2 Schematische voor Gibson montage.. Een nieuwe methode voor de montage van overlappende DNA-fragmenten De Gibson montagemethode voor plasmide constructie 12,13 snel vervanging van traditionele restrictie-ligatie klonering in veel laboratoria. In wezen kan men een construct ontwerpen in silico dat het DNA van belang precies uit PCR producten geamplificeerd uit verschillende bronnen bevat. Ontwerp van primers die complementair aan elkaar zijn, en PCR-amplificeren elk fragment met de gekleurde primers. Voeg alle stukken in een enkele buis met het enzym mix, en transformeren E. coli competente cellen. Klik hier om l te bekijkenafbeelding Arger.
Figuur 3. Controle behandelingen gebombardeerd in N. benthamiana blad epidermale cellen. (ac) gelabeld GFP. (a) Groen kanaal. Ongemerkte GFP tot expressie in de kern en in de cel periferie, overeenkomend met de cytosol, maar niet de vacuole. (B) Rode chloroplasten dan autofluorescentie chlorofyl. (C) Overlay. In dit construct fluorescentie wordt waargenomen in de kern en enige cytosol, maar niet de chloroplasten. (Df)-chloroplast gelabeld GFP controle. (D) groene kanaal. GFP expressie wordt gebracht in de grote organellen, met een cel zoals beschreven. (E) Rode chloroplasten dan autofluorescentie van chloorophyll. (f) Overlay. In dit geval geel chloroplasten worden waargenomen, wat aangeeft dat de GFP (groen) is gericht naar de chloroplast. Overgenomen met toestemming 11. Klik hier voor grotere afbeelding.
Figuur 4. Tri-Tag-1, 2, 3 gelabeld GFP gefuseerd beelden. (A) Tri-Tag1. In dit geval geel chloroplast periferie worden waargenomen, wat aangeeft dat de GFP is gericht op de chloroplast. GFP wordt ook waargenomen in het cytosol en kleine puntvormige organellen die kan peroxisomen. (B) Tri-Tag2. In dit geval geel chloroplast periferie worden waargenomen, wat aangeeft dat de GFP is gericht op de c hloroplast. GFP wordt ook waargenomen in het cytosol en kleine puntvormige organellen die kan peroxisomen. (C) tri-Tag3. In dit geval geel chloroplasten worden waargenomen, evenals kleine puntvormige organellen die kunnen worden peroxisomen. Maar GFP wordt niet waargenomen in de cytosol. Overgenomen met toestemming 11. Klik hier voor grotere afbeelding.
Figuur 5. Compartimenten van een typische tabaksbladeren epidermale cellen. Hier de relatieve afmetingen en locaties binnen de cel weergegeven, en de relatieve expressieniveaus waargenomen via confocale microscopie. Overgenomen met toestemming 11./ 51234/51234fig5highres.jpg "target =" _blank "> Klik hier voor grotere afbeelding.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In deze studie worden eenvoudige strategieën beschreven voor het lokaliseren van een transgeen eiwit meerdere cellulaire compartimenten in planten. Het doel was construct dat een gen tot expressie zou meer dan een organel in Nicotiana benthamiana ontwerpen. Strategieën omvatten rationeel ontwerp van GFP-gebaseerde DNA-constructen, Gibson montage, levering van de plasmiden te bladcellen met de Gene Gun, en observatie van de resultaten met confocale microscopie.
Drie verschillende korte, N-terminale labels zijn ontworpen voor gelijktijdige chloroplasten, peroxisomen en cytosol targeting 11. Deze "TriTags" werden gemaakt door het combineren van nature voorkomende DNA's die coderen alternatief gesplitste mRNA dat de gecodeerde eiwitten ofwel de chloroplast plus cytoplasma 6 of peroxisoom plus 17 cytoplasma direct. TriTag-3 is niet afhankelijk van alternatieve splicing en bestaat uit een chloroplast-gerichte sequentie waarin een natureel ongestructureerde gedeelte is vervangen door een peroxisomale targeting sequentie 15,17. De TriTags functie in vivo GFP Nicotiana benthamiana bladeren epidermale cellen (Figuur 5) richten.
Confocale microscoopopnamen bleek dat TriTag-1 en-2 TriTag doelstelling GFP naar de chloroplast, peroxisoom, en cytosol effectief, maar met voorkeur voor de chloroplast en peroxisoom respectievelijk (figuren 4a en 4b). TriTag-3 doelstellingen GFP alleen de chloroplast en peroxisoom, maar niet het cytosol (figuur 4c). In totaal kan deze tags verkorten en middelen besteed aan het klonen van planten metabolic engineering, speciaal voor hen die dit nodig een bijzondere uitdrukking in de chloroplasten en peroxisomen.
Wijzigingen en probleemoplossing
De TriTags zoals momenteel gebouwd zijn vrij statisch. De underlying technologie, alternatieve splicing op vertaling van andere locatie-specifieke labels toe te staan, is flexibel. De bestaande chloroplast en / of peroxisomen specifieke labels kunnen worden veranderd om een andere organel, zij het de secretie pathway, het mitochondrion, een ER woonplaats tag, de vacuole. Deze kunnen ook worden gecombineerd met weefselspecifieke promoters, bijv. voor de zaden, bloemen, wortels, bladeren, stengels, enz.
Voor een project als deze, de Gibson assemblage methode 12-14 voor het klonen van constructen is ideaal. Het is een eenvoudig stuk gereedschap aan een sequentie subkloneren zonder de beperkingen van restrictieplaatsen. In een stap reacties, Gibson montage snel gemaakt de constructen en controles met minimale inspanning in het klonen. De Gibson montagetechniek bijna oneindig aanpasbaar voor elke gewenste volgorde zo lang als de matrijs sequenties kunnen worden PCR-geamplificeerd. Hoewel in dit voorbeeld Gibson samenstel is afgebeeld met een gedigereerd plasmidePCR-amplificeren van de vector meestal beter dan een gedigereerd miniprep werken.
De Gene Gun is een snelle, effectieve methode voor transiënte transfectie van cellen, zoals is aangetoond door het tijdschrift 18,19. Nicotiana benthamiana heeft grote, gelobde blad epidermale cellen, die zowel ideaal voor transfectie met de Gene Gun zijn, maar ook observeren met confocale microscopie. Het protocol voor het maken van kogels is goed ingeburgerd. Goud is gebruikt als een microdrager in de meeste experimenten in de literatuur tot nu toe, maar wolfraam microdragers zijn onlangs verkrijgbaar tegen lage kosten.
Beperkingen van de technieken
Een belangrijke beperking van de Gibson werkwijze is de aanwezigheid van herhaalde sequenties: hoe langer het overlappende gebied is minder nevenproducten resultaat. Vertering van de PCR producten met DpnI moet verwijderen vervuilende plasmide templates; die meestal de bron van bijwerkingenproducten. De enzymen verteren het DNA-fragmenten van dubbelstrengs DNA in enkelstrengs. De aanwezigheid van herhaalde sequenties bij de uiteinden (~ 1 kb) van de DNA-fragmenten verhoogt de kans op onjuiste recombinatie. Als goed, herhaalt binnen de sequenties vormen ook een beperking: het is niet goed bekend, en moeilijk om te bepalen hoe ver de T5 exonuclease kauwt back enkelstrengs DNA. De snelle werking van het exonuclease wordt getemperd door hoge reactietemperatuur (50-55 ° C) eventueel denatureren van het enzym, en de viscositeit verlagen de totale beweging in de oplossing. Voor meer fine-tuning van de reactie stappen, volgorde en ligatie onafhankelijke klonen (SLIC) 20 heeft de voorkeur.
Een belangrijke beperking van het gen pistool techniek is dat het veroorzaakt slechts in de orde van 9:59 transiënt getransformeerde cellen per opname gebeurtenis.
Belang met betrekking tot bestaande methoden
De Gibson montagetechniek is genieten van snelle goedkeuring voor het gemak, flexibiliteit en aanpassingsvermogen. Het is een protocol sneller dan de traditionele restrictie / ligatie klonering en geen specifieke sequenties zoals vereist voor restrictiedigestie vereisen. Het is niet beperkt tot twee of drie fragmenten worden gerecombineerd; de oorspronkelijke onderzoekers hebben met succes aangetoond tot 10 delen, zij het met beperkt rendement. Voor veel onderzoekers Gibson samenstel zorgt voor een groter aantal positieve klonen.
Voor meer transformanten met Biolistische technieken, of voor het maken van getransformeerde callusweefsel, moet het gebruik van een kast-stijl biolistische apparaat (bijv. de BioRad PDS-1000) worden gebruikt. Een alternatieve methode is Agrobacterium infiltratie.
Toekomstige toepassingen
Gibson samenstel maakt, om grotere en grotere clusters van DNA te monterenhet punt waar een maximum is niet waargenomen. De oorspronkelijke auteurs hebben gebruikt om te assembleren honderden kilobasen DNA 13.
De mogelijkheid om meerdere organellen selectief richten met een genetisch construct heeft de potentie om het aantal genen om getransformeerd te verlagen. De levering van steeds grotere DNA-fragmenten (en dus grotere metabole routes) is een korte termijn doel. Isoprenoide trajecten zijn door biolistische methoden om de chloroplast zijn geleverd; andere genclusters zoals alternatieve koolstoffixatie paden zijn aan de horizon.
Kritische stappen binnen het protocol.
In Gibson assemblage, moet u de sjabloon sequenties geen homologie met elkaar te maken hebben, behalve op het doel recombinatieplaatsen.
In biolistische transformatie van de Nicotiana planten, wees voorzichtig om het gen pistool ongeveer 10-15 cm boven de bladeren houden eennd houden de helium druk bij 200-250 psi. Dichterbij dan dat, zal de fragiele blad ontploffen, en verder dan dat ze niet goed zal worden getransformeerd. Twee dagen na transfectie een blauwe plek zou moeten verschijnen op het blad als het goed is getransformeerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs willen graag Jen Sheen van het Massachusetts General Hospital bedanken voor de gulle donatie van Nicotiana benthamiana zaailingen. Jen Bush hielp ons sterk in advies op het kweken van planten en het opzetten van een kweekkamer gebied. Tom Ferrante van de Wyss Institute aangeboden cruciale hulp bij confocale microscopie. De auteurs willen het vooral leuk om Don Ingber van Children's Hospital Boston en de Wyss Instituut voor de gulle donatie van een Gene Gun en bijbehorende supplies bedanken. De financiering voor dit project werd verstrekt door middel van een samenwerkingsovereenkomst met het ministerie van Energie Advanced Research Projects Agency (ARPA-E Award # DE-000079) voor PAS, JCW, en Dokters van de Wereld, en door Chimerion Biotechnology, Inc voor MJV.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Oligonucleotide primers | IDT | (custom) | Design specifically for construct |
| GeneBlocks | IDT | (custom) | 500 bp oligonucleotides |
| ApE software | U Utah | (download) | http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/ |
| MinElute kit | Qiagen | 28004 | Used to purify PCR products |
| QIAprep spin miniprep kit | Qiagen | 27104 | Used to prepare cloning-appropriate amounts of plasmid |
| Phusion Master Mix with GC Buffer | NEB | M0532S | Used to PCR-amplify gene of interest |
| Gibson assembly reaction mix | NEB | E2611L | Master mix of the following 9 ingredients |
| 1 M Tris-HCl pH7.5 | Teknova | T1075 | Gibson assembly mix |
| 1 M MgCl2 | G Biosiences | 82023-086 | Gibson assembly mix |
| dNTP mix | Fermentas | R0192 | Gibson assembly mix |
| 1 M DTT | Fermentas | R0861 | Gibson assembly mix |
| PEG-8000 | Affymetrix | 19966 | Gibson assembly mix |
| NAD | Applichem | A1124,0005 | Gibson assembly mix |
| T5 exonuclease | Epicentre | T5E4111K | Gibson assembly mix |
| Phusion polymerase | NEB | F530S | Gibson assembly mix |
| Taq DNA ligase | NEB | M0208L | Gibson assembly mix |
| Gibthon.org | Website to simplify calculations | ||
| Plasmid PLUS Maxi kit | Qiagen | 12963 | Used to prepare DNA for gene gun bullets |
| Gene Gun system | BioRad | 165-2451 | Includes all parts necessary |
| Nicotania benthamiana | (n/a) | (n/a) | Gift of Jen Sheen, MGH |
| Confocal microscope | Leica | SP5 X MP | Imaging of resultant cells |
| Deep well slides | Electron Microscopy Sciences | 71561-01 | Used for confocal imaging |
| A Plasmid Editor (ApE) | University of Utah | http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape | |
| Gibthon:Ligation calculator | http://django.gibthon.org/tools/ligcalc/ |
References
- Que, Q., et al. Trait stacking in transgenic crops: challenges and opportunities. GM crops. 1 (4), 220-229 (2010).
- Reddy, A. S. N., Rogers, M. F., Richardson, D. N., Hamilton, M., Ben-Hur, A. Deciphering the plant splicing code: experimental and computational approaches for predicting alternative splicing and splicing regulatory elements. Frontiers in Plant Science. 3 (18), (2012).
- Hickey, S. F., et al. Transgene regulation in plants by alternative splicing of a suicide exon. Nucleic Acids Research. 40 (10), 4701-4710 (2012).
- Syed, N. H., Kalyna, M., Marquez, Y., Barta, A., Brown, J. W. S. Alternative splicing in plants - coming of age. Trends in Plant Science. 17 (10), 616-623 (2012).
- Black, D. L. Mechanisms of alternative pre-messenger RNA splicing. Annual Review of Biochemistry. 72, 291-336 (2003).
- Dinkins, R. D., et al. Changing transcriptional initiation sites and alternative 5'- and 3'-splice site selection of the first intron deploys Arabidopsis protein isoaspartyl methyltransferase2 variants to different subcellular compartments. The Plant Journal: for Cell and Molecular Biology. 55 (1), 1-13 (2008).
- Kebeish, R., et al. Chloroplastic photorespiratory bypass increases photosynthesis and biomass production in Arabidopsis thaliana. Nature Biotechnology. 25 (5), 593-599 (2007).
- Maier, A., et al. Transgenic Introduction of a Glycolate Oxidative Cycle into A. thaliana Chloroplasts Leads to Growth Improvement. Frontiers in Plant Science. 3 (38), 1-12 (2012).
- Kumar, S., et al. Remodeling the isoprenoid pathway in tobacco by expressing the cytoplasmic mevalonate pathway in chloroplasts. Metabolic Engineering. 14 (1), (2012).
- Sapir-Mir, M., et al. Peroxisomal localization of Arabidopsis isopentenyl diphosphate isomerases suggests that part of the plant isoprenoid mevalonic acid pathway is compartmentalized to peroxisomes. Plant Physiology. 148 (3), 1219-1228 (2008).
- Voges, M. J., Silver, P. A., Way, J. C., Mattozzi, M. D. Targeting a heterologous protein to multiple plant organelles via rationally designed 5' mRNA tags. Journal of Biological Engineering. 7 (20), (2013).
- Gibson, D. G. Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments. Methods in Enzymology. 498, 349-361 (2011).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 12-16 (2009).
- Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A., Venter, J. C., Merryman, C. Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome. Nature Methods. 7 (11), 901-903 (2010).
- Lowenson, J. D., Clarke, S. Recognition of D-aspartyl residues in polypeptides by the erythrocyte L-isoaspartyl/D-aspartyl protein methyltransferase. Implications for the repair hypothesis. The Journal of Biological Chemistry. 267 (9), 5985-5995 (1992).
- Lanyon-Hogg, T., Warriner, S. L., Baker, A. Getting a camel through the eye of a needle: the import of folded proteins by peroxisomes. Biology of the Cell / under the auspices of the European Cell Biology Organization. 102 (4), 245-263 (2010).
- Reumann, S., et al. Proteome analysis of Arabidopsis leaf peroxisomes reveals novel targeting peptides, metabolic pathways, and defense mechanisms. The Plant Cell. 19 (10), 3170-3193 (2007).
- Woods, G., Zito, K. Preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture. J. Vis. Exp. (12), (2008).
- Hollender, C. A., Liu, Z. Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene. (40), (2010).
- Li, M. Z., Elledge, S. J. Harnessing homologous recombination in vitro to generate recombinant DNA via SLIC. Nature Methods. 4 (3), 251-256 (2007).
