Summary
Este trabalho descreve um novo método para alvejar seletivamente organelas subcelulares nas plantas, analisadas usando o BioRad Gene Gun.
Abstract
A fim de orientar uma única proteína para várias organelas subcelulares, plantas tipicamente duplicar os genes relevantes e expressar cada gene separadamente usando estratégias regulatórias complexas, incluindo promotores diferenciais e / ou seqüências de sinais. Engenheiros metabólicas e biólogos sintéticos interessadas no direccionamento enzimas para um organelo particular, são confrontados com um desafio: Para que uma proteína que é para ser localizada a mais de um organelo, o engenheiro necessário clonar o mesmo gene várias vezes. Este trabalho apresenta uma solução para esta estratégia: o aproveitamento splicing alternativo do mRNA. Esta tecnologia aproveita de cloroplasto estabelecida e seqüências peroxissoma segmentação e as combina em um único mRNA que é alternativamente emendados. Algumas variantes de processamento são enviados para o cloroplasto, algum do peroxissoma, e outros para o citosol. Aqui o sistema é projetado para múltiplo organela alvo com splicing alternativo. Neste trabalho, a GFP era esperado para ser exprEssed no cloroplasto, citosol, peroxissoma e por uma série de racionalmente concebidos 5 'tags de mRNA. Estas etiquetas têm o potencial de reduzir a quantidade de clonagem necessária quando os genes heterólogos têm de ser expressos em vários organelos subcelulares. As construções foram concebidas em trabalho anterior 11, e foram clonados utilizando a montagem de Gibson, um método de clonagem independente de ligação que não necessita de enzimas de restrição. Os plasmídeos resultantes foram introduzidos na Nicotiana benthamiana células da epiderme da folha, com um protocolo modificado do gene da arma. Finalmente, as folhas transformadas foram observadas por microscopia confocal.
Introduction
Este trabalho é um projeto de engenharia biologia / sintético metabólica em que as células de plantas são projetados para expressar uma proteína repórter em várias organelas, mas com apenas uma única construção de DNA.
Uma abordagem para proteínas alvo de mais do que um local envolve múltiplas cópias genéticas de clonagem, contendo cada um péptido localização diferente. Cada cópia deve ser introduzido por sucessivas retransformação ou, alternativamente, por retrocruzamentos transforms solteiro 1. Isto envolve a clonagem adicional, e é limitada por uma etiqueta de localização por terminal.
Outra maneira para localizar uma proteína de múltiplos locais é através de splicing alternativo 2-5. O RNA é transcrito a partir de um único gene, mas cópias diferentes da transcrição são processados de maneira diferente, muitas vezes em mais do que uma maneira por célula. Isto pode resultar em mais do que um ARN mensageiro na célula transcrito a partir de um único gene. Estes messenge diferenteRNAs r pode codificar para diferentes isoformas da mesma proteína, ou no caso de uma mudança de enquadramento, uma proteína completamente diferente. Apesar de splicing alternativo foi descrito na literatura durante muitos anos, os mecanismos de acção e de doador conservada e locais de união de receptor apenas estão a ser elucidados mais recentemente 6. Como estes sites estão sendo mais bem descrito, abrem-se oportunidades para a engenharia.
Engenheiros metabólicos da planta são confrontados com um desafio ao expressar uma proteína em várias organelas. Para que uma proteína que é para ser localizada a mais de um organelo, o engenheiro necessário clonar o mesmo gene várias vezes, cada uma com uma sequência de sinal separado dirigindo-a para o organelo de interesse. Para um único gene em três organelas, este é simplesmente três genes. Mas, para uma via metabólica de seis genes, esta expande-se para 18 genes, um esforço significativo clonagem. Combinando várias seqüências de localização em um sinal de um único gene, alternativamente emendadosificantly reduz esse esforço. Por exemplo, fotorrespiração reengenharia 7,8 e síntese isoprenoid 9,10 envolve tanto os cloroplastos e peroxissomos. No nosso caso, se aproveitou de locais de splicing como observado em um sistema de Arabidopsis thaliana naturais descrito anteriormente 6. Nós racionalmente redesenhado a sequência de mRNA deixando os locais de splicing naturais sozinho, mas colocado sequências que codificam alvos-peroxissoma-cloroplasto ou dentro dos intrões alternativamente emendados (Figura 1). A proteína expressa pode ou não ter uma etiqueta, dependendo se o pré-ARNm que codificava foi excisada como um intrão (Figuras 1g e 1h). Para mais informações sobre o projeto das construções apresentadas neste trabalho, consulte o artigo do companheiro 11.
Porque este é ainda um esforço significativo clonagem, montagem Gibson, um novo método para a clonagem de arquétipos de ADN, é used na construção. O método de Gibson pode ser usado para qualquer sequência, independentemente de sítios de restrição (Figura 2) 12-14. A combinação específica de enzimas permite um único passo, a montagem isotérmico. Neste método, diversas peças de ADN de cadeia dupla linear são concebidos de tal modo que eles têm sequências sobrepostas de ~ 50 pb. A mistura de enzimas montagem Gibson digere parcialmente as partes de ADN lineares, expondo cadeias simples de seqüências homólogas. Estas sequências de cadeia simples parciais são re-recozido na mistura de reacção, resultando em um, de uma etapa, independente da sequência, de reacção rápida subclonagem livre de ligação.
Este trabalho descreve um) projeto racional construções alternativamente emendados para expressão em cloroplastos de plantas, peroxissomos, e citosois, 2) sua clonagem usando o novo método sem ligadura da montagem Gibson, 3) a sua entrega nas células da folha de tabaco com o gene Gun, e 4) Os resultados mostram a segmentação organelo, como observado com a GFPe microscopia confocal.
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Protocol
1. Projeto de Seqüências Alternativamente-emendados para vários Organelle Segmentação
- Determinar os locais de expressão de proteína final. Para este trabalho, o interesse é na segmentação do cloroplasto, peroxissomo e citosol.
- Use a literatura para identificar seqüências de proteínas e de DNA conhecidos como alvo proteínas para organelas de interesse. Neste caso, uma sequência de direccionamento a partir de cloroplastos de Arabidopsis thaliana L-isoaspartate metiltransferase 6,15, e uma sequência de direccionamento de peroxissoma de Arabidopsis thaliana, como a transtirretina-S-alantoína sintase 16,17 foram determinados.
- Identificar um regime-splicing alternativo que deve direcionar as proteínas de interesse para as organelas corretas. Para este trabalho, splice sites, observada num sistema de Arabidopsis naturais 6. A seqüência de mRNA foi redesenhado deixando os locais de splicing naturais, mas as sequências foram colocadas de codificação-cloroplastos ou peroxisome-targeting tags dentro dos íntrons alternativamente-emendados (Figura 1).
2. Assembléia Gibson de Peças de DNA
Veja também a Figura 2.
O método de montagem Gibson depende da ação de várias enzimas em uma mistura pré-fabricados a 1) digerir parcialmente as extremidades do DNA de cadeia dupla de fazer cadeias simples e 2) anneal pares de bases de cortesia da vizinha partes de DNA. Isto permite a clonagem de fragmentos de DNA, sem as limitações de locais de restrição.
- Escolher uma ordem para os elementos na construção de plasmídeo de ADN. Como exemplo TriTag-1 tem elementos de: a) um vector de plasmídeo (poro, contendo uma construção de GFP conhecido para trabalhar em plantas, um marcador de resistência a canamicina, e origens de replicação para E. coli e Agrobacterium tumefaciens hospedeiros), b) um sequência de promotor, (P ENTCUP2, expressa constitutivamente em plantas), C) uma sequência de direccionamento do cloroplasto (CTS), c) uma sequência de peroxissoma (PTS), e d alvo) de uma série de locais de união, tal como descrito anteriormente 6.
- Projetar o base-para-base de construção com em software de projeto silico. Macaco é um pacote gratuito de código aberto útil para este trabalho.
Nota: TriTag-1, tem a ordem: plasmídeo vetor, promotor, ATG, local dador, seqüência alvo cloroplasto, área doadora emenda, local neutro, local aceitante emenda, seqüência alvo peroxisome, local aceitante emenda, GFP como contido no plasmídeo vetor .- Projetar o in silico construção de DNA de tal forma que há uma sobreposição de 50 pb entre cada peça ao encomendar primers para PCR. É possível usar a sobreposição de 50 pb, como iniciadores: 25 pb cada direcção.
- Certifique-se de manter o controle da origem de cada uma das peças de seqüência. É como: um plasmídeo a ser cultivadas e miniprepped; uma sequência linear que podem ser utilizados como um molde de PCR; ou uma sequência que terá de sersintetizado comercialmente? Várias empresas oferecem serviços de síntese de DNA de baixo custo para os fragmentos <500 pb. Neste caso, o próprio TriTag é de 437 pb, pelo que foi vantajoso por ordem comercialmente.
- Os melhores resultados virão se todos os fragmentos são amplificados por PCR e purificou-se a partir deles o DNA molde. O marcador de resistência é um bom local para dividir esta grande de ADN em dois modelos menores, que são mais facilmente amplificado por PCR.
- Enzima de restrição Dpnl restrição corta DNA metilado. Se o molde de PCR era uma miniprep de E. coli, o tratamento Dpnl irá remover o ADN molde contaminante.
- Projetar o in silico construção de DNA de tal forma que há uma sobreposição de 50 pb entre cada peça ao encomendar primers para PCR. É possível usar a sobreposição de 50 pb, como iniciadores: 25 pb cada direcção.
- Purificar todas as seqüências de DNA separadamente e eluição em água, TE ou tampão EB.
- Pore vetor parte 1, ~ 3000 pb (setas verdes). Amplificado por PCR e Dpnl tratada.
- Pore vetor parte 2, ~ 3000 pb (setas pretas). Amplificado por PCR e Dpnl tratada.
- TriTag inserção, 437 bp (setas azuis). Ordenada comercialmente. Resuspend em DDH 2 O.
- P ENTCUP promotor, ~ 750 bp (setas laranja). Amplificado por PCR e Dpnl tratada.
- Medem-se as concentrações de cada uma das partes de ADN. Apontar para 150 ng / mL das peças vetoriais.
- Tome uma alíquota do mix montagem Gibson fora do freezer e descongelar em gelo. Isto está comercialmente disponível, mas também simples de fazer no laboratório 12-14.
- Há duas etapas para esta receita: um master mix 5x viscoso e 15 ul alíquotas 1.33x reação porte. A mistura principal 5x contém: 3 ml de 1 M de Tris-HCl pH 7,5, 300 ul de 1 M de MgCl2, 600 ul de 10 mM de cada dNTP, 300 ul de 1 M DTT, 1,5 g de PEG-8000, 20 mg de NAD, e ddH 2 O 6 ml. Prepare 320 mL alíquotas (18) e congelar todos, mas um a -20 ° C. A solução irá ser bastante viscoso. Rotular essas "tampão isotérmica 5X"
- Para o restante (320 mL), adicionar 1,2 mL T5 exonuclease, 20 ul Phusion alta-FIDElity DNA polimerase, 160 uL de Taq ADN ligase e 700 ul ddH 2 O. Preparar 15 mL alíquotas (~ 80) em gelo em tubos de PCR e armazenar a -20 ° C.
- Determinar os volumes de quantidades equimolares de cada um dos fragmentos. Existem algumas calculadoras on-line, incluindo Gibthon.org. Deve haver um total de 5 mL de todas as partes de ADN. Adicione-os a 15 mL Gibson misturar alíquota. Se isto requer volumes muito pequenos a pipeta, diluir os fragmentos de DNA e / ou de usar mais do que uma alíquota.
- Não se esqueça de preparar um controle do DNA vetor sozinho (por exemplo, a parte do DNA que contém o marcador de resistência a antibióticos) e completar o volume com água.
- Incubar os tubos num ciclizador térmico a 50-55 ° C durante 30-60 minutos. Substituir no gelo e se transformar em E. coli através de choque térmico células quimicamente competentes. Não use pilhas electrocompetentes. A concentração elevada de sal e a concentração relativamente baixa de ADNpode fazer com que as células de arco.
- Aplicar todos os 20 ul de uma preparação comercial de 200 ul de cálcio-cloreto de E. competente coli.
Incubar em gelo 30 min e choque térmico de 60 seg a 42 ° C - Retornar ao gelo 2 min, aplicar 750 ul de meio LB SOC ou recuperar e agitação num tubo de microcentrifugação de 30 minutos a 37 ° C. Placa da mistura e diluições apropriadas em LB + Kan (ou outro antibiótico apropriado). Isso pode resultar em maior fundo (e um maior número de eventos de recombinação não-alvo) do que o tradicional clonagem baseada ligadura mas vale a pena para a tela cerca de 10 colônias.
- Aplicar todos os 20 ul de uma preparação comercial de 200 ul de cálcio-cloreto de E. competente coli.
- Confirmar clone através de sequência e armazenar-se uma alíquota a -80 ° C
3. Biobalística transfecção de tabaco com o Gene Gun
Esta é uma técnica que está estabelecida em Jove 18,19. As principais etapas e as diferenças são descritas a seguir.
- Crescer 50-100 ml E. coL ou 200 ml de Agrobacterium. A cultura-prep Maxi. Uma concentração de cerca de 1.500 ng / mL é necessário para continuar.
- Prepare gene arma balas como descrito anteriormente. Coloque-os no Gene Gun.
- Para a transfecção de Nicotiana benthamiana tabaco tecido foliar da epiderme, escolha uma folha grande perto da base de uma planta de 3 meses de idade. Cortá-la com cuidado e coloque-o lado de baixo para cima em papel-toalha molhada em um prato de 15 centímetros de Petri.
- Ajuste a pressão Ele para o Gene Gun para 200-250 psi.
- Procurar com cuidado o Gene Gun entre as nervuras no lado inferior de uma folha, a cerca de 3-5 cm acima dela. Solte a segurança e entregar as partículas para a folha. Cada bala pode ser usada duas vezes no mesmo local sobre a folha. Se as folhas explode, descartar e começar uma nova folha-haja alguma variação na dureza foliar, devido às condições de crescimento, tais como a idade, umidade, etc Para uma folha de 12 cm, à espera de encaixar cerca de 6 tiros.
- Armazenar a folha, coberto com a parte superior de umPlaca de Petri para 2-3 dias com pouca luz no banco.
- Examine a folha em um microscópio de dissecação equipado com fluorescência UV, e procurar por células individuais que expressam GFP. Dissecar 5-10 seções mm de folha.
- Mergulhe a folha em um slide poço profundo microscópio em ~ 200 mL de 0,1% Triton X-100. O detergente ajuda a impedir que as bolhas de ar formando na superfície, e o poço de lâmina de microscópio permite uma área de imagem de tecido maiores.
4. Microscopia confocal do tecido Transfectadas
Estas instruções variam para cada instrumento, por isso é essencial para se devidamente treinado.
- Para os experimentos de detecção de fluorescência, definir o laser de excitação a 489 nm, e definir os detectores fotomultiplicadores de 500-569 nm para fluorescência da GFP e 630-700 nm para clorofila auto-fluorescência. Células de imagem usando um objetivo de imersão em água 40x.
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Representative Results
O esforço do projeto foi o resultado de um planejamento significativo. Novel para este projecto é a utilização de processamento alternativo para criar uma pré-ARNm que é traduzido em proteínas diferencialmente expressas. Estas proteínas são expressas em diferentes organelos, neste caso, o cloroplasto, peroxisoma e / ou citoplasma. Foram adaptados gene Arabidopsis natural que é alternativamente emendados 6, e colocadas conhecido cloroplasto 6 e 17 sequências de direccionamento de peroxissoma nos exões alternativos (TriTag-1 e TriTag-2). TriTag-3 consiste em um sinal peroxisome incorporado dentro de uma região de baixa complexidade da seqüência de cloroplasto. Estes foram colocados no quadro com a GFP (Figura 1).
Os plasmídeos usados neste estudo continha assim vários elementos: o regime de splicing alternativo do gene nativo PIMT2 6, cloroplasto e peroxissoma sequências de direccionamento, GFP, e um esqueleto de plasmídeo. Uma vez que cada tem muito especificaçãoific necessária sequência, um método independente de sequência é necessário. O protocolo de montagem Gibson 12,13 pode ser utilizado em qualquer sequência desde que as suas partes constituintes são concebidos com similaridade de sequência com o outro, e não contêm sequências de repetição. Em resumo, os fragmentos de ADN lineares são construídos (quer através de amplificação por PCR, síntese comercial, ou digestão de um plasmídeo de pré-fabricados) tal que eles têm aproximadamente 50 pb da sequência homóloga de sobreposição (Figura 2). Quantidades equimolares de cada um dos fragmentos de ADN são combinados num único tubo que contém a mistura de montagem Gibson, incubados a 50 ° C durante uma hora, e transformou-se em E. coli. Os plasmídeos resultantes a partir do protocolo de montagem de Gibson foram confirmadas por sequenciação de Sanger.
Neste estudo, os três diferentes construções de metas de organelas GFP foram comparados com GFP untagged e um GFP Rubisco-marcado. A microscopia confocal foi utilizada para detectar a fluorescência da GFP no Sicélulas ngle transitoriamente transformadas. Em experiências de controlo, a expressão transitória observada foi correlacionada com os cloroplastos (facilmente identificáveis por autofluorescência vermelho de clorofila), os núcleos (grande organela que não é um cloroplasto e tem apenas um por célula), e / ou pequenas organelas que se acredita ser peroxissomos. Verde (GFP) e (clorofila autofluorescência) canais de vermelho foram sobrepostas para estudar a localização intracelular (Figura 3). Para uma discussão mais completa sobre esses resultados, consulte o nosso companheiro artigo 11.
Como previsto, em todas as três construções de direccionamento dupla, GFP foi observada nos cloroplastos (Figura 4) em micrografias confocal de sobreposição. Alvo TriTag-1 e TriTag-2 GFP também para o citosol e o pequeno organela que se acredita ser o peroxissoma (Figuras 4a e 4b, respectivamente). TriTag-3 alvos a GFP para apenas o cloroplasto ea peroxisome, mas nãoo citosol (Figura 4c). Um resumo dos resultados é diagramado (Figura 5).
Figura 1. Desenho de construtos de splicing alternativo para expressão diferencial organelo em Nicotiana benthamiana. Emendo diagramas de (a) TriTag-1, (b) TriTag-2, e (c) TriTag-3, que mostra as sequências não-alvo (cinzento), cloroplasto sequências de direccionamento (luz verde), sequências de direccionamento de peroxissoma (laranja), e a sequência de codificação da GFP usado em experiências de expressão transiente. TriTag-1 e TriTag-2 consistem em construções de splicing alternativo; TriTag-3 consiste em um sinal peroxisome incorporado dentro de uma região de baixa complexidade da seqüência de cloroplasto. Seqüências de
Figura 2 Diagrama esquemático para a montagem Gibson:.. Um novo método para montagem de sobreposição de fragmentos de DNA O método de montagem Gibson para a construção plasmídeo 12,13 está rapidamente substituindo tradicional clonagem restrição-ligadura em muitos laboratórios. Essencialmente, pode-se conceber uma construção em silício que contém o ADN de interesse, exactamente, composta de produtos de PCR amplificados a partir de várias fontes. Conceber iniciadores que são complementares uns aos outros, e amplificar por PCR de cada fragmento com os iniciadores coloridas. Adicionar todas as peças para um único tubo com a mistura de enzimas, e transformar E. células competentes de E. coli. Clique aqui para ver limagem Arger.
Tratamentos de controle Figura 3. Bombardeado em N. epiderme foliar benthamiana. (ac) GFP Sem marcação. (a) canal verde. GFP não marcado é expresso no núcleo e em torno da periferia da célula, correspondente ao citosol, mas não o vacúolo. (B) cloroplastos vermelhas indicam autofluorescência de clorofila. (C) sobreposição. Nesta construção de fluorescência é observado no núcleo e apenas citosol, mas não os cloroplastos. (Df) de controlo marcado com GFP cloroplastos. (D) do canal verde. GFP é expresso em grandes organelas, com uma célula, conforme descrito. (E) cloroplastos vermelhas indicam autofluorescência das cloroophyll. (f) Overlay. Neste caso, observam-se os cloroplastos amarelo, indicando que a GFP (verde) está voltado para o cloroplasto. Reproduzido com permissão 11. Clique aqui para ver imagem ampliada.
Figura 4. Tri-Tag-1, 2, 3 GFP marcado fundiu imagens. (A) Tri-Tag1. Neste caso, são observadas as periferias dos cloroplastos amarelo, indicando que a GFP é direccionada para o cloroplasto. GFP é também observada no citosol, bem como pequenas organelas puntiformes que podem ser peroxissomas. (B) Tri-Tag2. Neste caso, são observados periferias cloroplastos amarelo, indicando que a GFP é voltado para o c hloroplast. GFP é também observada no citosol, bem como pequenas organelas puntiformes que podem ser peroxissomas. (C) Tri-Tag3. Neste caso, observam-se os cloroplastos amarelo, bem como pequenas organelas puntiformes que podem ser peroxissomas. Mas GFP não é observado no citosol. Reproduzido com permissão 11. Clique aqui para ver imagem ampliada.
Figura 5. Compartimentos de uma célula típica epiderme de folhas de tabaco. Aqui os seus tamanhos relativos e localizações dentro da célula são mostrados, e os níveis de expressão relativa observada através de microscopia confocal. Reproduzido com permissão 11./ 51234/51234fig5highres.jpg "target =" _blank "> Clique aqui para ver imagem ampliada.
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Discussion
Neste estudo, as estratégias simples são descritos para a localização de uma única proteína transgénica para vários compartimentos celulares em plantas. O objetivo era projetar construção que expressasse um único gene em mais de uma organela em Nicotiana benthamiana. As estratégias incluem desenho racional de construções de DNA baseado em GFP, montagem Gibson, a entrega dos plasmídeos de células da folha com o Gene Gun, e observação dos resultados com a microscopia confocal.
Três, tags N-terminais curtas diferentes foram projetados para cloroplasto simultânea, peroxisome e citosol alvo 11. Estes "TriTags" foram projetados pela combinação DNAs que ocorrem naturalmente que codificam mRNAs alternativamente emendados que direcionam as proteínas codificadas para tanto o cloroplasto mais citoplasma 6 ou o peroxisome mais citoplasma 17. O TriTag-3 não dependem de splicing alternativo e consiste de uma sequência de cloroplasto de segmentação em que um ndparcela turally desestruturado foi substituído por uma seqüência segmentação peroxisomal 15,17. A função TriTags in vivo para atingir a GFP em células da epiderme da folha de Nicotiana benthamiana (Figura 5).
Micrografia confocal mostraram que TriTag-1 e TriTag-2 alvo GFP para o cloroplasto, peroxisoma, e citosol de forma eficaz, mas com preferência para o cloroplasto e peroxissoma, respectivamente (Figuras 4a e 4b). TriTag-3 alvos GFP apenas para o cloroplasto e o peroxissoma, mas não o citosol (Figura 4c). Ao todo, essas marcas podem reduzir o tempo e os recursos gastos em clonagem de plantas de engenharia metabólica, especialmente para aqueles que necessitam de expressão específica nos cloroplastos e peroxissomos.
Modificações e resolução de problemas
Os TriTags como atualmente construídas são bastante estática. No entanto, o underlying tecnologia, splicing alternativo para permitir a tradução de diferentes marcas específicas do local, é flexível. As tags específicas cloroplastos e / ou peroxissoma existentes poderiam ser alterados por qualquer outra organela, seja a via de secreção, a mitocôndria, uma tag ER residência, o vacúolo. Estes também podem ser combinadas com promotores específicos de tecidos, por exemplo, para as sementes, as flores, as raízes, as folhas, caules, etc
Para um projeto como este, o método de montagem Gibson 12-14 de clonagem de construções é o ideal. É uma ferramenta simples e poderosa para subclonar qualquer seqüência sem as limitações de sítios de restrição. Nas reações de uma etapa, montagem Gibson criou rapidamente as construções e os controles com um mínimo de esforço na clonagem. A técnica de montagem Gibson é quase infinitamente modificável para qualquer sequência desejada, desde que as sequências molde pode ser amplificado por PCR. Apesar de, neste exemplo, a montagem de Gibson foi mostrado com um plasmídeo digerido, PCR amplificar o vector tende a funcionar melhor do que utilizar um miniprep digerido.
O Gene Gun é um método rápido e eficaz para a transfecção transitória de células, como foi estabelecido pela revista 18,19. Nicotiana benthamiana, tem grandes células folha lobate epidérmicas, que são ao mesmo tempo ideal para a transfecção com o Gene Gun, mas também para observação com microscopia confocal. O protocolo para fazer balas está bem estabelecida. O ouro tem sido utilizada como um microveículo na maior parte das experiências na literatura até à data, mas microtransportadores tungsténio são recentemente disponível a baixo custo.
Limitações das técnicas
Uma das principais limitações do método de Gibson é a presença de sequências repetidas: quanto maior for a zona de sobreposição é o resultado menos produtos secundários. A digestão dos produtos de PCR com Dpnl deve remover contaminantes modelos de plasmídeo; que são geralmente a fonte de ladoprodutos. As enzimas digerir os fragmentos de DNA a partir de DNA de cadeia dupla em de cadeia única. A presença de sequências repetidas perto das extremidades (~ 1 kb) de fragmentos de DNA aumenta significativamente a possibilidade de recombinação indevida. Como assim, se repete dentro das seqüências também representam uma limitação: não é bem conhecida, e difícil de controlar até que ponto os mastiga T5 exonuclease cópias de DNA de fita simples. A actividade rápida da exonuclease é temperada pela temperatura de reacção elevada (50-55 ° C), eventualmente desnaturação da enzima, e a diminuição da viscosidade do movimento global na solução. Para mais ajuste fino das etapas de reação, seqüência e ligadura clonagem independente (SLIC) 20 é o preferido.
Uma das principais limitações da técnica de canhão de genes é de que produz apenas na ordem de 1-10 células transitoriamente transformadas por evento de disparo.
Significância com respeito aos métodos existentes
A técnica de montagem Gibson está curtindo a rápida adoção por sua facilidade, flexibilidade e adaptabilidade. É um protocolo mais rápido do que o tradicional de clonagem de restrição / ligadura, e não necessita de sequências específicas, tais como as necessárias para a digestão de restrição. Ele não se limita a dois ou três fragmentos a serem recombinadas; os pesquisadores originais têm demonstrado com sucesso em até 10 partes, embora com eficiência limitada. Para muitos investigadores montagem Gibson faz para um maior número de clones positivos.
Para mais transformantes com técnicas Biolistic, ou para a criação de tecido de calo transformado, deve ser utilizado o uso de um dispositivo de bombardeamento de estilo armário (por exemplo, o BioRad PDS-1000). Um método alternativo é Agrobacterium infiltração.
Aplicações Futuras
Gibson montagem permite aglomerados maiores de ADN a ser montada, ao ponto em que não tem sido observado um limite máximo. Os autores originais tê-lo usado para montar várias centenas de kilobases DNA 13.
A capacidade para atingir selectivamente múltiplas organelos com uma única construção genética tem o potencial para reduzir o número de genes que precisam de ser transformada. A entrega de fragmentos cada vez maiores de ADN (e portanto vias metabólicas maiores) é uma meta de curto prazo. Caminhos isoprenóides foram entregues para o cloroplasto por métodos biolística; outros grupos de genes, como as vias de fixação de carbono alternativas estão no horizonte.
Etapas críticas dentro do protocolo.
Em assembléia Gibson, certifique-se as seqüências de modelo não tem homologia com o outro, exceto nos locais de recombinação alvo.
Na transformação biobalística das plantas Nicotiana, ter o cuidado de manter a arma gene cerca de 10-15 cm acima das folhas de umaª manter a pressão de hélio, em 200-250 psi. Mais perto do que isso, a folha frágil vai explodir, e mais longe do que eles não vão ser bem transformado. Dois dias após a transfecção uma contusão deve aparecer na folha, se for devidamente transformado.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer a Jen Sheen do Hospital Geral de Massachusetts para a generosa doação de mudas de Nicotiana benthamiana. Jen Bush nos ajudou muito no conselho em cultivo de plantas ea criação de uma área de câmara de crescimento. Tom Ferrante, do Instituto Wyss ofereceu ajuda fundamental com microscopia confocal. Os autores gostaria especialmente de agradecer Don Ingber do Hospital Infantil de Boston e do Instituto Wyss para a generosa doação de um Gene Gun e suprimentos associados. O financiamento para este projeto foi fornecido por meio de um acordo de cooperação com o Departamento de Energia Projetos de Pesquisa Avançada Agência (ARPA-E Award # DE-000079) para PAS, JCW, e MdM, e através Chimerion Biotechnology, Inc. para MJV.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Oligonucleotide primers | IDT | (custom) | Design specifically for construct |
| GeneBlocks | IDT | (custom) | 500 bp oligonucleotides |
| ApE software | U Utah | (download) | http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/ |
| MinElute kit | Qiagen | 28004 | Used to purify PCR products |
| QIAprep spin miniprep kit | Qiagen | 27104 | Used to prepare cloning-appropriate amounts of plasmid |
| Phusion Master Mix with GC Buffer | NEB | M0532S | Used to PCR-amplify gene of interest |
| Gibson assembly reaction mix | NEB | E2611L | Master mix of the following 9 ingredients |
| 1 M Tris-HCl pH7.5 | Teknova | T1075 | Gibson assembly mix |
| 1 M MgCl2 | G Biosiences | 82023-086 | Gibson assembly mix |
| dNTP mix | Fermentas | R0192 | Gibson assembly mix |
| 1 M DTT | Fermentas | R0861 | Gibson assembly mix |
| PEG-8000 | Affymetrix | 19966 | Gibson assembly mix |
| NAD | Applichem | A1124,0005 | Gibson assembly mix |
| T5 exonuclease | Epicentre | T5E4111K | Gibson assembly mix |
| Phusion polymerase | NEB | F530S | Gibson assembly mix |
| Taq DNA ligase | NEB | M0208L | Gibson assembly mix |
| Gibthon.org | Website to simplify calculations | ||
| Plasmid PLUS Maxi kit | Qiagen | 12963 | Used to prepare DNA for gene gun bullets |
| Gene Gun system | BioRad | 165-2451 | Includes all parts necessary |
| Nicotania benthamiana | (n/a) | (n/a) | Gift of Jen Sheen, MGH |
| Confocal microscope | Leica | SP5 X MP | Imaging of resultant cells |
| Deep well slides | Electron Microscopy Sciences | 71561-01 | Used for confocal imaging |
| A Plasmid Editor (ApE) | University of Utah | http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape | |
| Gibthon:Ligation calculator | http://django.gibthon.org/tools/ligcalc/ |
References
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