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गिब्सन विधानसभा और जीन गन का उपयोग तंबाकू में क्षणिक जीन एक्सप्रेशन

Published: April 18, 2014 doi: 10.3791/51234
Automatic Translation
1,2, 1,2,3, 1,2, 1,2
1Synthetic Biology Platform, Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering, Harvard University, 2Department of Systems Biology, Harvard Medical School, 3Department of Biotechnology, Delft University of Technology

Summary

इस काम के चुनिंदा BioRad जीन बंदूक का इस्तेमाल assayed, पौधों में subcellular organelles को निशाना बनाने के लिए एक उपन्यास विधि का वर्णन करता है.

Abstract

कई subcellular organelles के लिए एक प्रोटीन को लक्षित करने के लिए, पौधों आम तौर पर प्रासंगिक जीन नकल, और अंतर प्रमोटरों और / या संकेत दृश्यों सहित जटिल विनियामक रणनीतियों का उपयोग कर एक अलग जीन व्यक्त करते हैं. मेटाबोलिक इंजीनियरों और एक विशेष organelle एंजाइमों को निशाना बनाने में रुचि सिंथेटिक जीव एक चुनौती के साथ सामना कर रहे हैं: एक से अधिक organelle के लिए स्थानीयकृत किया जा रहा है कि एक प्रोटीन के लिए, इंजीनियर एक ही जीन कई बार क्लोन चाहिए. यह काम इस रणनीति के लिए एक समाधान प्रस्तुत करता है: mRNA की वैकल्पिक splicing दोहन. यह तकनीक स्थापित क्लोरोप्लास्ट और peroxisome को लक्षित दृश्यों का लाभ लेता है और वैकल्पिक रूप से spliced ​​है कि एक एकल mRNA में उन्हें जोड़ती है. कुछ ब्याह वेरिएंट cytosol को peroxisome करने के लिए कुछ है, और कुछ, क्लोरोप्लास्ट के लिए भेजा जाता है. यहाँ प्रणाली कई organelle वैकल्पिक splicing साथ लक्षित करने के लिए बनाया गया है. इस काम में, GFP expr होने की उम्मीद थीतर्क से बनाया गया 5 'mRNA टैग की एक श्रृंखला द्वारा क्लोरोप्लास्ट, cytosol, और peroxisome में essed. ये टैग heterologous जीन कई subcellular organelles में व्यक्त करने की आवश्यकता है जब आवश्यक क्लोनिंग की मात्रा को कम करने की क्षमता है. निर्माणों पिछले काम 11 में डिजाइन किए गए थे, और गिब्सन विधानसभा, प्रतिबंध एंजाइमों की आवश्यकता नहीं है कि एक बंधाव स्वतंत्र क्लोनिंग विधि का उपयोग क्लोन किया गया. परिणामी plasmids एक संशोधित जीन गन प्रोटोकॉल के साथ निकोटियाना benthamiana एपिडर्मल पत्ता कोशिकाओं में शुरू किए गए थे. अंत में, तब्दील पत्ते confocal माइक्रोस्कोपी के साथ मनाया गया.

Introduction

इस काम संयंत्र कोशिकाओं कई अंगों में एक संवाददाता प्रोटीन व्यक्त इंजीनियर लेकिन केवल एक ही डीएनए का निर्माण के साथ कर रहे हैं जिसमें एक चयापचय इंजीनियरिंग / सिंथेटिक जीव विज्ञान परियोजना है.

एक से अधिक स्थान पर प्रोटीन लक्ष्य के लिए एक दृष्टिकोण क्लोनिंग कई आनुवंशिक प्रतियां, एक अलग स्थानीयकरण पेप्टाइड युक्त प्रत्येक शामिल है. प्रत्येक प्रतिलिपि एकल रूपांतरण 1 backcrossing करके, वैकल्पिक रूप से लगातार retransformation द्वारा शुरू की, या किया जाना चाहिए. इस अतिरिक्त क्लोनिंग शामिल है, और टर्मिनस प्रति एक स्थानीयकरण टैग द्वारा सीमित है.

कई स्थानों के लिए एक प्रोटीन स्थानीयकरण करने के लिए एक और तरीका है वैकल्पिक splicing 2-5 के माध्यम से है. शाही सेना के एक जीन से लिखित है, लेकिन प्रतिलेख के विभिन्न प्रतियां सेल प्रति एक से अधिक रास्ते में अक्सर अलग ढंग से कार्रवाई कर रहे हैं. यह एक जीन से लिखित सेल में एक से अधिक दूत शाही सेना में परिणाम कर सकते हैं. ये अलग messengeआर RNAs ही प्रोटीन के विभिन्न isoforms के लिए सांकेतिक शब्दों में बदलना, या एक frameshift, कुल मिलाकर एक अलग प्रोटीन के मामले में कर सकते हैं. वैकल्पिक splicing कई वर्षों के लिए साहित्य में वर्णित किया गया है, कार्रवाई और संरक्षित दाता और रिसेप्टर ब्याह साइटों के तंत्र केवल अधिक हाल ही में 6 elucidated किया जा रहा है. इन साइटों बेहतर वर्णित किया जा रहा है के रूप में, वे इंजीनियरिंग के लिए अवसर खुले.

कई अंगों में एक प्रोटीन व्यक्त जब संयंत्र चयापचय इंजीनियरों एक चुनौती के साथ सामना कर रहे हैं. एक से अधिक organelle के लिए स्थानीयकृत किया जा रहा है कि एक प्रोटीन के लिए, इंजीनियर ब्याज की organelle करने निर्देशन में एक अलग संकेत अनुक्रम के साथ, एक ही जीन प्रत्येक कई बार क्लोन चाहिए. तीन अंगों में किसी एक जीन के लिए, यह केवल तीन जीन है. लेकिन एक छह जीन चयापचय मार्ग के लिए, यह 18 जीन, एक महत्वपूर्ण क्लोनिंग प्रयास करने के लिए फैलता है. एक एकल, वैकल्पिक रूप से, spliced ​​जीन हस्ताक्षर में कई स्थानीयकरण दृश्यों का मेलificantly इस प्रयास को कम करता है. उदाहरण के लिए, फिर से इंजीनियरिंग photorespiration 7,8 और isoprenoid संश्लेषण 9,10 क्लोरोप्लास्ट और पेरोक्सिज़ोम दोनों शामिल है. एक प्राकृतिक Arabidopsis thaliana प्रणाली में मनाया के रूप में हमारे मामले में हम पहले 6 वर्णित ब्याह साइटों का फायदा उठाया. हम तर्क से अकेले प्राकृतिक ब्याह साइटों छोड़ने mRNA अनुक्रम बदल दिया, लेकिन वैकल्पिक रूप-spliced ​​introns (चित्रा 1) के भीतर क्लोरोप्लास्ट या peroxisome लक्ष्य टैग सांकेतिक शब्दों में बदलना होगा कि दृश्यों रखा. व्यक्त प्रोटीन या यह इनकोडिंग कि पूर्व mRNA एक intron (आंकड़े 1G और 1) के रूप में excised गया था पर निर्भर करता है, एक टैग नहीं हो सकता है. इस काम में प्रस्तुत निर्माणों के डिजाइन पर अधिक जानकारी के लिए, साथी अनुच्छेद 11 देखें.

यह अभी भी एक महत्वपूर्ण क्लोनिंग प्रयास, गिब्सन विधानसभा, डीएनए निर्माणों क्लोनिंग के लिए एक नई विधि है, क्योंकि यू हैनिर्माण में sed. गिब्सन विधि की परवाह किए बिना प्रतिबंध साइटों (चित्रा 2) के 12-14 की, किसी भी दृश्य के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. एंजाइमों के विशिष्ट मिश्रण एक एक कदम, इज़ोटेर्माल विधानसभा के लिए अनुमति देता है. इस विधि में, कई डबल असहाय रैखिक डीएनए भागों वे 50 बीपी ~ की ओवरलैपिंग दृश्य है कि इस तरह डिजाइन किए हैं. गिब्सन विधानसभा एंजाइम मिश्रण आंशिक रूप मुताबिक़ दृश्यों के एक किस्में उजागर रैखिक डीएनए भागों हज़म. ये आंशिक एकल असहाय दृश्यों एक तेजी से, एक कदम, अनुक्रम स्वतंत्र, बंधाव मुक्त subcloning प्रतिक्रिया में जिसके परिणामस्वरूप प्रतिक्रिया मिश्रण में फिर से annealed रहे हैं.

इस काम संयंत्र क्लोरोप्लास्ट, पेरोक्सिज़ोम, और cytosols में अभिव्यक्ति के लिए 1) तर्कसंगत डिजाइन वैकल्पिक रूप से spliced ​​निर्माणों का वर्णन, 2) उनके क्लोनिंग गिब्सन विधानसभा के नए बंधाव से मुक्त विधि का उपयोग, 3) जीन गन के साथ तम्बाकू पत्ती कोशिकाओं में उनके वितरण, और GFP के साथ मनाया के रूप में, organelle लक्ष्यीकरण दिखा 4) के परिणामऔर confocal माइक्रोस्कोपी.

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Protocol

लक्ष्य निर्धारण एकाधिक Organelle के लिए वैकल्पिक-spliced ​​दृश्यों के 1. डिजाइन

  1. अंतिम प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए साइटों का निर्धारण करते हैं. इस काम के लिए, ब्याज क्लोरोप्लास्ट, peroxisome, और cytosol को निशाना बनाने में है.
  2. ब्याज की organelles के लिए प्रोटीन लक्ष्य के लिए जाना जाता प्रोटीन और डीएनए दृश्यों की पहचान करने के लिए साहित्य का उपयोग करें. इस मामले में एक क्लोरोप्लास्ट Arabidopsis thaliana एल isoaspartate मिथाइल 6,15 से अनुक्रम को लक्षित, और Arabidopsis thaliana transthyretin तरह एस allantoin synthase 16,17 से अनुक्रम को लक्षित एक peroxisome निर्धारित किया गया है.
  3. सही organelles के लिए ब्याज की प्रोटीन लक्ष्य होना चाहिए कि एक वैकल्पिक splicing शासन को पहचानें. एक प्राकृतिक एराबिडोप्सिस प्रणाली 6 में मनाया के रूप में इस काम के लिए, साइटों ब्याह. mRNA अनुक्रम प्राकृतिक ब्याह साइटों छोड़ने बदल दिया गया, लेकिन दृश्यों एन्कोडिंग क्लोरोप्लास्ट या peroxis रखा गयावैकल्पिक रूप से, spliced ​​इंट्रोन्स भीतर टैग (चित्रा 1) ome लक्ष्य.

डीएनए पार्ट्स की 2. गिब्सन विधानसभा

2 आंकड़ा भी देखें.

गिब्सन विधानसभा विधि) 1 करने के लिए एक पूर्व बनाया मिश्रण में कई एंजाइमों की कार्रवाई पर निर्भर करता है, आंशिक रूप से एक किस्में और डीएनए भागों पड़ोसी के 2) पानी रखना मानार्थ आधार जोड़े बनाने के लिए डबल असहाय डीएनए के सिरों को पचाने. यह प्रतिबंध साइटों की सीमाओं के बिना डीएनए टुकड़े की क्लोनिंग के लिए अनुमति देता है.

  1. डीएनए प्लाज्मिड निर्माण में तत्वों के लिए एक आदेश चुनें. एक) एक प्लाज्मिड संयंत्र, एक kanamycin प्रतिरोध मार्कर में काम करने के लिए जाना जाता है एक GFP निर्माण युक्त वेक्टर (ताकना, और ई. कोलाई और Agrobacterium मेजबान tumefaciens), ख) एक के लिए प्रतिकृति का मूल: एक उदाहरण के रूप TriTag -1 का तत्व है प्रमोटर अनुक्रम, (पी ENTCUP2, पौधों में विधान होना दिखाया), सी) अनुक्रम (सीटीएस) को लक्षित एक क्लोरोप्लास्ट, ग) एक peroxisome) पहले 6 वर्णित के रूप में ब्याह साइटों की एक श्रृंखला अनुक्रम (अंक), और डी को लक्षित.
  2. निर्माण स्थल के लिए आधार के साथ सिलिको डिजाइन सॉफ्टवेयर में डिजाइन. वानर इस काम के लिए उपयोगी एक खुला स्रोत फ्रीवेयर पैकेज है.
    नोट: TriTag -1, आदेश है: प्लाज्मिड वेक्टर, प्रमोटर, ATG, ब्याह दाता साइट, क्लोरोप्लास्ट लक्ष्य अनुक्रम, ब्याह दाता साइट, तटस्थ साइट, ब्याह स्वीकर्ता साइट, peroxisome लक्ष्य अनुक्रम, ब्याह स्वीकर्ता साइट, GFP प्लाज्मिड वेक्टर में निहित के रूप में .
    1. पीसीआर के लिए प्राइमरों जब आदेश प्रत्येक टुकड़ा के बीच एक 50 बीपी ओवरलैप ऐसी है कि वहाँ में सिलिको डीएनए का निर्माण डिजाइन. 25 बीपी प्रत्येक दिशा: यह प्राइमरों के रूप में 50 बीपी ओवरलैप का उपयोग करना संभव है.
      1. अनुक्रम टुकड़े में से प्रत्येक के मूल का ट्रैक रखने के लिए सुनिश्चित करें. यह इस प्रकार है: हो गई है और miniprepped होने के लिए एक प्लाज्मिड; एक पीसीआर टेम्पलेट के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक रेखीय अनुक्रम; या होने की जरूरत है कि एक अनुक्रमव्यावसायिक रूप से संश्लेषित? कई कंपनियों के टुकड़े <500 बीपी के लिए कम लागत वाली डीएनए संश्लेषण सेवाएं प्रदान करते हैं. यह व्यावसायिक तौर पर यह व्यवस्था के लिए फायदेमंद था इसलिए इस मामले में, TriTag ही 437 बीपी है.
      2. सभी टुकड़े पीसीआर प्रवर्धित और उनके टेम्पलेट डीएनए से शुद्ध कर रहे हैं, तो सबसे अच्छा परिणाम आ जाएगा. प्रतिरोध मार्कर अधिक आसानी से पीसीआर परिलक्षित कर रहे हैं कि दो छोटे टेम्पलेट्स में इस बड़े डीएनए विभाजित करने के लिए एक अच्छी जगह है.
      3. प्रतिबंध प्रतिबंध एंजाइम DpnI डीएनए methylated कटौती. पीसीआर टेम्पलेट ई. से एक Miniprep था तो कोली, DpnI इलाज contaminating टेम्पलेट डीएनए निकाल देंगे.
  3. सभी को अलग डीएनए अनुक्रम को शुद्ध और पानी, ते या बफर ईबी में elute.
    1. ताकना वेक्टर भाग 1, ~ 3000 बीपी (हरी तीर). पीसीआर प्रवर्धित और DpnI इलाज किया.
    2. ताकना वेक्टर भाग 2, ~ 3000 बीपी (काला तीर). पीसीआर प्रवर्धित और DpnI इलाज किया.
    3. TriTag डालने, 437 बीपी (नीले तीर). व्यावसायिक रूप से आदेश दिया. आरesuspend DDH 2 ओ में
    4. पी ENTCUP प्रमोटर, ~ 750 बीपी (नारंगी तीर). पीसीआर प्रवर्धित और DpnI इलाज किया.
  4. डीएनए टुकड़े में से प्रत्येक की सांद्रता उपाय. वेक्टर टुकड़े के 150 एनजी / μl के लिए निशाना लगाओ.
  5. फ्रीजर से बाहर गिब्सन विधानसभा मिश्रण का एक विभाज्य ले लो और बर्फ पर पिघलना. इस प्रयोगशाला 12-14 में बनाने के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है, लेकिन यह भी आसान है.
    1. एक चिपचिपा 5x मास्टर मिश्रण और 15 μl प्रतिक्रिया आकार 1.33x aliquots: यह नुस्खा के लिए दो चरण हैं. 5x मास्टर मिश्रण होता है: 3 एमएल 1 एम Tris-एचसीएल 7.5 पीएच, 300 μl 1 एम 2 MgCl, प्रत्येक dNTP के 600 μl 10 मिमी, 300 μl 1 एम डीटीटी, 1.5 ग्राम खूंटी 8000, 20 मिलीग्राम NAD, और DDH 2 6 मिलीलीटर हे. 320 μl aliquots (18) तैयार करें और -20 डिग्री सेल्सियस पर सभी लेकिन एक फ्रीज समाधान काफी चिपचिपा हो जाएगा. इन "5X इज़ोटेर्म बफर" लेबल
    2. (320 μl) शेष एक करने के लिए, 1.2 μl T5 exonuclease, 20 μl Phusion उच्च फिड जोड़elity डीएनए पोलीमरेज़, 160 μl Taq डीएनए ligase और 700 μl DDH 2 ओ 15 μl aliquots (~ 80) -20 पर पीसीआर ट्यूब और दुकान में बर्फ पर ° तैयार करें सी.
  6. टुकड़ों में से प्रत्येक की equimolar मात्रा के लिए संस्करणों का निर्धारण करते हैं. Gibthon.org सहित कुछ ऑनलाइन कैलकुलेटर, कर रहे हैं. सभी डीएनए टुकड़े के 5 μl की कुल होनी चाहिए. गिब्सन विभाज्य मिश्रण 15 μl के लिए उन्हें जोड़ने. इस पिपेट के लिए बहुत छोटी मात्रा में आवश्यकता है, डीएनए टुकड़े पतला और / या एक से अधिक विभाज्य का उपयोग करें.
    1. अकेले वेक्टर डीएनए के एक नियंत्रण तैयार (एंटीबायोटिक प्रतिरोध मार्कर युक्त जैसे डीएनए हिस्सा) और पानी के साथ मात्रा बनाने के लिए मत भूलना.
  7. 30-60 मिनट के लिए 50-55 डिग्री सेल्सियस पर एक थर्मल cycler में ट्यूब सेते हैं. बर्फ पर बदलें और ई. में बदलना गर्मी झटका रासायनिक सक्षम कोशिकाओं के माध्यम से कोलाई. Electrocompetent कोशिकाओं का उपयोग न करें. उच्च नमक एकाग्रता और अपेक्षाकृत कम डीएनए एकाग्रताकोशिकाओं चाप का कारण बन सकता है.
    1. 200 μl कैल्शियम क्लोराइड का एक व्यावसायिक तैयारी सक्षम ई. के लिए सभी 20 μl लागू करें कोलाई.
      42 डिग्री सेल्सियस पर बर्फ 30 मिनट और गर्मी झटका 60 सेकंड पर सेते
    2. , बर्फ 2 मिनट पर लौटें 750 μl समाज या लेग मध्यम लागू करते हैं और 37 डिग्री सेल्सियस पर एक microcentrifuge ट्यूब में 30 मिनट में मिलाते की वसूली लेग + कान (या अन्य उपयुक्त एंटीबायोटिक) पर मिश्रण और उपयुक्त dilutions के प्लेट. इस पारंपरिक बंधाव आधारित क्लोनिंग से अधिक पृष्ठभूमि (और गैर लक्ष्य पुनर्संयोजन घटनाओं की एक उच्च संख्या) में हो सकता है, लेकिन इसके बारे में 10 कालोनियों स्क्रीन करने के लिए सार्थक है.
  8. अनुक्रम के माध्यम से क्लोन की पुष्टि करें और -80 डिग्री सेल्सियस पर एक विभाज्य की दुकान

जीन गन के साथ तंबाकू के 3. Biolistic अभिकर्मक

इस जौव 18,19 में स्थापित किया है कि एक तकनीक है. महत्वपूर्ण कदम है और मतभेदों को नीचे वर्णित है.

  1. 50-100 मिलीग्राम ई. आगे बढ़ें सहली या 200 मिलीलीटर Agrobacterium. मैक्सी तैयार संस्कृति. के बारे में 1,500 एनजी / के एक एकाग्रता μl जारी रखने के लिए आवश्यक है.
  2. पहले से वर्णित के रूप में जीन बंदूक की गोलियों की तैयारी. जीन गन में उन्हें लोड.
  3. निकोटियाना benthamiana तम्बाकू पत्ती एपिडर्मल ऊतक के अभिकर्मक के लिए, एक 3 महीने पुराने संयंत्र के आधार के करीब एक बड़ी पत्ती का चयन करें. इसे ध्यान में कटौती और एक 15 सेमी पेट्री डिश में गीला कागज तौलिए पर यह नीचे की ओर रखें.
  4. 200-250 साई जीन गन के लिए वह दबाव सेट करें.
  5. ध्यान के बारे में 3-5 सेमी यह ऊपर, एक पत्ती के नीचे की ओर पसलियों के बीच जीन बंदूक उद्देश्य. सुरक्षा को छोड़ दें और पत्ते को कणों उद्धार. एक गोली पत्ती पर एक ही स्थान में दो बार इस्तेमाल किया जा सकता है. पत्ती फट, त्यागने और शुरू करते हैं तो एक नया अध्याय वहाँ पत्ती क्रूरता में कुछ भिन्नता की वजह से इस तरह के एक 12 सेमी पत्ती के लिए, के बारे में 6 शॉट्स फिट करने की उम्मीद आदि उम्र, नमी, के रूप में विकास की स्थिति के लिए है.
  6. एक के ऊपर के साथ कवर पत्ती, स्टोरबेंच पर कम रोशनी में 2-3 दिनों के लिए पेट्री डिश.
  7. यूवी प्रतिदीप्ति से लैस एक विदारक माइक्रोस्कोप में पत्ती की जांच, और GFP व्यक्त व्यक्ति की कोशिकाओं के लिए खोज करते हैं. पत्ती के 5-10 मिमी वर्गों काटना.
  8. ~ 200 μl 0.1% ट्राइटन X-100 के तहत एक गहरी अच्छी तरह खुर्दबीन स्लाइड में पत्ती डूब. डिटर्जेंट सतह पर बनाने से हवाई बुलबुले को रोकने में मदद करता है, और अच्छी तरह से गहरी खुर्दबीन स्लाइड एक बड़ा ऊतक इमेजिंग क्षेत्र के लिए अनुमति देता है.

ट्रांसफ़ेक्ट ऊतक के 4. Confocal माइक्रोस्कोपी

ये निर्देश हर साधन के लिए अलग अलग है, तो यह ठीक से प्रशिक्षित करने के लिए आवश्यक है.

  1. प्रतिदीप्ति का पता लगाने के प्रयोगों के लिए, 489 एनएम उत्तेजना लेजर सेट, और GFP प्रतिदीप्ति और क्लोरोफिल ऑटो प्रतिदीप्ति के लिए 630-700 एनएम के लिए 500-569 एनएम photomultiplier डिटेक्टरों निर्धारित किया है. एक 40x पानी विसर्जन उद्देश्य का उपयोग कर छवि कोशिकाओं.

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Representative Results

डिजाइन के प्रयास महत्वपूर्ण योजना का एक परिणाम था. इस परियोजना के लिए उपन्यास विभिन्न व्यक्त प्रोटीन में अनुवाद किया है कि एक पूर्व mRNA बनाने के लिए वैकल्पिक splicing का इस्तेमाल होता है. ये प्रोटीन इस मामले में, विभिन्न अंगों में व्यक्त कर रहे हैं क्लोरोप्लास्ट, peroxisome और / या cytosol. हम वैकल्पिक रूप से 6 spliced ​​है कि प्राकृतिक एराबिडोप्सिस जीन रूपांतरित, और (TriTag -1 और TriTag -2) वैकल्पिक एक्सॉनों में दृश्यों को लक्षित क्लोरोप्लास्ट 6 और peroxisome 17 में जाना जाता रखा. TriTag -3 क्लोरोप्लास्ट अनुक्रम का एक कम जटिलता क्षेत्र के भीतर एम्बेडेड एक peroxisome संकेत होते हैं. इन GFP (चित्रा 1) के साथ फ्रेम में रखा गया था.

दृश्यों, GFP को लक्षित PIMT2 जीन 6, क्लोरोप्लास्ट और peroxisome से देशी वैकल्पिक splicing आहार, और एक प्लाज्मिड रीढ़: इस अध्ययन में इस्तेमाल plasmids इस प्रकार कई तत्व निहित. प्रत्येक बहुत कल्पना है के बाद सेific अनुक्रम की आवश्यकता है, एक अनुक्रम स्वतंत्र विधि आवश्यक है. गिब्सन विधानसभा प्रोटोकॉल 12,13 इतने लंबे समय के घटक भागों एक दूसरे के अनुक्रम समानता के साथ डिजाइन किए हैं के रूप में किसी भी दृश्यों पर इस्तेमाल किया जा सकता है, और दोहरा दृश्यों शामिल नहीं है. संक्षेप में, रैखिक डीएनए टुकड़े (या तो पीसीआर प्रवर्धन, वाणिज्यिक संश्लेषण, या एक पूर्व बनाया प्लाज्मिड के पाचन के माध्यम से) का निर्माण कर रहे हैं वे अतिव्यापी मुताबिक़ अनुक्रम की ~ 50 बीपी (चित्रा 2) है कि इस तरह के. डीएनए टुकड़े में से प्रत्येक के equimolar मात्रा में एक घंटे के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पर incubated गिब्सन विधानसभा मिश्रण, जिसमें एक ट्यूब में संयुक्त, और ई. में तब्दील हो रहे हैं कोलाई. गिब्सन विधानसभा प्रोटोकॉल से उत्पन्न plasmids सेंगर अनुक्रमण द्वारा की पुष्टि की थी.

इस अध्ययन में तीन अलग GFP organelle लक्ष्य निर्माणों untagged GFP और एक Rubisco टैग GFP की तुलना में थे. Confocal माइक्रोस्कोपी सी में GFP प्रतिदीप्ति पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया थाngle कोशिकाओं transiently बदल दिया. नियंत्रण प्रयोगों में मनाया क्षणिक अभिव्यक्ति (क्लोरोफिल के लाल autofluorescence द्वारा आसानी से पहचाना) क्लोरोप्लास्ट, नाभिक (एक क्लोरोप्लास्ट नहीं है और सेल में केवल एक है कि बड़े organelle) के लिए सहसंबद्ध, और / या छोटे organelles माना जा रहा था पेरोक्सिज़ोम. ग्रीन (GFP) और लाल (क्लोरोफिल autofluorescence) चैनलों intracellular स्थानीयकरण (चित्रा 3) का अध्ययन करने मढ़ा गया. इन परिणामों की एक और पूरी चर्चा के लिए, हमारे साथी अनुच्छेद 11 देखें.

जैसा कि भविष्यवाणी की, सभी तीन दोहरे को लक्षित निर्माणों में, GFP ओवरले confocal micrographs में क्लोरोप्लास्ट में (चित्रा 4) मनाया गया. TriTag -1 और TriTag -2 लक्ष्य cytosol और peroxisome (आंकड़े -4 ए और 4 बी, क्रमशः) माना जा रहा छोटे organelle को भी GFP. केवल क्लोरोप्लास्ट और peroxisome, लेकिन नहीं करने के लिए TriTag -3 लक्ष्य GFPcytosol (चित्रा 4C). परिणामों का सारांश (चित्रा 5) diagrammed है.

चित्रा 1
निकोटियाना benthamiana में अंतर organelle अभिव्यक्ति के लिए वैकल्पिक splicing निर्माणों का आंकड़ा 1. डिजाइन. (एक) TriTag -1 के चित्र ब्याह, (ख) TriTag-2, और (ग) TriTag -3 गैर लक्षित कर दृश्यों दिखा (ग्रे), क्लोरोप्लास्ट लक्षित कर दृश्यों (हल्का हरा), peroxisome को लक्षित दृश्यों (नारंगी), और क्षणिक अभिव्यक्ति प्रयोगों में इस्तेमाल किया GFP कोडन अनुक्रम. TriTag -1 और TriTag -2 वैकल्पिक splicing निर्माणों से मिलकर; TriTag -3 क्लोरोप्लास्ट अनुक्रम का एक कम जटिलता क्षेत्र के भीतर एम्बेडेड एक peroxisome संकेत होते हैं. के दृश्यों (ई) TriTag-2, और (च) TriTag-3. इन दृश्यों के अंत में ATG codon कोडोन शुरू GFP से मेल खाती है. वैकल्पिक रूप से spliced ​​को लक्षित क्षेत्रों को रेखांकित कर रहे हैं. दाता और स्वीकर्ता dimers रेखांकित कर रहे हैं. हल्के हरे रंग की डीएनए अनुक्रम क्षेत्र 6 कोडिंग PIMT2 5 'से निकाले जाते हैं और क्लोरोप्लास्ट को लक्षित अनुक्रम (हरा) एन्कोडिंग दृश्यों में शामिल हैं. प्रकाश नारंगी डीएनए अनुक्रम क्षेत्र 17 कोडिंग टीटीएल 5 'से निकाले जाते हैं और peroxisome को लक्षित अनुक्रम (नारंगी) एन्कोडिंग दृश्यों में शामिल हैं. TriTag -3 क्लोरोप्लास्ट अनुक्रम का एक कम जटिलता क्षेत्र के भीतर एम्बेडेड एक peroxisome संकेत होते हैं. (छ) TriTag -1 और (ज) TriTag-2 के लिए व्यक्त माना जा रहा अंतिम mRNAs का Schematics. अनुमति 11 के साथ पुनर्प्रकाशित. बड़ा आईएमए देखने के लिए यहां क्लिक करेंजीई.

चित्रा 2
चित्रा 2 गिब्सन विधानसभा के लिए योजनाबद्ध:.. डीएनए टुकड़े ओवरलैपिंग की विधानसभा के लिए एक उपन्यास विधि प्लाज्मिड निर्माण 12,13 के लिए गिब्सन विधानसभा विधि तेजी से कई प्रयोगशालाओं में पारंपरिक प्रतिबंध-बंधाव क्लोनिंग की जगह है. मूलतः, एक विभिन्न स्रोतों से परिलक्षित पीसीआर उत्पादों से बना वास्तव में ब्याज का डीएनए, जिसमें वह सिलिको में एक निर्माण डिजाइन कर सकते हैं. एक दूसरे के पूरक हैं कि प्राइमरों डिजाइन, और रंग प्राइमरों के साथ प्रत्येक टुकड़ा पीसीआर बढ़ाना. एंजाइम मिश्रण के साथ एक एकल ट्यूब में सभी टुकड़ों को जोड़ने, और ई. बदलना कोली सक्षम कोशिकाओं. एल देखने के लिए यहां क्लिक करेंarger छवि.

चित्रा 3
चित्रा 3. नियंत्रण उपचार एन में बमबारी benthamiana पत्ती एपिडर्मल कोशिकाओं. (एसी) untagged GFP. (क) ग्रीन चैनल. Untagged GFP cytosol के लिए इसी नाभिक में और सेल परिधि के आसपास व्यक्त की, लेकिन है नहीं रिक्तिका. (ख) लाल क्लोरोप्लास्ट क्लोरोफिल के autofluorescence संकेत मिलता है. (ग) ओवरले. इस निर्माण प्रतिदीप्ति में नाभिक और केवल cytosol में मनाया, लेकिन नहीं क्लोरोप्लास्ट. (डीएफ) क्लोरोप्लास्ट टैग GFP नियंत्रण. (डी) ग्रीन चैनल है. GFP उल्लिखित के रूप में एक सेल के साथ बड़े organelles, में व्यक्त किया है. (ई) लाल क्लोरोप्लास्ट Chlor के autofluorescence का संकेतophyll. (च) ओवरले. इस मामले में पीले क्लोरोप्लास्ट GFP (हरा) क्लोरोप्लास्ट कि लक्षित है, यह दर्शाता मनाया जाता है. अनुमति 11 के साथ पुनर्प्रकाशित. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 4
चित्रा 4. त्रिकोणीय टैग -1, 2, 3 टैग GFP छवियों विलय कर दिया. (एक) सप्ताह में तीन tag1. इस मामले में पीले क्लोरोप्लास्ट परिधि GFP क्लोरोप्लास्ट कि लक्षित है, यह दर्शाता मनाया जाता है. GFP भी cytosol के साथ ही पेरोक्सिज़ोम हो सकता है कि छोटे कबरा organelles में मनाया जाता है. (ख) सप्ताह में तीन tag2. इस मामले में पीले क्लोरोप्लास्ट परिधि GFP सी का लक्ष्य है कि, यह दर्शाता मनाया जाता है hloroplast. GFP भी cytosol के साथ ही पेरोक्सिज़ोम हो सकता है कि छोटे कबरा organelles में मनाया जाता है. (ग) त्रिकोणीय tag3. इस मामले में पीले क्लोरोप्लास्ट के रूप में अच्छी तरह से पेरोक्सिज़ोम हो सकता है कि छोटे कबरा organelles के रूप में मनाया जाता है. लेकिन GFP cytosol में नहीं मनाया जाता है. अनुमति 11 के साथ पुनर्प्रकाशित. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 5
चित्रा 5. एक ठेठ तम्बाकू पत्ती एपिडर्मल सेल के डिब्बों. यहां उनके रिश्तेदार आकार और सेल के अंदर दिखाया गया है, और रिश्तेदार अभिव्यक्ति के स्तर confocal माइक्रोस्कोपी के माध्यम से मनाया जाता है. अनुमति 11 के साथ पुनर्प्रकाशित./ 51234/51234fig5highres.jpg "लक्ष्य =" _blank "> बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

इस अध्ययन में, सरल रणनीति पौधों में कई सेलुलर डिब्बों को एक भी ट्रांसजेनिक प्रोटीन स्थानीयकृत के लिए वर्णित हैं. लक्ष्य निकोटियाना benthamiana में एक से अधिक organelle में एक जीन व्यक्त होता है कि निर्माण करने के लिए डिजाइन किया गया था. रणनीतियाँ तर्कसंगत GFP आधारित डीएनए निर्माणों की डिजाइन, गिब्सन विधानसभा, जीन गन के साथ पत्ता कोशिकाओं को plasmids के वितरण, और confocal माइक्रोस्कोपी के साथ परिणामों के अवलोकन में शामिल हैं.

तीन अलग छोटी, एन टर्मिनल टैग 11 को लक्षित एक साथ क्लोरोप्लास्ट, peroxisome और cytosol के लिए डिजाइन किए गए थे. ये "TriTags" क्लोरोप्लास्ट प्लस कोशिका द्रव्य 6 या peroxisome प्लस कोशिका द्रव्य 17 या तो इनकोडिंग प्रोटीन प्रत्यक्ष कि वैकल्पिक रूप से spliced ​​mRNAs एन्कोडिंग स्वाभाविक रूप से होती DNAs संयोजन के द्वारा डिजाइन किए गए थे. TriTag -3 वैकल्पिक splicing पर भरोसा करते हैं और जिसमें एक ना एक क्लोरोप्लास्ट को लक्षित अनुक्रम के होते नहीं करताturally असंरचित भाग एक peroxisomal लक्ष्यीकरण अनुक्रम 15,17 साथ प्रतिस्थापित किया गया है. निकोटियाना benthamiana पत्ती एपिडर्मल कोशिकाओं में GFP (चित्रा 5) को लक्षित करने के लिए vivo में TriTags समारोह.

Confocal micrographs प्रभावी ढंग से क्लोरोप्लास्ट, peroxisome, और cytosol तक कि TriTag -1 और TriTag -2 लक्ष्य GFP दिखाया, लेकिन क्रमशः क्लोरोप्लास्ट और peroxisome, के लिए प्राथमिकता के साथ (आंकड़े -4 ए और 4 बी). TriTag -3 लक्ष्य क्लोरोप्लास्ट और peroxisome को केवल GFP, लेकिन नहीं cytosol (चित्रा 4C). सभी में, इन टैग के समय को कम कर सकते हैं और संसाधनों को विशेष रूप से क्लोरोप्लास्ट और पेरोक्सिज़ोम में विशिष्ट अभिव्यक्ति की आवश्यकता होगी, उन लोगों के लिए, संयंत्र चयापचय इंजीनियरिंग के लिए क्लोनिंग पर बिताया.

संशोधन और समस्या निवारण

के रूप में वर्तमान में निर्माण TriTags काफी स्थिर हैं. हालांकि, underlyinअलग स्थान विशेष टैग का अनुवाद अनुमति देने के लिए जी प्रौद्योगिकी, वैकल्पिक splicing, लचीला है. मौजूदा क्लोरोप्लास्ट और / या peroxisome विशिष्ट टैग यह स्राव मार्ग, माइटोकांड्रिया, एक ईआर निवास टैग, कोटर हो, किसी भी अन्य organelle के लिए बदला जा सकता है. ये भी आदि बीज, फूल, जड़ें, पत्तियां, उपजी है, के लिए जैसे ऊतक विशेष प्रमोटरों, के साथ जोड़ा जा सकता है

इस एक, निर्माणों क्लोनिंग के लिए गिब्सन विधानसभा विधि 12-14 के रूप में एक परियोजना के लिए आदर्श है. यह प्रतिबंध साइटों की सीमाओं के बिना किसी भी क्रम subclone के लिए एक सरल, शक्तिशाली उपकरण है. एक कदम प्रतिक्रियाओं में, गिब्सन विधानसभा तेजी से क्लोनिंग में न्यूनतम प्रयास के साथ निर्माणों और नियंत्रण बनाया. गिब्सन विधानसभा तकनीक इतने लंबे समय टेम्पलेट दृश्यों पीसीआर परिलक्षित किया जा सकता के रूप में किसी भी वांछित अनुक्रम के लिए लगभग असीम रूप से परिवर्तनीय है. इस उदाहरण में गिब्सन विधानसभा एक पचा प्लाज्मिड के साथ दिखाया गया था, पीसीआर amplifying वेक्टर एक पच Miniprep उपयोग करने से बेहतर काम करने की आदत है.

इस पत्रिका 18,19 द्वारा स्थापित किया गया है के रूप में जीन गन, कोशिकाओं के क्षणिक अभिकर्मक के लिए एक तेजी से, प्रभावी तरीका है. निकोटियाना benthamiana बड़े, लोदार पत्ती एपिडर्मल जीन गन के साथ अभिकर्मक के लिए दोनों आदर्श हैं जो कोशिकाओं को, लेकिन यह भी के लिए है confocal माइक्रोस्कोपी के साथ देख. गोलियों बनाने के लिए प्रोटोकॉल अच्छी तरह से स्थापित है. गोल्ड इस प्रकार अब तक साहित्य में सबसे प्रयोगों में एक microcarrier के रूप में इस्तेमाल किया गया है, लेकिन टंगस्टन microcarriers कम कीमत पर हाल ही में उपलब्ध हैं.

तकनीक की सीमाएं

गिब्सन विधि का एक प्रमुख सीमा दोहराया दृश्यों की उपस्थिति है: अब अतिव्यापी क्षेत्र कम साइड उत्पादों परिणाम है. DpnI साथ पीसीआर उत्पादों की पाचन प्लाज्मिड टेम्पलेट्स contaminating को दूर करना चाहिए; आमतौर पर पक्ष का स्रोत हैं जोउत्पादों. एंजाइमों एकल असहाय में डबल असहाय डीएनए से डीएनए टुकड़े को पचाने. डीएनए टुकड़े के सिरों (~ 1 केबी) के पास दोहराया दृश्यों की उपस्थिति काफी अनुचित पुनर्संयोजन की संभावना बढ़ जाती है. साथ ही, दृश्यों भीतर दोहराता भी एक सीमा मुद्रा: यह अच्छी तरह से जाना जाता है, और T5 exonuclease chews एकल असहाय डीएनए बैक कितनी दूर नियंत्रित करने के लिए मुश्किल नहीं है. exonuclease की तेजी गतिविधि उच्च प्रतिक्रिया तापमान अंततः एंजाइम denaturing (50-55 डिग्री सेल्सियस), और समाधान में समग्र गति कम हो रही चिपचिपाहट से शांत है. प्रतिक्रिया कदम, अनुक्रम और बंधाव स्वतंत्र क्लोनिंग (SLIC) की अधिक ठीक ट्यूनिंग के लिए 20 पसंद किया जाता है.

जीन बंदूक तकनीक का एक प्रमुख सीमा यह केवल शूटिंग घटना के अनुसार 09:59 क्षणिक बदल कोशिकाओं के आदेश पर पैदा करता है.

मौजूदा तरीकों के संबंध में महत्व

गिब्सन विधानसभा तकनीक अपने आसानी, लचीलापन, और अनुकूलन क्षमता के लिए तेजी से गोद लेने का आनंद ले रहे है. यह पारंपरिक प्रतिबंध / बंधाव क्लोनिंग से एक तेज प्रोटोकॉल है, और इस तरह के प्रतिबंध पाचन के लिए आवश्यक उन के रूप में विशिष्ट दृश्यों की आवश्यकता नहीं है. यह recombined होने के लिए दो या तीन टुकड़े तक सीमित नहीं है; मूल शोधकर्ताओं सीमित दक्षता के साथ यद्यपि, 10 से ऊपर के भागों के लिए सफलतापूर्वक यह दिखा दिया है. कई शोधकर्ताओं के लिए गिब्सन विधानसभा सकारात्मक क्लोन की एक बड़ी संख्या के लिए बनाता है.

Biolistic तकनीक के साथ और अधिक transformants के लिए, या बदल घट्टा ऊतकों के निर्माण के लिए, एक कैबिनेट शैली biolistic डिवाइस (जैसे BioRad पीडीएस -1000) का उपयोग किया जाना चाहिए. एक वैकल्पिक तरीका Agrobacterium घुसपैठ है.

भविष्य अनुप्रयोगों

गिब्सन विधानसभा के लिए डीएनए के बड़े और बड़े समूहों को इकट्ठा किया जा करने की अनुमति देता हैएक अधिकतम सीमा नहीं रखा गया है जहां बिंदु. मूल लेखक डीएनए 13 सौ कई किलोबेस इकट्ठा करने के लिए इस्तेमाल किया है.

चुनिंदा एक आनुवंशिक निर्माण के साथ कई अंगों को लक्षित करने की क्षमता तब्दील होने की जरूरत जीनों की संख्या में कमी करने की क्षमता है. बड़ा और बड़ा डीएनए टुकड़े (और इस प्रकार बड़ा चयापचय मार्ग) के वितरण के एक निकट अवधि के लक्ष्य है. Isoprenoid रास्ते biolistic तरीकों से क्लोरोप्लास्ट के लिए दिया गया है; ऐसे वैकल्पिक कार्बन निर्धारण रास्ते के रूप में अन्य जीन समूहों क्षितिज पर हैं.

प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम.

गिब्सन विधानसभा में, टेम्पलेट दृश्यों लक्ष्य पुनर्संयोजन साइटों पर छोड़कर एक दूसरे से समरूपता नहीं है सुनिश्चित करें.

निकोटियाना पौधों के biolistic परिवर्तन में, के बारे में 10-15 सेमी पत्तियों ऊपर जीन बंदूक रखने के लिए सावधान रहना होगा एकएन डी 200-250 साई पर हीलियम दबाव रखना. कि तुलना में करीब नाजुक पत्ती विस्फोट, और आगे वे अच्छी तरह से तब्दील नहीं किया जाएगा कि अधिक से होगा. यह ठीक से बदल रहा है, तो दो दिन अभिकर्मक के बाद एक खरोंच पत्ती पर दिखाई देनी चाहिए.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

लेखकों निकोटियाना benthamiana पौधों की उदार दान के लिए मैसाचुसेट्स जनरल अस्पताल के जेन शीन को धन्यवाद देना चाहूंगा. जेन बुश पौधों बढ़ रही है और एक विकास कक्ष क्षेत्र की स्थापना में सलाह में बहुत मदद की. WYSS संस्थान के टॉम Ferrante confocal माइक्रोस्कोपी के साथ महत्वपूर्ण मदद की पेशकश की. लेखकों विशेष रूप से बच्चों के अस्पताल के बोस्टन की डॉन Ingber और एक जीन बंदूक और संबद्ध आपूर्ति के उदार दान के लिए WYSS संस्थान को धन्यवाद देना चाहूंगा. इस परियोजना के लिए अनुदान पीए, JCW, और मध्याह्न भोजन के लिए ऊर्जा एडवांस्ड रिसर्च प्रोजेक्ट्स एजेंसी विभाग (ARPA-ई पुरस्कार # DE-000079) के साथ एक सहकारी समझौते के माध्यम से प्रदान की जाती है, और Chimerion जैव प्रौद्योगिकी, Inc के माध्यम से MJV के लिए किया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Oligonucleotide primers IDT (custom) Design specifically for construct
GeneBlocks IDT (custom) 500 bp oligonucleotides
ApE software U Utah (download) http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/
MinElute kit Qiagen 28004 Used to purify PCR products
QIAprep spin miniprep kit Qiagen 27104 Used to prepare cloning-appropriate amounts of plasmid
Phusion Master Mix with GC Buffer NEB M0532S Used to PCR-amplify gene of interest
Gibson assembly reaction mix NEB E2611L Master mix of the following 9 ingredients
1 M Tris-HCl pH7.5 Teknova T1075 Gibson assembly mix
1 M MgCl2 G Biosiences 82023-086 Gibson assembly mix
dNTP mix Fermentas R0192 Gibson assembly mix
1 M DTT Fermentas R0861 Gibson assembly mix
PEG-8000 Affymetrix 19966 Gibson assembly mix
NAD Applichem A1124,0005 Gibson assembly mix
T5 exonuclease Epicentre T5E4111K Gibson assembly mix
Phusion polymerase NEB F530S Gibson assembly mix
Taq DNA ligase NEB M0208L Gibson assembly mix
Gibthon.org Website to simplify calculations
Plasmid PLUS Maxi kit Qiagen 12963 Used to prepare DNA for gene gun bullets
Gene Gun system BioRad 165-2451 Includes all parts necessary
Nicotania benthamiana (n/a) (n/a) Gift of Jen Sheen, MGH
Confocal microscope Leica SP5 X MP Imaging of resultant cells
Deep well slides Electron Microscopy Sciences 71561-01 Used for confocal imaging
A Plasmid Editor (ApE) University of Utah http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape
Gibthon:Ligation calculator http://django.gibthon.org/tools/ligcalc/

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References

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Mattozzi, M. D., Voges, M. J., Silver, P. A., Way, J. C. Transient Gene Expression in Tobacco using Gibson Assembly and the Gene Gun. J. Vis. Exp. (86), e51234, doi:10.3791/51234 (2014).

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