Summary
Ce travail décrit un nouveau procédé pour cibler sélectivement des organelles sous-cellulaires dans les plantes, dosés par la BioRad Gene Gun.
Abstract
Afin de cibler une seule protéine à plusieurs organites intracellulaires, plantes généralement double emploi avec les gènes pertinents, et d'exprimer chaque gène séparément à l'aide des stratégies de réglementation complexes, y compris les promoteurs de différentiels et / ou des séquences de signaux. Ingénieurs métaboliques et les biologistes synthétiques intéressés à cibler les enzymes à un organite particulier sont confrontés à un défi: Pour une protéine qui doit être localisée à plus d'un organite, l'ingénieur doit cloner le gène même plusieurs fois. Ce travail présente une solution à cette stratégie: exploiter l'épissage alternatif de l'ARNm. Cette technique tire parti du chloroplaste établi et des séquences de ciblage de peroxysome et les combine en un seul ARNm qui est épissé de façon alternative. Certains variants d'épissage sont envoyés vers le chloroplaste, les uns pour le peroxysome, et certains au cytosol. Ici, le système est conçu pour les multiples ciblant un organite de l'épissage alternatif. Dans ce travail, la GFP a été prévu pour être exprEssed dans le chloroplaste, cytosol, et peroxysomes par une série d'conçus rationnellement 5 'de l'ARNm des tags. Ces balises ont le potentiel de réduire la quantité de clonage nécessaire lorsque des gènes hétérologues doivent être exprimés en plusieurs organites intracellulaires. Les constructions ont été conçues dans le travail précédent 11, et ont été clones en utilisant Gibson assemblage, un procédé de clonage indépendant de la ligature qui ne nécessite pas d'enzymes de restriction. Les plasmides résultants ont été introduits dans les cellules épidermiques des feuilles de Nicotiana benthamiana avec un protocole Gene Gun modifié. Enfin, les feuilles transformées ont été observées par microscopie confocale.
Introduction
Ce travail est un projet d'ingénierie / de la biologie synthétique métabolique dans lequel les cellules végétales sont modifiées pour exprimer une protéine rapporteur dans plusieurs organites mais avec une seule construction d'ADN.
Une approche pour cibler des protéines à plus d'un emplacement de clonage implique de multiples copies génétiques, chacune contenant un peptide de localisation différente. Chaque copie doit être introduite par retransformation successifs, ou encore, par rétrocroisement transformations simples 1. Il s'agit de clonage supplémentaire, et est limitée par une balise de localisation par terminus.
Une autre façon de localiser une protéine à plusieurs endroits à travers l'épissage alternatif 2-5. ARN est transcrit à partir d'un seul gène, mais différentes copies de la transcription sont traitées différemment, souvent dans plus d'un titre par cellule. Cela peut entraîner plus d'un ARN messager dans la cellule transcrit à partir d'un gène unique. Ces différents messengeARN R peut coder pour différentes isoformes de la même protéine, ou dans le cas d'un décalage du cadre, une protéine différente. Bien que l'épissage alternatif ont été décrits dans la littérature depuis de nombreuses années, les mécanismes d'action et de donneur conservée et les sites d'épissage des récepteurs ne sont élucidés, plus récemment, 6. Comme ces sites sont mieux décrites, elles ouvrent des opportunités pour l'ingénierie.
ingénieurs métaboliques des plantes sont confrontés à un défi en exprimant une protéine dans plusieurs organites. Pour une protéine qui doit être localisée à plus d'un organite, le mécanicien doit cloner le gène même plusieurs fois, chacune avec une séquence signal séparé le diriger vers l'organite d'intérêt. Pour un gène unique en trois organelles, il s'agit simplement de trois gènes. Mais pour une voie métabolique six gène, cela élargit à 18 gènes, un effort significatif de clonage. Combinaison de plusieurs séquences de localisation en un seul signe de gène, alternativement épisséréduit ificantly cet effort. Par exemple, re-engineering photorespiration 7,8 et la synthèse des isoprénoïdes 9,10 implique à la fois les chloroplastes et les peroxysomes. Dans notre cas, nous avons profité de sites d'épissage comme observé dans un système naturel de Arabidopsis thaliana décrit précédemment 6. Nous rationnelle redessiné la séquence d'ARNm de quitter les sites d'épissage naturels seul, mais placés séquences qui coder chloroplastes ou des balises péroxisome ciblage dans les introns épissés alternativement-(Figure 1). La protéine exprimée peut être ou ne pas avoir une étiquette, selon que le pré-ARNm codé qui a été excisé sous la forme d'un intron (figures 1g et 1h). Pour plus d'informations sur la conception des constructions présentées dans ce travail, s'il vous plaît voir l'article de compagnon 11.
Parce que c'est encore un effort significatif de clonage, assemblage Gibson, une nouvelle méthode de clonage des constructions d'ADN, est used dans la construction. Procédé Gibson peut être utilisée pour n'importe quelle séquence, indépendamment de sites de restriction (figure 2) de 12 à 14. La composition précise des enzymes permet en une seule étape, l'assemblage isotherme. Dans ce procédé, plusieurs parties linéaires à double brin d'ADN ont été conçus de telle sorte qu'ils ont des séquences chevauchantes de ~ 50 bp. L'ensemble de mélange d'enzymes Gibson digère partiellement les parties d'ADN linéaires, exposant simples brins de séquences homologues. Ces séquences simple brin partiels sont à nouveau recuit dans le mélange réactionnel, résultant en une seule étape, indépendante de la séquence, la réaction de ligature sous-clonage libre-rapide.
Ce travail décrit une) conception rationnelle constructions épissage alternatif pour l'expression dans les chloroplastes des plantes, les peroxysomes, et cytosols, 2) leur clonage en utilisant le nouveau procédé d'assemblage Gibson libre ligature, 3) leur livraison dans les cellules de la feuille de tabac avec le pistolet à gènes, et 4) des résultats montrant ciblage organite, comme observé avec la GFPet microscopie confocale.
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Protocol
1. Conception de séquences d'épissage alternative-pour Multiple Organelle ciblage
- Déterminer les sites d'expression de la protéine finale. Pour ce travail, l'intérêt est de cibler le chloroplaste, peroxysomes, et cytosol.
- Utilisez la littérature pour identifier les protéines et les séquences d'ADN connues pour cibler des protéines vers les organites d'intérêt. Dans ce cas, une séquence de ciblage du chloroplaste d'Arabidopsis thaliana L-méthyltransférase isoaspartate 6,15, et une séquence de ciblage de peroxysome de Arabidopsis thaliana transthyrétine-S-comme l'allantoïne 16,17 synthase ont été déterminés.
- Identifier un régime alternatif-épissage qui devrait cibler les protéines d'intérêt pour les organites correctes. Pour ce travail, les sites d'épissage comme observé dans un système de Arabidopsis naturel 6. La séquence de l'ARNm a été redessiné en laissant les sites d'épissage naturels, mais les séquences codantes ont été placés peroxis chloroplastiques ouome-balises de ciblage dans les introns épissés alternativement-(Figure 1).
2. Assemblée Gibson des parties ADN
Voir aussi la figure 2.
Le procédé d'assemblage Gibson dépend de l'action de plusieurs enzymes dans un mélange de pré-mesure pour 1) digérer partiellement les extrémités de l'ADN double brin de faire brins simples et 2) recuire les paires de bases complémentaires de parties de l'ADN voisin. Ceci permet le clonage de fragments d'ADN, sans les limitations des sites de restriction.
- Choisir une commande pour les éléments dans le produit d'assemblage d'ADN plasmidique. A titre d'exemple TriTag-1 a des éléments de: a) un vecteur plasmidique (pores, contenant une construction de GFP connu pour fonctionner dans les plantes, un marqueur de résistance à la kanamycine, et des origines de replication pour E. coli et Agrobacterium tumefaciens des hôtes), b) un séquence de promoteur, (P ENTCUP2, montré pour être constitutive dans les plantes), C) une séquence de ciblage du chloroplaste (CTS), c) une séquence de ciblage des peroxysomes (PTS), et d) une série de sites d'épissage tel que décrit précédemment 6.
- Concevoir la base de base de construction avec des logiciels de design in silico. ApE est un logiciel gratuit open source utile pour ce travail.
Remarque: TriTag-1, a l'ordre: vecteur plasmidique, promoteur, ATG, site donneur d'épissage, séquence cible chloroplastes, site donneur d'épissage, un site neutre, site accepteur d'épissage, séquence cible peroxysomes, site accepteur d'épissage, GFP figurant dans le vecteur plasmidique .- Concevoir la construction d'ADN en silico telle qu'il y ait un chevauchement de 50 pb entre chaque pièce lors de la commande des amorces pour PCR. Il est possible d'utiliser le chevauchement de 50 pb comme amorces: 25 paires de bases respectivement.
- Assurez-vous de garder une trace de l'origine de chacun des morceaux de séquence. Est-il aussi: un plasmide d'être cultivées et miniprepped; une séquence linéaire qui peut être utilisé comme matrice de PCR; ou une séquence qui devra êtresynthétisé dans le commerce? Plusieurs entreprises offrent des services de synthèse d'ADN à faible coût pour les fragments <500 pb. Dans ce cas, la TriTag lui-même est 437 pb si il était avantageux de commander le commerce.
- Les meilleurs résultats sont si tous les fragments sont amplifiés par PCR et purifiés à partir de leur ADN matrice. Le marqueur de résistance est un bon endroit pour partager ce grand ADN en deux modèles plus petits qui sont plus facilement amplifié par PCR.
- Restriction enzyme de restriction Dpnl coupe l'ADN méthylé. Si la matrice de PCR était une miniprep à partir de E. coli, le traitement Dpnl va supprimer la matrice d'ADN contaminant.
- Concevoir la construction d'ADN en silico telle qu'il y ait un chevauchement de 50 pb entre chaque pièce lors de la commande des amorces pour PCR. Il est possible d'utiliser le chevauchement de 50 pb comme amorces: 25 paires de bases respectivement.
- Purifier toutes les séquences d'ADN et éluer séparément dans l'eau, ou du tampon TE EB.
- vecteur de pores partie 1, ~ 3000 pb (flèches vertes). PCR amplifié et traité Dpnl.
- vecteur de pores partie 2, ~ 3000 pb (flèches noires). PCR amplifié et traité Dpnl.
- TriTag insert, 437 pb (flèches bleues). Commandé le commerce. Resuspend dans le trou DDH 2 O.
- P ENTCUP promoteur, ~ 750 pb (flèches oranges). PCR-amplifié et traité Dpnl.
- Mesurer les concentrations de chacun des morceaux d'ADN. But pour 150 ng / ul des morceaux de vecteur.
- Prélever une partie aliquote de l'ensemble mélange Gibson du congélateur et décongeler sur la glace. C'est disponible dans le commerce, mais aussi simple à faire dans le laboratoire 12-14.
- Il ya deux étapes à cette recette: un mélange maître de 5x visqueux et 15 pi 1,33 aliquotes réaction de taille. Le mélange maître 5x contient: 3 ml 1 M Tris-HCl pH 7,5, 300 ul de 1 M de MgCl2, 600 ul de 10 mM de chaque dNTP, 300 ul de 1 M DTT, 1,5 g de PEG-8000, 20 mg de NAD, et le trou DDH 2 O à 6 ml. Préparer 320 aliquotes (18) et de geler tous mais à -20 ° C. La solution sera très visqueux. Étiqueter ces "tampon isotherme 5X"
- Pour celui qui reste (320 pi), ajouter 1,2 pi T5 Exonuclease, 20 pl Phusion Haute-Fidelity ADN polymérase, 160 pi de Taq ADN ligase et 700 pi ddH 2 O. Préparer 15 aliquotes (~ 80) sur la glace dans des tubes PCR et conserver à -20 ° C.
- Déterminer les volumes de quantités équimolaires de chacun des fragments. Il ya quelques calculatrices en ligne, y compris Gibthon.org. Il devrait y avoir un total de 5 ul de tous les morceaux d'ADN. Ajoutez-les à la 15 pi Gibson mélanger aliquote. Si cela nécessite des volumes trop petits à la pipette, diluer les fragments d'ADN et / ou d'utiliser plus d'une aliquote.
- N'oubliez pas de préparer un contrôle de l'ADN du vecteur seul (par exemple, la partie de l'ADN contenant le marqueur de résistance à un antibiotique) et porter au volume avec de l'eau.
- Incuber les tubes dans un cycleur thermique à 50-55 ° C pendant 30-60 minutes. Remplacer sur la glace et se transformer en E. coli via choc thermique cellules chimiquement compétentes. Ne pas utiliser des cellules électrocompétentes. La forte concentration en sel et la concentration d'ADN relativement faiblepeut causer des cellules à l'arc.
- Appliquer tous les 20 pi à une préparation commerciale de 200 pi du chlorure de calcium E. compétente coli.
Incuber sur de la glace 30 min et 60 sec choc thermique à 42 ° C - Retour à la glace 2 min, appliquer 750 pi SOC ou milieu LB et récupérer secouant dans un tube à centrifuger 30 min à 37 ° C. Plaque du mélange et des dilutions appropriées sur LB + Kan (ou autre antibiotique approprié). Il peut en résulter fond supérieur (et un nombre plus élevé d'événements de recombinaison non-cibles) que le traditionnel clonage basé ligature, mais il est utile de dépister environ 10 colonies.
- Appliquer tous les 20 pi à une préparation commerciale de 200 pi du chlorure de calcium E. compétente coli.
- Confirmez clone par séquence et stocker une aliquote à -80 ° C
3. Biolistic transfection de tabac avec le pistolet à gènes
Il s'agit d'une technique qui est établi dans JoVE 18,19. Étapes et les principales différences sont décrites ci-dessous.
- Cultivez 50-100 ml E. coli 200 ml ou Agrobacterium. Maxi-prep la culture. Une concentration d'environ 1 500 ng / pl est nécessaire pour continuer.
- Préparer gènes balles d'arme à feu tel que décrit précédemment. Chargez-les dans le pistolet à gènes.
- Pour la transfection de Nicotiana benthamiana tabac tissu feuille épidermique, choisissez une grande feuille près de la base d'une usine de 3 mois. Découpez soigneusement et placez-le côté bas en haut sur des serviettes en papier humide dans une boîte de Petri de 15 cm.
- Régler la pression Il pour le pistolet à gènes à 200-250 psi.
- Viser soigneusement le pistolet à gènes entre les nervures sur la face inférieure d'une feuille, environ 3-5 cm au-dessus. Relâcher la sécurité et délivrer les particules à la feuille. Chaque puce peut être utilisée deux fois au même endroit sur la feuille. Si l'explosion de la feuille, jeter et recommencer une feuille-il nouveau, c'est une certaine variation dans la feuille ténacité en raison de conditions de croissance tels que l'âge, l'humidité, etc Pour un 12 cm feuille, s'attendre à tenir environ 6 coups.
- Rangez la feuille, couvert avec le haut d'unBoîte de Pétri pendant 2-3 jours en basse lumière sur le banc.
- Examinez la feuille dans un microscope de dissection équipé fluorescence UV, et la recherche de cellules individuelles exprimant la GFP. Disséquer 5-10 sections mm de feuille.
- Plonger la feuille dans une lame de microscope dans des puits profonds sous ~ 200 ul de 0,1% de Triton X-100. Le détergent permet d'éviter les bulles d'air de se former sur la surface, et la glissière de microscope bien profond permet une plus grande surface d'imagerie des tissus.
4. Microscopie confocale de tissus transfectées
Ces instructions varient pour chaque instrument, il est donc essentiel de se bien formés.
- Pour les expériences de détection par fluorescence, réglez le laser d'excitation à 489 nm, et définir les détecteurs photomultiplicateurs à 500-569 nm pour fluorescence de la GFP et de 630 à 700 nm pour la chlorophylle auto-fluorescence. cellules de l'image en utilisant un objectif 40x immersion dans l'eau.
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Representative Results
L'effort de conception est le résultat d'une planification importante. Roman de ce projet est l'utilisation de l'épissage alternatif de créer un pré-ARNm qui est traduit en protéines exprimées de façon différentielle. Ces protéines sont exprimées dans différents organelles, dans ce cas, le chloroplaste, des peroxysomes et / ou cytosol. Nous avons adapté gène d'Arabidopsis naturel qui est épissage alternatif 6, et placé chloroplaste 6 et 17 peroxysomes connus ciblant des séquences dans les exons alternatifs (TriTag-1 et TriTag-2). TriTag-3 est constitué d'un signal de peroxysomes incorporé dans une région à faible complexité de la séquence chloroplastique. Ceux-ci ont été placés dans le cadre avec la GFP (Figure 1).
Les plasmides utilisés dans cette étude contenaient donc plusieurs éléments: la variante d'épissage natif schéma thérapeutique à partir du gène PIMT2 6, chloroplaste et des séquences de ciblage de peroxysome, GFP, et un squelette de plasmide. Depuis chacun a très specific séquence requise, une méthode indépendante de la séquence est nécessaire. Le protocole d'assemblage Gibson 12,13 peut être utilisé sur toutes les séquences, tant que les parties constitutives sont conçus avec une similarité de séquence à l'autre, et ne contiennent pas de séquences répétitives. En bref, des fragments d'ADN linéaires sont construits (soit par amplification par PCR, la synthèse du commerce, ou la digestion d'un plasmide de pré-mesure) tels qu'ils ont ~ 50 pb de la séquence homologue de chevauchement (figure 2). Des quantités équimolaires de chacun des fragments d'ADN sont combinés dans un seul tube contenant le mélange ensemble Gibson, incubées à 50 ° C pendant une heure et transformés dans E. coli. Les plasmides obtenus à partir du protocole d'assemblage Gibson ont été confirmées par séquençage de Sanger.
Dans cette étude, les trois constructions des organites cibles GFP ont été comparés à la GFP non balisé et une GFP Rubisco marqués. La microscopie confocale a été utilisée pour détecter la fluorescence de la GFP dans le SIngle cellules transformées de façon transitoire. Dans des expériences témoins, l'expression transitoire observée a été corrélée à des chloroplastes (facilement identifiables par l'auto-fluorescence rouge de la chlorophylle), les noyaux (large organites qui n'est pas un chloroplaste et a seulement une par cellule), et / ou de petits organites pense que peroxysomes. Verte (GFP) et rouges (chlorophylle) autofluorescence canaux ont été recouverts d'étudier la localisation intracellulaire (figure 3). Pour une discussion plus complète de ces résultats, s'il vous plaît voir notre article de compagnon 11.
Comme prévu, dans chacune des trois doubles construits de ciblage, la GFP a été observée dans les chloroplastes (figure 4) dans des micrographies confocales superposition. TriTag-1 et-2 TriTag cible la GFP également vers le cytosol et le petit organite croit être le peroxysome (figures 4a et 4b, respectivement). TriTag-3 cibles de la GFP à seulement le chloroplaste et le peroxysome, mais pasle cytosol (figure 4c). Un résumé des résultats est schématisée (figure 5).
Figure 1. Conception de produits d'assemblage d'épissage alternatif de l'expression d'un organite différentiel dans Nicotiana benthamiana. Splice diagrammes de (a) TriTag-1, (b) TriTag-2, et (c) TriTag-3 montre des séquences non-ciblage (en gris), des chloroplastes séquences de ciblage (vert pâle), séquences de ciblage de peroxysomes (orange), et la séquence codant pour la GFP utilisé dans les expériences d'expression transitoire. TriTag-1 et TriTag-2 sont constitués de constructions d'épissage alternatif; TriTag-3 est constitué d'un signal de peroxysomes incorporé dans une région à faible complexité de la séquence chloroplastique. Des séquences d'
Figure 2 Schéma de montage Gibson:.. Une nouvelle méthode pour l'assemblage de fragments d'ADN se chevauchant Procédé d'assemblage Gibson pour la construction du plasmide 12,13 remplace rapidement clonage traditionnel restriction-ligature dans de nombreux laboratoires. Essentiellement, on peut concevoir une construction in silico qui contient l'ADN d'intérêt exactement, composé de produits de PCR amplifiés à partir de diverses sources. Concevoir des amorces qui sont complémentaires les unes aux autres, et la PCR-amplifier chaque fragment avec les amorces de couleur. Ajouter tous les morceaux dans un seul tube avec le mélange d'enzymes, et transformer E. cellules compétentes E. coli. Cliquez ici pour voir limage Arger.
Figure 3. Traitements de contrôle bombardés en N. benthamiana cellules épidermiques des feuilles. (ac) GFP Untagged. (a) du canal vert. GFP non balisé est exprimé dans le noyau et autour de la périphérie de la cellule, correspondant au cytosol, mais pas la vacuole. (B) rouges indiquent les chloroplastes auto-fluorescence de la chlorophylle. (C) par recouvrement. Dans ce produit d'assemblage de fluorescence est observé dans le noyau et le cytosol seulement, mais pas les chloroplastes. (Df) de contrôle de la GFP-étiqueté chloroplaste. (D) le canal vert. GFP est exprimée dans les grandes organelles, avec une cellule tel que décrit. (E) chloroplastes rouges indiquent autofluorescence de chlore etophyll. (f) de recouvrement. Dans ce cas, les chloroplastes jaunes sont observées, indiquant que la GFP (vert) est ciblé vers le chloroplaste. Reproduit avec la permission 11. Cliquez ici pour agrandir l'image.
Figure 4. Tri-Tag-1, 2, 3 GFP étiqueté fusionné images. (A) Tri-Tag1. Dans ce cas, les périphéries des chloroplastes jaune sont observées, indiquant que la GFP est ciblé vers le chloroplaste. GFP est également observée dans le cytosol ainsi que des petits organites punctiformes qui peuvent être peroxysomes. (B) Tri-Tag2. Dans ce cas, les périphéries des chloroplastes jaune sont observées, indiquant que la GFP est destiné à la c hloroplast. GFP est également observée dans le cytosol ainsi que des petits organites punctiformes qui peuvent être peroxysomes. (C) Tri-Tag3. Dans ce cas, les chloroplastes jaunes sont observées, ainsi que des petits organites ponctuées qui peuvent être peroxysomes. Mais GFP n'est pas observée dans le cytosol. Reproduit avec la permission 11. Cliquez ici pour agrandir l'image.
Figure 5. Compartiments d'une cellule typique de feuilles de tabac de l'épiderme. Voici leurs tailles relatives et des lieux dans la cellule sont présentés, et les niveaux d'expression relatifs observés par microscopie confocale. Reproduit avec la permission 11./ 51234/51234fig5highres.jpg "target =" _blank "> Cliquez ici pour agrandir l'image.
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Discussion
Dans cette étude, des stratégies simples sont décrits pour la localisation d'une seule protéine transgénique à plusieurs compartiments cellulaires chez les plantes. L'objectif était de concevoir construction qui exprimerait un seul gène dans plus d'un organite dans Nicotiana benthamiana. Les stratégies comprennent la conception rationnelle de constructions à base d'ADN GFP, assemblage Gibson, la livraison des plasmides aux cellules de la feuille avec le pistolet à gènes, et l'observation des résultats avec la microscopie confocale.
Trois différents courts, étiquettes N-terminaux ont été conçus pour chloroplaste simultanée, des peroxysomes et cytosol ciblage 11. Ces «TriTags» ont été conçus en combinant les ADN d'origine naturelle codant ARNm épissage alternatif qui dirigent les protéines codées de chaque chloroplaste, plus cytoplasme 6 ou le cytoplasme des peroxysomes, plus 17. TriTag-3 ne se fonde pas sur l'épissage alternatif et se compose d'une séquence de ciblage du chloroplaste, dans lequel na uneturellement partie non structurée a été remplacée par une séquence de ciblage des peroxysomes 15,17. La fonction TriTags in vivo pour cibler la GFP dans les cellules épidermiques des feuilles de Nicotiana benthamiana (Figure 5).
Des micrographies confocales ont montré que TriTag-1 et-2 TriTag cible GFP vers le chloroplaste, peroxysome, et cytosol efficacement, mais avec une préférence pour le chloroplaste et des peroxysomes, respectivement (figures 4a et 4b). TriTag-3 cibles GFP seulement vers le chloroplaste et le peroxysome, mais pas dans le cytosol (figure 4c). En tout, ces balises peuvent réduire le temps et les ressources consacrés sur le clonage pour l'usine d'ingénierie métabolique, en particulier pour ceux qui ont besoin d'expression spécifique dans les chloroplastes et les peroxysomes.
Modifications et dépannage
Les TriTags comme actuellement construits sont assez statique. Cependant, la underlyintechnologie de g, l'épissage alternatif de permettre la traduction des différentes balises spécifiques à l'emplacement, est flexible. Les chloroplastes et / ou des peroxysomes balises spécifiques existants pourraient être modifiés pour tout autre organite, que ce soit la voie de sécrétion, la mitochondrie, une balise de résidence ER, la vacuole. Celles-ci pourraient également être combinés avec des promoteurs spécifiques de tissus, par exemple pour les graines, les fleurs, les racines, les feuilles, les tiges, etc
Pour un projet comme celui-ci, le procédé d'assemblage Gibson 12-14 pour le clonage de constructions est idéal. C'est un outil simple et puissant pour sous-cloner une séquence sans les limitations des sites de restriction. Dans les réactions en une étape, l'assemblage Gibson créé rapidement les constructions et les commandes avec un minimum d'effort dans le clonage. La technique d'assemblage Gibson est presque infiniment modifiable pour toute séquence souhaitée, tant que les séquences de matrice peuvent être amplifiés par PCR. Bien que dans cet exemple l'assemblage Gibson a été montré avec un plasmide digéré, PCR-amplifier le vecteur tendance à mieux fonctionner que d'utiliser une mini-préparation digéré.
Le pistolet à gènes est une méthode rapide et efficace pour la transfection transitoire de cellules, comme cela a été établi par la revue 18,19. Nicotiana benthamiana a de grandes cellules, lobé feuilles épidermiques, qui sont à la fois idéal pour la transfection avec le pistolet à gènes, mais aussi pour l'observation en microscopie confocale. Le protocole pour la fabrication de balles est bien établie. L'or a été utilisé comme un microsupport dans la plupart des expériences dans la littérature à ce jour, mais microsupports de tungstène sont récemment disponibles à faible coût.
Limites des Techniques
Une limitation majeure de la méthode Gibson est la présence de séquences répétées: plus la zone de chevauchement est le produits moins secondaires résultat. La digestion des produits de PCR avec Dpnl devrait supprimer la contamination des modèles de plasmide; qui sont généralement à l'origine de côtéproduits. Les enzymes digérer les fragments d'ADN à partir d'ADN double-brin en simple-brin. La présence de séquences répétées au voisinage des extrémités (~ 1 kb) des fragments d'ADN augmente significativement la possibilité d'une recombinaison illégitime. Ainsi, répète dans les séquences pose aussi une limite: il n'est pas bien connu, et difficile à contrôler dans quelle mesure les mâche T5 exonucléase dos ADN simple brin. L'activité rapide de l'exonucléase est tempérée par la température de réaction élevée (50-55 ° C) par la suite la dénaturation de l'enzyme, et la viscosité en diminuant le mouvement d'ensemble dans la solution. Pour plus de réglage fin de la étapes de réaction, la séquence et la ligature clonage indépendant (SLIC) 20 est préférable.
Une limite importante de la technique du canon à gènes est qu'elle ne produit que de l'ordre de un à dix cellules transformées de façon transitoire par événement de prise de vue.
Significatives par rapport aux méthodes existantes
La technique d'assemblage Gibson connaît une adoption rapide pour sa facilité, la souplesse et l'adaptabilité. Il s'agit d'un protocole plus rapide que le clonage traditionnel restriction / ligature, et ne nécessite pas de séquences spécifiques, tels que ceux qui sont requis pour la digestion de restriction. Il n'est pas limité à deux ou trois fragments d'être recombinés; les chercheurs initiaux ont démontré avec succès pour un maximum de 10 parties, avec toutefois une efficacité limitée. Pour de nombreux chercheurs assemblage Gibson fait un plus grand nombre de clones positifs.
Pour plus de transformants avec des techniques biolistiques, ou pour la création d'un tissu de cal transformé, l'utilisation d'un dispositif biolistique de type armoire (par exemple, le BioRad PDS-1000) devrait être utilisée. Une méthode alternative consiste Agrobacterium infiltration.
Futures applications
Ensemble Gibson permet classes de plus en plus grandes d'ADN à assembler, àle point où une limite maximale n'a pas été observée. Les auteurs originaux ont utilisé pour assembler plusieurs centaines de kilobases d'ADN 13.
La capacité à cibler sélectivement plusieurs organelles avec une construction génétique unique a le potentiel de réduire le nombre de gènes devant être transformée. La livraison des fragments plus en plus grandes d'ADN (et donc de plus grandes voies métaboliques) est un objectif à court terme. Voies isoprénoïdes ont été livrés vers le chloroplaste par des méthodes biolistiques; d'autres groupes de gènes tels que des voies alternatives de fixation de carbone à l'horizon.
Étapes critiques au sein du protocole.
Dans l'assemblage Gibson, être sûr que les séquences de matrice n'ont pas d'homologie les uns aux autres sauf au niveau des sites de recombinaison cible.
Dans la transformation biolistique des plantes de Nicotiana, faire attention à garder le canon à gènes environ 10-15 cm au-dessus des feuilles unee maintenir la pression d'hélium à 200-250 psi. Plus précisément, est la feuille fragile va exploser, et plus loin que cela, ils ne seront pas bien transformées. Deux jours après la transfection d'une ecchymose devrait apparaître sur la feuille si elle est bien transformé.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier Jen Sheen de l'Hôpital général du Massachusetts pour le généreux don de plants de Nicotiana benthamiana. Jen Bush nous a beaucoup aidé dans le conseil en culture des plantes et la mise en place d'une zone de la chambre de croissance. Tom Ferrante de l'Institut Wyss a offert une aide cruciale à la microscopie confocale. Les auteurs tiennent tout particulièrement à remercier Don Ingber de l'Hôpital pour enfants de Boston et de l'Institut Wyss pour le don généreux d'un pistolet Gene et fournitures associées. Le financement de ce projet était prévu par un accord de coopération avec le ministère de l'Énergie Advanced Research Projects Agency (ARPA-E Award # DE-000079) pour PAS, JCW, et MdM, et par Chimerion Biotechnology, Inc. pour MJV.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Oligonucleotide primers | IDT | (custom) | Design specifically for construct |
| GeneBlocks | IDT | (custom) | 500 bp oligonucleotides |
| ApE software | U Utah | (download) | http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/ |
| MinElute kit | Qiagen | 28004 | Used to purify PCR products |
| QIAprep spin miniprep kit | Qiagen | 27104 | Used to prepare cloning-appropriate amounts of plasmid |
| Phusion Master Mix with GC Buffer | NEB | M0532S | Used to PCR-amplify gene of interest |
| Gibson assembly reaction mix | NEB | E2611L | Master mix of the following 9 ingredients |
| 1 M Tris-HCl pH7.5 | Teknova | T1075 | Gibson assembly mix |
| 1 M MgCl2 | G Biosiences | 82023-086 | Gibson assembly mix |
| dNTP mix | Fermentas | R0192 | Gibson assembly mix |
| 1 M DTT | Fermentas | R0861 | Gibson assembly mix |
| PEG-8000 | Affymetrix | 19966 | Gibson assembly mix |
| NAD | Applichem | A1124,0005 | Gibson assembly mix |
| T5 exonuclease | Epicentre | T5E4111K | Gibson assembly mix |
| Phusion polymerase | NEB | F530S | Gibson assembly mix |
| Taq DNA ligase | NEB | M0208L | Gibson assembly mix |
| Gibthon.org | Website to simplify calculations | ||
| Plasmid PLUS Maxi kit | Qiagen | 12963 | Used to prepare DNA for gene gun bullets |
| Gene Gun system | BioRad | 165-2451 | Includes all parts necessary |
| Nicotania benthamiana | (n/a) | (n/a) | Gift of Jen Sheen, MGH |
| Confocal microscope | Leica | SP5 X MP | Imaging of resultant cells |
| Deep well slides | Electron Microscopy Sciences | 71561-01 | Used for confocal imaging |
| A Plasmid Editor (ApE) | University of Utah | http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape | |
| Gibthon:Ligation calculator | http://django.gibthon.org/tools/ligcalc/ |
References
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