Summary
この作品は、選択的にバイオラッド遺伝子銃を用いてアッセイ、植物では細胞内小器官を標的化するための新しい方法を説明します。
Abstract
複数の細胞内小器官への単一のタンパク質を標的化するために、植物は典型的に関連性のある遺伝子を複製し、差動プロモーターおよび/またはシグナル配列を含む複雑な調節戦略を用いて別々に各遺伝子を発現する。メタボリックエンジニアや特定の細胞小器官に酵素を標的とすることに興味の合成生物学者は、チャレンジに直面している：複数の細胞小器官に局在していることがあるタンパク質のために、エンジニアは、同じ遺伝子を複数回複製しなければなりません。この作品は、この戦略に対する解決策を提示：mRNAの選択的スプライシングを利用する。この技術は確立された葉緑体およびペルオキシソーム標的化配列を利用して、選択的にスプライシングされた単一のmRNAにそれらを組み合わせたものです。いくつかのスプライスバリアントは、葉緑体、ペルオキシソームにいくつか、および細胞質ゾルへのいくつかに送信されます。ここで、システムは、複数のオルガネラが選択的スプライシングに標的化するために設計されている。本研究では、GFPは、exprがあると予想された合理的に設計された5 'のmRNA一連のタグによって葉緑体、細胞質ゾルおよびペルオキシソームでessed。これらのタグは、異種遺伝子は、複数の細胞内小器官で発現されることが必要なときに必要なクローニングの量を減少させる可能性を有する。構築物は、以前の研究11で設計し、ギブソン·アセンブリ、制限酵素を必要とせず、ライゲーション非依存性クローニング法を用いてクローニングした。得られたプラスミドは、改変された遺伝子銃プロトコールでベンサミアナタバコ葉表皮細胞に導入した。最後に、形質転換された葉を共焦点顕微鏡で観察した。
Introduction
この作品は、植物細胞が複数の細胞小器官ではなく、単一のDNA構築物でレポータータンパク質を発現するように遺伝子操作される代謝工学/合成生物学のプロジェクトです。
複数の場所へのタンパク質を標的化するための一つのアプローチは、複数の遺伝子のコピー、異なる局在化ペプチドを含むそれぞれクローニングすることを含む。各コピーは、単一のトランスフォームを1戻し交配によって、あるいは連続的な再変換によって導入するか、しなければならない。これは、追加のクローニングを必要とし、末端ごとに1つのローカライズタグによって制限されます。
複数の場所にタンパク質を局在化する別の方法は、選択的スプライシング2-5を介してである。 RNAは、単一の遺伝子から転写されるが、転写産物の異なるコピーは、セルごとに複数の方法で、多くの場合、異なる方法で処理されます。これは、単一の遺伝子から転写されたセル内の複数のメッセンジャーRNAをもたらすことができる。これらの異なるmessengeR RNAは、同じタンパク質、またはフレームシフトの場合は、全く別のタンパク質の異なるアイソフォームをコードすることができます。選択的スプライシングは、長年にわたって文献に記載されているが、作用及び保存された供与体および受容体スプライス部位のメカニズムは、より最近6解明されている。これらのサイトは、より良い説明されているように、彼らは、エンジニアリングのための機会を開く。
複数の細胞小器官にタンパク質を発現する際に植物代謝エンジニアが課題に直面しています。複数の細胞小器官に局在していることがあるタンパク質を、技術者は、対象とする細胞小器官にそれを指示する別々のシグナル配列と、同じ遺伝子のそれぞれを複数回複製しなければなりません。 3オルガネラにおける単一遺伝子の場合、これは単に三つの遺伝子である。しかし、6個の遺伝子の代謝経路のために、これは18の遺伝子、かなりのクローニングの努力に展開されます。シングル、選択的にスプライス遺伝子記号に複数の局在化配列を結合するificantlyこの努力が削減されます。例えば、リエンジニアリング光呼吸7,8およびイソプレノイド合成9,10は葉緑体およびペルオキシソームの両方を含む。天然のシロイヌナズナ系で観察されるように我々のケースでは、先に6に記載のスプライス部位を利用した。当社は、合理的にだけでは自然なスプライス部位を残してmRNA配列を再設計したが、選択的にスプライスイントロン（ 図1）内の葉緑体またはペルオキシソームターゲティングタグをコードするであろう配列が配置されます。発現されたタンパク質は、またはそれをエンコードされたmRNA前駆体はイントロン（ 図1Gおよび1H）として切り出したかどうかに応じて、タグを持っていない可能性があります。この作品で提示コンストラクトのデザインの詳細については、関連記事11を参照してください。
これはまだかなりのクローニングの努力、ギブソンアセンブリ、DNA構築物をクローニングするための新しい方法であるため、uは建設中のsed。ギブソン方法に関わらず、制限部位（ 図2）12〜14、任意の配列のために使用することができる。酵素の具体的なミックスは、ワンステップ、等温アセンブリを可能にします。この方法では、いくつかの二本鎖の線状DNA部分は、それらが約50塩基対の配列が重複しているように設計されている。ギブソン·アセンブリ酵素混合物は、部分的相同配列の一本鎖を露出させる、直鎖DNA部分を消化する。これらの部分的な一本鎖配列は、迅速なワンステップ、配列に依存し、ライゲーションフリーサブクローニング反応において得られた反応混合物に再アニールされる。
この作品は、ギブソンのアセンブリの新しいライゲーションのないメソッドを使用して、1）合理的な設計選択的スプライシングを受けた植物の葉緑体、ペルオキシソーム、およびサイトゾルでの発現のための構造、2）そのクローニング、遺伝子銃でタバコの葉の細胞への3）の配送を説明し、 GFPで観察されたように、オルガネラターゲティングを示す4）結果および共焦点顕微鏡。
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Protocol
ターゲットと複数のオルガネラのための選択的にスプライス配列の1。デザイン
- 最終的なタンパク質発現のための部位を決定。この作業のために、関心は葉緑体、ペルオキシソーム、および細胞質ゾルをターゲットにしている。
- 関心対象の細胞小器官へのタンパク質を標的化することが知られているタンパク質およびDNA配列を同定するために文献を使用する。この場合、葉緑体は、 シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）、L-アスパラギン酸メチル6,15から配列を標的とシロイヌナズナのトランスサイレチンのようなS-アラントイン合成酵素16,17から配列を標的ペルオキシソームを決定した。
- 正しい細胞小器官への関心のタンパク質をターゲットとすべき代替スプライシング体制を特定します。この作業のため、自然のシロイヌナズナシステム 6で観察されるようなスプライス部位。 mRNA配列は、天然のスプライス部位を残して再設計されましたが、シーケンスは、符号化葉緑体やperoxisを置いた選択的にスプライスイントロン（ 図1）内のタグをOMEターゲティング。
DNAのパーツの2。ギブソン総会
図2も参照してください。
ギブソンの組立方法は、部分的に隣接するDNA部分の一本鎖および2）アニール相補塩基対を作るために二本鎖DNAの末端のダイジェスト）を1に予め作られた混合物中のいくつかの酵素の作用に依存する。これは、制限部位の制限なしにDNA断片のクローニングを可能にする。
- DNAプラスミド構築物における要素の順序を選択します。 a）は、プラスミド、植物、カナマイシン耐性マーカーで作業することが知られているGFP構築物を含むベクター（孔、および大腸菌およびアグロバクテリウム·ホスト·ツメファシエンス ）、b）工程aのための複製起点：一例としてTriTag-1の要素を有しているプロモーター配列、（P ENTCUP2、植物において構成的であることが示されている）、c）の葉緑体配列（CTS）と、c）ペルオキシソーム標的化配列（PTS）を標的、およびd）スプライス部位の一連の6先に説明したように。
- インシリコデザイン· ソフトウェアで構築ベース用ベースを設計します。 APEはこの仕事に便利なオープンソースのフリーウェアパッケージです。
プラスミドベクターに含まれるプラスミドベクター、プロモーター、ATG、スプライスドナー部位、葉緑体標的配列、スプライスドナー部位、中性部位、スプライスアクセプター部位、ペルオキシソーム標的配列、スプライスアクセプター部位、GFP：注：TriTag-1は、順序を有する。- PCR用のプライマーをご注文の際に各ピース間50bpの重複が存在するようなインシリコ DNA構築物を設計します。 25bpの各方向：これは、プライマーとして50 bpのオーバーラップを使用することが可能である。
- シーケンス片の起源を追跡するようにしてください。それはのようになります。成長させ、ミニプレップするプラスミド; PCRの鋳型として用いることができる直鎖状配列;である必要があるか、シーケンス商業的に合成された？いくつかの企業が断片<500bpのための低コストのDNA合成サービスを提供しています。それは商業的にご注文することが有利だったので、この場合は、TriTag自体は437 bpである。
- すべてのフラグメントをPCRで増幅し、その鋳型DNAから精製された場合、最良の結果が来る。耐性マーカーをより容易にPCRで増幅された二つの小さなテンプレートに、この大きなDNAを分割するには良い場所です。
- 制限制限酵素DpnIを、メチル化DNAを切断する。 PCRの鋳型は、 大腸菌からのミニプレップした場合大腸菌、DpnIを処理は、混入のテンプレートDNAを除去します。
- PCR用のプライマーをご注文の際に各ピース間50bpの重複が存在するようなインシリコ DNA構築物を設計します。 25bpの各方向：これは、プライマーとして50 bpのオーバーラップを使用することが可能である。
- 別途、すべてのDNA配列を浄化した水、TEまたは緩衝液EBで溶出する。
- 気孔ベクター部分1、〜3,000 BP（緑の矢印）。 PCRは増幅され、治療をDpnI。
- 気孔ベクター部分2、〜3,000 BP（黒矢印）。 PCRは増幅され、治療をDpnI。
- TriTag INSERT、437 BP（青の矢印）。商業的になっております。 RのddH 2 Oにesuspend
- P ENTCUPプロモーター 、〜750塩基対（オレンジの矢印）。 PCRで増幅し、DpnIを処理された。
- DNA断片のそれぞれの濃度を測定する。ベクトル片の150 ngの/μLを目指す。
- 冷凍庫からギブソンアセンブリミックスの分量を取り、氷上で解凍する。これは、ラボ12月14日に行うことが商業的に入手可能なだけでなく、簡単です。
- 粘性5Xマスターミックスと15μlの反応サイズの1.33倍の分量：このレシピへの2つのステップがあります。 5Xマスターミックスには含まれています。3ミリリットルの1Mトリス-HCl、pH7.5、300μlの1 M MgCl 2を 、各dNTP、300μlの1 M DTT、1.5グラムのPEG-8000、20 mgのNAD、および蒸留H 2の600μlの10 mMの6ミリリットルのO。 320μlの一部（18）を調製し、-20℃で1が、すべてを凍結する解決策は非常に粘性になります。これらの「5X等温線バッファを "ラベル
- （320μl）を、残りの1に、1.2μLT5エキソヌクレアーゼ、20μLのPhusionハイ-FIDを追加elity DNAポリメラーゼ、160μLのTaq DNAリガーゼと700μlの蒸留H 2 O -20℃でPCR管中の氷とストアに15μLずつ（〜80）を準備
- 各フラグメントの等モル量のボリュームを決定します。 Gibthon.orgを含むいくつかのオンライン計算機があります。すべてのDNA断片5μlの合計があるはずです。ギブソンは分量を混ぜて15μLに追加します。これは、ピペットに小さすぎるボリュームを必要とする場合、DNA断片を希釈および/または複数のアリコートを使用する。
- 単独のベクターDNA（抗生物質耐性マーカーを含む例えば DNA部分）の制御を準備し、水でボリュームを構成することを忘れないでください。
- 30〜60分間50〜55℃でサーマルサイクラーにチューブをインキュベートする。氷の上で交換して、Eに変換する熱ショック、化学的にコンピテントセルを経由して大腸菌 。エレクトロコンピテント細胞を使用しないでください。高塩濃度および比較的低いDNA濃度細胞はアークが発生することがあります。
- 200μlの塩化カルシウムコンピテントの市販製剤に全20μLを適用大腸菌 。
42℃で氷30分および熱ショック60秒でインキュベート - 氷2分に戻り、750μlのSOCまたはLB培地を適用し、37℃でマイクロ遠心チューブに30分を振っ回復LB +菅（またはその他の適切な抗生物質）に混合し、適切な希釈液をプレート。これは、従来のライゲーションに基づくクローニングよりも高いバックグラウンド（および非標的組換え事象の数が多い）になることがありますが、約10個のコロニーをスクリーニングすることは価値がある。
- 200μlの塩化カルシウムコンピテントの市販製剤に全20μLを適用大腸菌 。
- 配列を介してクローンを確認し、-80℃で一定分量を保存する
遺伝子銃とタバコの3。微粒子銃トランスフェクション
これはJoveの18,19年に設立された技術である。重要なステップとの相違点を以下に説明する。
- 50〜100を成長ミリリットルE. COLiや200ミリリットルアグロバクテ 。文化をマキシプレップ。約1,500 NG /μLの濃度は、継続するために必要とされている。
- 前述したように、遺伝子銃の弾丸を準備します。遺伝子銃にロードします。
- ベンサミアナタバコタバコの葉の表皮組織のトランスフェクションのために、3ヶ月の植物の根元に近い大葉を選択します。丁寧にカットさ15cmシャーレに湿ったペーパータオルの上にボトム側を上に配置します。
- 200〜250 PSIへの遺伝子銃He圧力を設定します。
- 慎重に約3〜5センチメートルその上、葉の下側のリブの間の遺伝子銃を目指しています。安全性を解放し、リーフに粒子を送達。各弾丸は、葉上の同じ場所に二度使用されてもよい。葉が爆発した場合、新しい葉があるため、12 cmの葉のためのそのような年齢、水分などの成長条件への葉の靭性のある分散があるを破棄し、起動し、約6ショットに合うように期待しています。
- の上で覆われた葉を格納ベンチで暗い場所で2〜3日間、ペトリ皿。
- UV蛍光を装備した解剖顕微鏡で葉を調べ、GFPを発現する個々のセルを検索します。葉の5〜10ミリメートルのセクションを分析。
- 〜200μlの0.1％トリトンX-100の下にディープウェル顕微鏡スライドに葉を沈める。界面活性剤は、表面上に気泡を防ぐことができ、及びディープウェル顕微鏡スライドは、より大きな組織の撮像領域を可能にする。
トランスフェクションされた組織の4。共焦点顕微鏡
これらの命令は、すべての楽器ごとに異なりますので、適切な訓練を受けた取得することが不可欠である。
- 蛍光検出実験のために、489 nmの励起レーザーを設定し、GFP蛍光とクロロフィルの自家蛍光のために630から700ナノメートルのための500から569 nmの光電子増倍管検出器を設定します。 40倍水浸対物レンズを用いて画像セル。
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Representative Results
設計作業は、重要な計画の結果であった。このプロジェクトへの新規で示差的に発現するタンパク質に翻訳されるmRNA前駆体を作成するための選択的スプライシングを使用することである。これらのタンパク質は、この場合には、異なる細胞小器官で発現される葉緑体、ペルオキシソームおよび/または細胞質ゾル。我々は、代わりに6を接合される天然のシロイヌナズナ遺伝子を適応し、かつ17が代替エクソン（TriTag-1とTriTag-2）中の配列を標的知ら葉緑6とペルオキシソームを置いた。 TriTag-3は、葉緑系列の低複雑領域内に埋め込まれたペルオキシソーム信号で構成されています。これらは、GFP（ 図1）とインフレームで配置した。
PIMT2遺伝子 6、配列を標的とする葉緑体およびペルオキシソーム、GFP、およびプラスミド骨格からネイティブの選択的スプライシングの養生法：本研究で用いたプラスミドは、このようにいくつかの要素を含んでいた。各々が非常にスペックを有しているのでIFICの配列を必要な配列に依存しない方法が必要である。ギブソン·アセンブリ12,13プロトコルであれ構成部品は、互いに配列類似性を有するように設計されているような任意の配列に使用することができ、反復配列を含まない。簡潔には、直鎖状DNA断片は、それらが相同配列（ 図2）の重複〜50塩基対を有するように（いずれかのPCR増幅を、商業的合成、又は予め作られたプラスミドの消化を介して）構成されている。 DNAフラグメントの各々の等モル量を1時間50℃でインキュベートしたギブソン·アセンブリミックスを含有する単一のチューブ中で混合し、E.に変換される大腸菌 。ギブソン·アセンブリプロトコルから得られたプラスミドを、サンガー配列決定により確認した。
本研究では三つの異なるGFPの細胞小器官を標的とする構築物は、タグなし、GFPおよびルビスコタグ付きGFPと比較した。共焦点顕微鏡は、Si中のGFP蛍光を検出したngle細胞は一過性に形質転換した。対照実験では、観察された一過性の発現は、葉緑体（クロロフィルの赤色の自己蛍光によって容易に識別可能）、核（葉緑体ではなく、唯一の1セルあたりを持っている大規模な細胞小器官）、および/またはあると信じられ、小さな細胞小器官に相関していたペルオキシソーム。緑（GFP）と赤（クロロフィル自家蛍光）チャネルは、細胞内局在性（ 図3）を研究するために重層した。これらの結果のより完全な議論については、当社の関連記事11を参照してください。
予測されるように、3つすべての二重標的構 築物において、GFPは、オーバーレイ共焦点顕微鏡写真において葉緑体（ 図4）において観察された。 TriTag-1およびTriTag-2標的サイトゾルおよびペルオキシソーム（ 図4a及び4bのそれぞれ）であると考えられる小さなオルガネラにもGFP。 TriTag-3のみ葉緑体およびペルオキシソームへの標的GFPではなく、細胞質ゾル（ 図4c）。結果の概要（ 図5）に図解されている。
ベンサミアナタバコにおける差オルガネラ式の選択的スプライシング構築物の図1。デザイン。（A）TriTag-1の図をスプライス、（B）TriTag-2、および（C）TriTag-3非標的化配列を示す（グレー）、葉緑体ターゲティング配列（ライトグリーン）、ペルオキシソーム標的化配列（オレンジ）、および一過性発現実験において使用GFPコード配列。 TriTag-1とTriTag-2は、選択的スプライシングの構造で構成され; TriTag-3は、葉緑系列の低複雑領域内に埋め込まれたペルオキシソーム信号で構成されています。の配列
図2ギブソンアセンブリの回路図：DNA断片の重複を組み立てるための新規な方法プラスミド構築12,13のためのギブソン組立方法は急速に多くの研究室では、従来の制限-ライゲーションクローニングを置き換えています。基本的に、人はさまざまなソースから増幅されたPCR産物から構成される、正確に目的のDNAが含まれてインシリコ構造を設計することができます。互いに相補的なプライマーを設計し、着色されたプライマーを用いて、各断片をPCR-増幅する。酵素ミックスを持つ単一のチューブ内にすべてのピースを追加し、Eを変換大腸菌コンピテントセル。 リットルを見るにはここをクリックしてくださいargerイメージ。
図3。対照処理は、Nに砲撃ベンサミアナ葉の表皮細胞。（AC）タグなしのGFP。（A）グリーンチャンネル。タグなしGFPは、液胞、細胞質ゾルに対応し、核内に、細胞の周囲に発現していないが、（B）赤葉緑はクロロフィルの自家蛍光を示している。（C）オーバーレイ。この構築では蛍光が葉緑体のみ核と細胞質ゾルで観察されませんが。（DF）葉緑タグ付きGFPコントロール。（D）緑チャンネル。概説されているようGFPは、細胞を、大規模な細胞小器官で発現している。（E）赤葉緑体は塩素の自家蛍光を示すophyll。（F）オーバーレイ。この場合、黄色の葉緑体は、GFP（緑色）は、葉緑体に標的化されることを示す、観察される。許可11を得て転載。 拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。
図4：トリ-タグ-1、2、3はGFP画像をマージタグ付きであって、（a）トリ-Tag1に。この場合、黄色の葉緑体周囲がGFPを葉緑体に標的化されていることを示し、観察される。 GFPは、細胞質ゾルも同様にペルオキシソームかもしれ小さな点状の小器官で観察される。（b）のトライタグ2。この場合、黄色の葉緑体の周囲は、GFPがcを対象としていることを示し、観測される hloroplast。 GFPは、細胞質ゾルも同様にペルオキシソームかもしれ小さな点状の小器官で観察されている。（C）トライTAG3。この場合、黄色の葉緑体は、同様に、ペルオキシソームであってもよい小さな点状の細胞小器官として観察される。しかし、GFPは、細胞質ゾルで観察されていません。許可11を得て転載。 拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。
図5の典型的なタバコ葉表皮細胞のコンパートメントここで、それらの相対的なサイズおよび細胞内の位置が示され、相対的な発現レベルは、共焦点顕微鏡を介して観察される。許可11を得て転載。/ 51234/51234fig5highres.jpg "ターゲット=" _blank ">拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。
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Discussion
本研究では、単純な戦略は、植物内の複数の細胞区画に一つのトランスジェニックタンパク質をローカライズするために記載されている。目標は、 ベンサミアナタバコの複数の細胞小器官に単一の遺伝子を発現し構造物を設計することでした。戦略は合理的にGFPベースのDNA構築物の設計、ギブソンアセンブリ、遺伝子銃で葉細胞へのプラスミドの配信、および共焦点顕微鏡を用いた結果を観察することがあります。
三つの異なる短い、N末端 タグは11を対象とした同時葉緑体、ペルオキシソームおよび細胞質ゾルのために設計された。これらの「TriTags」は、葉緑体に加え、細胞質6かペルオキシソームプラス細胞質17のいずれかにコードされたタンパク質を直接、選択的スプライシングを受けたmRNAをコードする天然に存在するDNAを結合することによって設計されました。 TriTag-3は、選択的スプライシングに依存しており、中のNa葉緑体標的化配列で構成されていませんturally構造化されていない部分は、ペルオキシソーム標的配列15,17に置き換えられている。 ベンサミアナタバコの葉の表皮細胞におけるGFP（ 図5）を対象とする生体内で TriTags機能。
共焦点顕微鏡写真を効果的に葉緑体、ペルオキシソーム、及び細胞質ゾルにそのTriTag-1およびTriTag-2標的GFPを示したが、それぞれ、葉緑およびペルオキシソーム、が優先される（ 図4aおよび図4b）。 TriTag-3の目標は、葉緑体およびペルオキシソームにGFPのみではなく、細胞質ゾル（ 図4c）。すべてでは、これらのタグは、特に葉緑体やペルオキシソームにおける特異的な発現を必要とする人のため、植物代謝工学のためのクローニングに費やす時間とリソースを削減することができる。
修正とトラブルシューティング
、現在構築さTriTagsはかなり静的です。しかし、underlyinG技術、別の場所固有のタグの翻訳を可能にするために、選択的スプライシングは、柔軟性があります。既存の葉緑体および/またはペルオキシソーム固有のタグは、それが分泌経路、ミトコンドリア、小胞体滞留タグ、空胞であること、他の細胞小器官のために変更することができた。これらはまた、など、組織特異的プロモーター、 例えば種子、花、根、葉、茎、と組み合わせることができる
あるよう、本プロジェクトでは、構造物をクローニングするためのギブソンの組み立て方法12月14日が理想的です。これは、制限部位の制限なしに任意のシーケンスをサブクローニングするためのシンプルで強力なツールです。 1段階の反応では、ギブソン·アセンブリは、急速にクローニングにおける最小限の労力で構築物及びコントロールを作成しました。ギブソン·アセンブリ技術があれば、テンプレート配列はPCR-増幅することができるように、任意の順序でほぼ無限に変更可能である。この例では、ギブソン·アセンブリは、消化されたプラスミドを示したがPCR-増幅ベクターを消化し、ミニプレップを使用するよりも良い仕事する傾向がある。
このジャーナル18,19によって確立されているように遺伝子銃は、細胞の一過性トランスフェクションのための迅速で効果的な方法である。 ベンタミアーナ大、葉状の葉の表皮遺伝子銃を用いたトランスフェクションのための両方に理想的である細胞、だけでなく、ためを持っている共焦点顕微鏡で観察し。弾丸を製造するためのプロトコルが十分に確立されている。金はこれまで文献ではほとんどの実験でマイクロキャリアとして使用されているが、タングステンのマイクロキャリアは、低コストで、最近利用できます。
技術の限界
ギブソン方法の一つの主要な制限は、反復配列の存在である：長い重複領域は、より少ない副生成物の結果である。 DpnIでPCR産物の消化プラスミドテンプレートを汚染削除する必要があります。通常側の原因である製品。酵素は一本鎖に二本鎖DNAからのDNAフラグメントを消化。 DNA断片の末端付近の反復配列の存在下（〜1キロバイト）が有意に不適切な再結合の可能性を増大させる。同様に、配列内に繰り返しても、制限を課すものでは：これはよく知られている、およびT5エキソヌクレアーゼ咀嚼は、一本鎖DNAをバックアップどこまで制御することは難しいことではありません。エキソヌクレアーゼ活性は、急速な高い反応温度（50〜55℃）は、最終的に、酵素を変性し、粘度は、溶液中の全体的な動きを減少させることによって和らげられる。反応ステップのより微調整のために、配列およびライゲーション非依存性クローニング（SLIC）20が好ましい。
遺伝子銃技法の主な制限は、それが唯一のシュートイベントごと九時五十九一過性に形質転換された細胞のオーダーで生成することである。
既存の方法に関して意義
ギブソンの組立技術は、その使いやすさ、柔軟性、適応性のために急速な普及を楽しんでいる。それは、伝統的な制限/ライゲーションクローニングよりも高速のプロトコルであり、このような制限消化に必要なものなどの特定の配列を必要としません。これは、再結合される2つまたは3つの断片に限定されるものではない。オリジナルの研究者は、限られた効率ではあるが、最大10部品に正常に実証されている。多くの研究者のためのギブソン·アセンブリは、陽性クローンのより多くできるようになります。
微粒子銃技術、または形質転換カルス組織を作成するための、より形質転換体を、キャビネットスタイルのバイオリスティック装置（ 例えばバイオラッドPDS-1000）を使用すると、使用されるべきである。別の方法は、 アグロバクテリウム浸潤である。
将来の応用
ギブソン·アセンブリには、DNAのより大きな、より大きなクラスタが組み立てることを可能にする最大制限が観察されていない点。オリジナルの作者は、DNA 13数百キロベースを組み立てるためにそれを使用している。
選択的に単一の遺伝子構築物を用いて、複数の細胞小器官を標的化する能力は、形質転換される必要遺伝子の数を減少させる可能性を有する。ますます大きなDNA断片（したがって、より大きな代謝経路）の送達は、当面の目標である。イソプレノイド経路は、バイオリスティック法によって葉緑体に配信された。そのような代替炭素固定経路など、他の遺伝子クラスターは、地平線上にあります。
プロトコルの中で重要なステップ。
ギブソンアセンブリでは、鋳型配列は、対象の組換え部位を除いてお互いに相同性を有していないことを確認してください。
タバコ植物のバイオリスティック形質転換において、約10〜15センチメートル葉の上に遺伝子銃を保つように注意してくださいND 200〜250 psiでヘリウム圧力を維持する。それよりも近く、脆弱な葉は遠く、彼らがうまく変換されないことよりも爆発します。それが適切に変換された場合トランスフェクションの2日後にあざが葉の上に表示されます。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
著者は、 ベンサミアナタバコ苗の寛大な寄付のためにマサチューセッツ総合病院のジェンシーンに感謝したいと思います。ジェン·ブッシュは、植物の成長、成長チャンバ領域を設定する際の助言が大きく私たちを助けた。ウィス大学のトム·フェランテは、共焦点顕微鏡で重要なヘルプを提供した。著者は、特に遺伝子銃および関連物資の寛大な寄付のためにボストン小児病院とWyssさん研究所のドンIngberに感謝したいと思います。このプロジェクトの資金は、MJVため、PAS、JCW、およびMDM、およびChimerionバイオテクノロジーによって、株式会社のためのエネルギー省高等研究計画局（ARPA-E賞＃DE-000079）との協力協定を通じて提供されていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Oligonucleotide primers | IDT | (custom) | Design specifically for construct |
| GeneBlocks | IDT | (custom) | 500 bp oligonucleotides |
| ApE software | U Utah | (download) | http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/ |
| MinElute kit | Qiagen | 28004 | Used to purify PCR products |
| QIAprep spin miniprep kit | Qiagen | 27104 | Used to prepare cloning-appropriate amounts of plasmid |
| Phusion Master Mix with GC Buffer | NEB | M0532S | Used to PCR-amplify gene of interest |
| Gibson assembly reaction mix | NEB | E2611L | Master mix of the following 9 ingredients |
| 1 M Tris-HCl pH7.5 | Teknova | T1075 | Gibson assembly mix |
| 1 M MgCl2 | G Biosiences | 82023-086 | Gibson assembly mix |
| dNTP mix | Fermentas | R0192 | Gibson assembly mix |
| 1 M DTT | Fermentas | R0861 | Gibson assembly mix |
| PEG-8000 | Affymetrix | 19966 | Gibson assembly mix |
| NAD | Applichem | A1124,0005 | Gibson assembly mix |
| T5 exonuclease | Epicentre | T5E4111K | Gibson assembly mix |
| Phusion polymerase | NEB | F530S | Gibson assembly mix |
| Taq DNA ligase | NEB | M0208L | Gibson assembly mix |
| Gibthon.org | Website to simplify calculations | ||
| Plasmid PLUS Maxi kit | Qiagen | 12963 | Used to prepare DNA for gene gun bullets |
| Gene Gun system | BioRad | 165-2451 | Includes all parts necessary |
| Nicotania benthamiana | (n/a) | (n/a) | Gift of Jen Sheen, MGH |
| Confocal microscope | Leica | SP5 X MP | Imaging of resultant cells |
| Deep well slides | Electron Microscopy Sciences | 71561-01 | Used for confocal imaging |
| A Plasmid Editor (ApE) | University of Utah | http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape | |
| Gibthon:Ligation calculator | http://django.gibthon.org/tools/ligcalc/ |
References
- Que, Q., et al. Trait stacking in transgenic crops: challenges and opportunities. GM crops. 1 (4), 220-229 (2010).
- Reddy, A. S. N., Rogers, M. F., Richardson, D. N., Hamilton, M., Ben-Hur, A. Deciphering the plant splicing code: experimental and computational approaches for predicting alternative splicing and splicing regulatory elements. Frontiers in Plant Science. 3 (18), (2012).
- Hickey, S. F., et al. Transgene regulation in plants by alternative splicing of a suicide exon. Nucleic Acids Research. 40 (10), 4701-4710 (2012).
- Syed, N. H., Kalyna, M., Marquez, Y., Barta, A., Brown, J. W. S. Alternative splicing in plants - coming of age. Trends in Plant Science. 17 (10), 616-623 (2012).
- Black, D. L. Mechanisms of alternative pre-messenger RNA splicing. Annual Review of Biochemistry. 72, 291-336 (2003).
- Dinkins, R. D., et al. Changing transcriptional initiation sites and alternative 5'- and 3'-splice site selection of the first intron deploys Arabidopsis protein isoaspartyl methyltransferase2 variants to different subcellular compartments. The Plant Journal: for Cell and Molecular Biology. 55 (1), 1-13 (2008).
- Kebeish, R., et al. Chloroplastic photorespiratory bypass increases photosynthesis and biomass production in Arabidopsis thaliana. Nature Biotechnology. 25 (5), 593-599 (2007).
- Maier, A., et al. Transgenic Introduction of a Glycolate Oxidative Cycle into A. thaliana Chloroplasts Leads to Growth Improvement. Frontiers in Plant Science. 3 (38), 1-12 (2012).
- Kumar, S., et al. Remodeling the isoprenoid pathway in tobacco by expressing the cytoplasmic mevalonate pathway in chloroplasts. Metabolic Engineering. 14 (1), (2012).
- Sapir-Mir, M., et al. Peroxisomal localization of Arabidopsis isopentenyl diphosphate isomerases suggests that part of the plant isoprenoid mevalonic acid pathway is compartmentalized to peroxisomes. Plant Physiology. 148 (3), 1219-1228 (2008).
- Voges, M. J., Silver, P. A., Way, J. C., Mattozzi, M. D. Targeting a heterologous protein to multiple plant organelles via rationally designed 5' mRNA tags. Journal of Biological Engineering. 7 (20), (2013).
- Gibson, D. G. Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments. Methods in Enzymology. 498, 349-361 (2011).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 12-16 (2009).
- Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A., Venter, J. C., Merryman, C. Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome. Nature Methods. 7 (11), 901-903 (2010).
- Lowenson, J. D., Clarke, S. Recognition of D-aspartyl residues in polypeptides by the erythrocyte L-isoaspartyl/D-aspartyl protein methyltransferase. Implications for the repair hypothesis. The Journal of Biological Chemistry. 267 (9), 5985-5995 (1992).
- Lanyon-Hogg, T., Warriner, S. L., Baker, A. Getting a camel through the eye of a needle: the import of folded proteins by peroxisomes. Biology of the Cell / under the auspices of the European Cell Biology Organization. 102 (4), 245-263 (2010).
- Reumann, S., et al. Proteome analysis of Arabidopsis leaf peroxisomes reveals novel targeting peptides, metabolic pathways, and defense mechanisms. The Plant Cell. 19 (10), 3170-3193 (2007).
- Woods, G., Zito, K. Preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture. J. Vis. Exp. (12), (2008).
- Hollender, C. A., Liu, Z. Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene. (40), (2010).
- Li, M. Z., Elledge, S. J. Harnessing homologous recombination in vitro to generate recombinant DNA via SLIC. Nature Methods. 4 (3), 251-256 (2007).
