Summary
Bu çalışma, seçici olarak BioRad Gene Gun kullanılarak tahlil, bitkilerde hücre-altı organel hedefleyen için yeni bir yöntem tarif eder.
Abstract
Birden fazla alt-hücresel organellere tek bir hedef protein için, bitkiler tipik olarak, ilgili genleri çoğaltmak ve diferansiyel promoterler ve / veya sinyal sekansları da dahil olmak üzere karmaşık bir düzenleyici stratejiler kullanılarak ayrı ayrı her bir geni ifade eder. Metabolik mühendisleri ve belirli bir organele hedef enzimlerin ilgilenen sentetik biyologlar bir meydan okuma ile karşı karşıyayız: Birden fazla organele lokalize olan bir protein için, mühendis aynı gen birden çok kez klonlamak gerekir. Bu çalışma bu strateji için bir çözüm sunar: mRNA alternatif kırpılmayı sokmak. Bu teknoloji kurulmuş ve peroksizom kloroplast hedefleme dizilerinin yararlanır ve alternatif olarak eklenmiş bir tek mRNA halinde birleştirir. Bazı ek yeri varyantları sitoplazmada peroksisom bazı ve bazı, kloroplast gönderilir. Burada sistem çoklu-organel alternatif eklenmeye hedefleme için tasarlanmıştır. Bu çalışmada, GFP ifade olması bekleniyordurasyonel şekilde tasarlanan 5 'mRNA etiketleri bir dizi kloroplast, sitosol ve peroksisom olarak işlenene. Bu etiketler, heterolog genler, birden çok alt-hücresel organellerde ifade edilmesi gerektiğinde gerekli klonlama miktarını azaltma potansiyeline sahiptir. Bu yapılar önceki çalışmada 11 olarak tasarlanmıştır ve Gibson montaj, kısıtlama enzimleri gerektirmeyen bir ligasyon bağımsız klonlama yöntemiyle klonlanmıştır. Elde edilen plazmidler, bir modifiye protokol ile Gen Tabancası Nicotiana benthamiana yaprak epidermal hücrelere dahil edilmiştir. Son olarak, transforme edilmiş yapraklar konfokal mikroskopi ile gözlemlenmiştir.
Introduction
Bu çalışma, bitki hücrelerinin çok organellerde bir raportör proteini ifade etmek için, ancak yalnızca tek bir DNA yapısı ile, burada bir metabolik mühendislik / sentetik biyoloji projedir.
Birden fazla konuma proteinleri hedef için bir yaklaşım, çok sayıda klonlama genetik kopya, farklı bir lokalizasyon peptit içeren her içerir. Her kopya tek dönüşümleri 1 çaprazlanması ile, alternatif olarak ardışık yeniden dönüştürülmesinin tarafından tanıtılan, ya da olmalıdır. Bu ek klonlama içerir ve terminaline başına bir lokalizasyon etiketi ile sınırlıdır.
Birden fazla yere lokalize protein için başka bir alternatif birleştirme 2-5 geçer. RNA, tek bir genden transkribe edilen, ancak transkriptinin farklı numaralar hücre başına birden fazla şekilde genellikle, farklı işlenir. Bu, tek bir genden transkribe hücreye birden fazla haberci RNA neden olabilir. Bu farklı Messenger RNA, aynı proteinin farklı izoformları için kodlayan, ya da bir çerçeve kayması, tamamen farklı bir protein halinde olabilir. Alternatif yapıştırma yıllardır literatürde tarif edilmiş olmasına rağmen, etki ve korunmuş verici ve alıcı ekleme sitelerinin mekanizmaları sadece daha yakın 6 açıklanacaktır edilmektedir. Bu siteleri daha iyi tarif ediliyor, onlar mühendislik için fırsatlar açmak.
Birden organellerde bir proteini ifade ederken bitki metabolik mühendisleri bir meydan okuma ile karşı karşıyayız. Birden fazla organele lokalize olan bir protein için, mühendis ilgi organele yönlendirerek, ayrı bir sinyal sekansı ile aynı gen, her birden çok kez klonlanması gerekir. Üç organellerde tek bir gen için, bu sadece üç genlerdir. Ancak altı gen metabolik yolu için, bu 18 gen, önemli bir çaba klonlama için genişler. Tek alternatif dilinmemiş gen işareti içine birden yerelleştirme dizileri birleştirerekificantly bu çaba azaltır. Örneğin, yeniden mühendislik fotorespirasyon 7,8 ve izoprenoid sentez 9,10 kloroplast ve peroksizomları hem de içerir. Doğal Arabidopsis thaliana sisteminde görüldüğü gibi bizim durumumuzda biz daha önce 6 tarif ekleme sitelerin yararlandı. Bu rasyonel tek başına doğal ek yeri siteleri ayrılan mRNA sekansı yeniden, ancak alternatif olarak eklenmiş-intron (Şekil 1) içinde ya da kloroplast-hedefleme peroksizom etiketler kodlayan dizileri yerleştirilmiş olur. Ifade edilen protein ya da kodlanan pre-mRNA, bir intron (Şekil 1G ve 1 H) olarak eksize edildi bağlı olarak, bir etiket olabilir veya olmayabilir. Bu çalışmada sunulan yapıların tasarımı hakkında daha fazla bilgi için, arkadaşı makale 11 bakın lütfen.
Bu hala önemli bir klonlama çaba, Gibson montaj, DNA yapıları klonlama için yeni bir yöntem olduğundan, uinşaat sed. Gibson yöntem ne olursa olsun, kısıtlama siteleri (Şekil 2), 12-14 arasında, herhangi bir sıra için kullanılabilmektedir. Enzimlerin spesifik karışımı, tek aşamalı, izotermal montaj sağlar. Bu yöntemde, çok sayıda çift kollu lineer DNA parçaları, 50 bp ~ örtüşen dizilerine sahip olacak şekilde tasarlanmıştır. Gibson düzeneği enzim karışımı kısmen homolog dizilerin tek kollu maruz bırakılması, lineer DNA parçaları sindirir. Bu kısmi tek sarmallı diziler, hızlı, tek aşamalı, dizi-bağımsız, ligasyon içermeyen alt klonlama reaksiyonu ile sonuçlanan reaksiyon karışımı içinde yeniden tavlanır.
Bu çalışma bitki kloroplast, peroksisomlara ve sitosollerde ifade için 1) rasyonel tasarım, alternatif olarak eklenmiş yapıları açıklar, 2) kendi klonlama Gibson meclisin yeni ligasyonu-free yöntemi kullanılarak, 3) Gen Tabancası ile tütün yaprak hücrelerinin içine teslimat ve GFP ile gözlemlendiği üzere, organel hedefleme arası 4) Sonuçve konfokal mikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hedefleme Çoklu organel için alternatif olarak eklenmiş diziler-1. Design
- Nihai protein ifadesi için siteler belirler. Bu iş için, faiz kloroplast, peroksisom ve sitosola hedefleme olduğunu.
- Ilgi organellere proteinleri hedef bilinen protein ve DNA dizilerini tanımlamak için literatür kullanın. Bu durumda, bir kloroplast Arabidopsis thaliana L-isoaspartate metiltransferaz 6,15 ikinci hedef sekansı ve Arabidopsis thaliana transtiretin gibi S-allantoin sentez 16,17 ikinci hedef sekansı, bir peroksizom belirlenmiştir.
- Doğru organellere ilgi proteinleri hedef gereken bir alternatiftir-dilindiğinde rejimini belirlemek. Doğal Arabidopsis sistemde 6 gözlendiği gibi, bu iş için, siteleri splice. MRNA sekansı, doğal bırakarak yeniden birleştirme bölgelerini, ama diziler kodlayan bir kloroplast ya da peroksizomlarda yerleştirildialternatif dilinmemiş intronlarda içinde etiketler (Şekil 1) ome-hedefleme.
DNA Parçaların 2.. Gibson Meclisi
Şekil 2 'de bakınız.
Gibson montaj yöntemi: 1) için bir ön-karışım yapılmıştır çeşitli enzimlerin harekete bağlıdır, kısmen tek kollu DNA parçaları ve komşu 2) tavlama ücretsiz baz çifti olmak üzere iki iplikçikli DNA'nın uçlarını sindirimi. Bu kısıtlama sitelerinin sınırlamalar olmadan DNA fragmanlarının klonlanması için izin verir.
- DNA plazmid yapısı içinde elemanları için bir düzeni seçin. A) bir plasmid bitkiler, bir kanamisin direnç işaretleyici çalışmak için bilinen bir GFP yapısını içeren bir vektör (gözenek, ve E. coli ve Agrobacterium tumefaciens ana), b) a için bir replikasyon kökeni: Bir örnek olarak TriTag-1 elemanları vardır promoter dizisi, (P ENTCUP2, bitkilerde yapıcı olduğu gösterilmiştir), C) sekansı (CTS) ve bir kloroplast hedefleyen, c) a peroxisome), daha önce tarif edildiği gibi, 6, ek yeri siteleri, bir dizi dizisi (PTS) ve d hedefleme.
- Yapı tabanı-için-baz ile siliko tasarım yazılımı tasarlayın. APE, bu iş için kullanışlı bir açık kaynak kodlu ücretsiz paketidir.
Not: TriTag-1, sırası var plazmid vektörü, promoter, ATG, bağlayıcı verici alan, kloroplast hedef sekans, bağlayıcı verici alan, nötr yer, bağlayıcı alıcı alan, peroksizom hedef sekans, bağlayıcı alıcı alan, GFP plazmid vektörü içinde ihtiva gibi .- PCR için primerler sipariş ederken her bir birim arasında bir 50 bp üst üste binme olduğu şekilde, in silico DNA yapısı tasarımı. 25 bp her bir yönü: Bu primerler olarak 50 bp üst üste kullanmak mümkündür.
- Dizisi parçaların her birinin kökeni takip emin olun. Bu gibidir: yetiştirilen ve miniprep için bir plazmid; , bir PCR şablonu olarak kullanılabilen bir doğrusal dizi; ya da olması gereken bir diziTicari olarak sentezlenmiş? Bazı şirketler fragmanları <500 bp için düşük maliyetli DNA sentezi hizmetleri sunuyoruz. Ticari olarak sipariş için avantajlı oldu bu nedenle bu durumda, TriTag kendisi 437 bp.
- Tüm PCR büyütülmüş parçalar ve model DNA saflaştırılan ise en iyi sonuçlar gelecektir. Direnç marker daha kolay PCR büyütülmüş iki küçük şablonlar içine bu büyük DNA bölmek için iyi bir noktadır.
- Kısıtlama Kısıtlama enzim DPNI metilatlı DNA'yı keser. PCR şablonu E bir miniprep olsaydı coli, DPNI tedavi kirlenmesine şablon DNA kaldıracaktır.
- PCR için primerler sipariş ederken her bir birim arasında bir 50 bp üst üste binme olduğu şekilde, in silico DNA yapısı tasarımı. 25 bp her bir yönü: Bu primerler olarak 50 bp üst üste kullanmak mümkündür.
- Ayrı ayrı tüm DNA dizileri arındırın ve su ya da TE Tamponu EB elute.
- Gözenek vektör part 1, ~ 3.000 bp (yeşil oklar). PCR ile amplifiye edilmiş ve DpnI işlemden geçirildi.
- Gözenek vektör part 2, ~ 3,000 bp (siyah oklar). PCR ile amplifiye edilmiş ve DpnI işlemden geçirildi.
- TriTag insert, 437 bp (mavi oklar). Ticari emretti. Resuspend GKD 2 O. içinde
- P ENTCUP organizatörü ~ 750 bp (turuncu oklar). PCR ile amplifiye edilmiş ve DpnI işlemden geçirildi.
- DNA parçalarının her biri konsantrasyonlarını ölçün. Vektör adet 150 ng / ul hedefliyoruz.
- Dondurucu üzerinden Gibson montaj karışımı bir kısım alın ve buz üzerinde eritin. Bu laboratuarda 12-14 yapmak için ticari olarak mevcut, ama aynı zamanda basit.
- Viskoz 5x master miks ve 15 ul reaksiyon boyutu 1.33x tümbölenleri: Bu tarifi için iki adım vardır. 5x ana karışım içerir: 3 ml 1 M Tris-HCl pH 7.5, 300 ul 1 M MgCI2, her dNTP, 600 ul 10 mM, 300 ul 1 M DTT, 1,5 g PEG-8000, 20 mg NAD ve GKD 2 6 ml O. 320 ul hacimde (18) hazırlayın ve -20 ° C'de biri ancak tüm dondurmak Çözelti, oldukça viskoz olacaktır. Bu "5X izoterm tampon" Label
- (320 ul) kalan bir için, 1.2 ul T5 ekzonükleaz, 20 ul Phusion High-FID eklemekelity DNA Polimeraz, 160 ul Taq DNA Ligaz ve 700 ul GKD 2 O. 15 ul hacimde (~ 80) -20 ° C'de PCR tüpleri ve mağaza buz üzerinde ° hazırlayın C.
- Parçalarının her biri için eşit molar miktarlarda hacimleri belirler. Gibthon.org dahil olmak üzere birkaç online hesap makineleri vardır. Bütün DNA parçalarının 5 ul toplam olmalıdır. Gibson alikonun mix 15 ul ekleyebilirsiniz. Bu pipet için çok küçük hacimli gerektiriyorsa, DNA fragmanları seyreltmek ve / veya birden fazla kısım kullanın.
- Yalnız vektör DNA'nın bir denetim hazırlamak (antibiyotik direnç işaretleyici içeren, örneğin DNA parçası) ve su ile hacmini telafi etmek için unutmayın.
- 30-60 dakika, 50-55 ° C'de bir termal döngüleyici içinde inkübe. Buz üzerinde değiştirin ve E. dönüşümü ısı-şok kimyasal yetkin hücreler yoluyla coli. Elektrokompenant hücreleri kullanmayın. Yüksek tuz konsantrasyonu, ve nispeten düşük DNA konsantrasyonuhücreler ark neden olabilir.
- 200 ul kalsiyum-klorür, ticari hazırlanması, yeterli E. için her 20 ul uygulayın coli.
42 ° C'de 30 dakika buz ve ısı şok 60 saniye inkübe - , Buz 2 dakika geri dön 750 ul SOC veya LB ortamı uygulanır ve 37 ° C sıcaklıkta bir mikro santrifüj tüpü içinde 30 dakika geri çalkalama LB + Kan (veya uygun başka bir antibiyotik) ile ilgili en karışımı ve uygun dilüsyonları Plate. Bu geleneksel ligasyon esaslı klonlama daha yüksek bir arka plan (ve hedef olmayan rekombinasyon olayları daha yüksek bir sayı) neden olabilir ama yaklaşık 10 koloniler taranması için faydalıdır.
- 200 ul kalsiyum-klorür, ticari hazırlanması, yeterli E. için her 20 ul uygulayın coli.
- Sırası ile klon olduktan sonra, -80 ° C'de bir kısım depolamak
Gen tabancası ile Tütün 3. Biolistik Transfeksiyonu
Bu vallahi 18,19 kurulmuş olan bir tekniktir. Anahtar adımlar ve farklar aşağıda tarif edilmiştir.
- 50-100 ml E. büyütün coli ya da 200 ml Agrobacterium. Maxi-hazırlık kültürü. Yaklaşık 1500 ng / ul 'lik bir konsantrasyon devam etmek için gereklidir.
- Daha önce tarif edildiği gibi, gen tabancası mermi hazırlayın. Gen Tabancası içine yükleyin.
- Nicotiana benthamiana tütün yaprak epidermal doku transfeksiyonu için, 3 aylık bir bitkinin tabanına yakın büyük bir yaprak seçin. Özenle kesilmiş ve 15 cm Petri kabındaki ıslak kağıt havlu üzerine alt tarafı yukarıya yerleştirin.
- 200-250 psi Gene Gun O basıncını ayarlar.
- Dikkatle yaklaşık 3-5 cm yukarıda, bir yaprağın alt tarafındaki kaburgaların arasındaki Gen Tabancası hedefliyoruz. Güvenlik bırakın ve yaprak parçacıkları sağlar. Her mermi, yaprak üzerinde aynı yerde iki kez kullanılabilir. Yaprak patlar, atmak ve başlangıç, yeni bir yaprak-orada yaprak tokluk bazı farklılıklar nedeniyle böyle bir 12-cm yaprak için, yaklaşık 6 çekim sığdırmak için beklemek vs yaş, nem gibi büyüme koşullarına etmektir.
- Bir üst kaplı yaprak, saklayınBankta düşük ışıkta 2-3 gün boyunca petri.
- UV floresan ile donatılmış bir diseksiyon mikroskop yaprak inceleyin ve GFP'yi tek tek hücreler için arayın. Yaprağın 5-10 mm bölümleri ayır.
- ~ 200 ul% 0.1 Triton X-100 altında bir derin kuyu mikroskop slayt yaprak daldırın. Deterjan yüzeyinde oluşan hava kabarcıklarını önlemeye yardımcı olur ve derin kuyu mikroskop slayt daha büyük bir doku görüntüleme alanı sağlar.
Geçiştirilmiş Doku 4. Konfokal Mikroskopi
Bu talimatlar her enstrüman için değişir, bu yüzden düzgün eğitim almak esastır.
- Floresans saptama deneyleri için, 489 nm uyarım lazer ayarlamak ve GFP floresans ve klorofil oto-floresan için 630-700 nm için 500-569 nm photomultiplier dedektörleri ayarlayın. 40x su daldırma objektif kullanarak Görüntü hücreler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tasarım çaba önemli bir planlama sonucudur. Bu proje için yeni diferansiyel olarak ifade edilen proteinlerin çevrilmiş bir ön-mRNA'nın alternatif uç uca eklenmesi oluşturmak için kullanılmasıdır. Bu proteinler, bu durumda, farklı organeller olarak ifade edilmiştir kloroplast, peroksizom ve / veya Sitosol. Bu alternatif olarak 6 eklenmiş doğal Arabidopsis geni uyarlanmış ve (TriTag-1 ve TriTag-2) alternatif olarak ekson dizileri hedef kloroplast 6 ve peroksizom 17 bilinen yerleştirilen. TriTag-3 kloroplast dizisinin düşük karmaşıklık bölgesi içinde gömülü bir peroksizom sinyali oluşur. Bu GFP (Şekil 1) ile çerçeve içine yerleştirildi.
Sekansları, GFP geninin hedef PIMT2 6, kloroplast ve peroksisom gelen yerli alternatif ekleme rejimi ve bir plazmid omurgasını: Bu çalışmada kullanılan plazmidler, böylece çeşitli elemanları ihtiva etmiştir. Her biri çok spec beriIFIC sekansı, gerekli bir dizi-bağımsız bir yöntem gereklidir. Gibson düzeneği protokolü 12,13 kadar uzun oluşturan parçaları birbirlerine sekans benzerliği ile tasarlanmış herhangi bir dizileri kullanılabilir, ve tekrar dizileri içermez. Kısaca, lineer DNA fragmanları (ya da PCR amplifikasyonu, ticari sentez ya da bir önceden hazırlanmış plazmidin sindirilmesi ile) inşa edilir bunlar üst üste gelen homolog dizisinin ~ 50 bp (Şekil 2) sahip olduğu şekilde. DNA fragmanlarının her birinin eş molar miktarlarda bir saat boyunca 50 ° C'de inkübe Gibson montaj karışımını ihtiva eden bir tüp içinde bir araya getirilmiş ve E dönüştürülmüştür coli. Gibson montaj protokolünden elde edilen plasmidler Sanger dizileme ile doğrulanmıştır.
Bu çalışmada üç farklı GFP organel-hedefleyen yapıları etiketsiz GFP ve GFP-etiketli Rubisco karşılaştırıldı. Konfokal mikroskopi si GFP floresan tespit etmek için kullanıldıngle hücreleri, transforme edilmiş. Kontrol deneylerinde, gözlenen geçici sentezleme (klorofil kırmızı otofloresansı ile kolayca tanımlanabilir) kloroplast, çekirdek (bir kloroplast değildir ve hücre başına sadece birine sahip büyük bir organel) korelasyon, ve / veya küçük organeller olduğuna inanılırdı peroksizomlar. Yeşil (GFP) ve kırmızı (klorofil otofloresansı) kanallar hücre içi lokalizasyonu (Şekil 3) çalışmaya örtüldü. Bu sonuçların daha ayrıntılı bir tartışma için, bizim arkadaşı makale 11 bakın lütfen.
Tahmin edildiği gibi, her üç çift hedef yapılarında, GFP overlay konfokal mikrograflar kloroplastlarda (Şekil 4) gözlemlenmiştir. TriTag-1 ve TriTag-2 hedef sitosol ve peroksizom (Şekil 4a ve 4b sırasıyla) olduğu düşünülen küçük organele de GFP. Sadece kloroplast ve peroksisom ama için TriTag-3 hedefler GFPsitosol (Şekil 4c). Sonuçların bir özeti (Şekil 5) bir diyagram olarak.
Nicotiana benthamiana diferansiyel organel ekspresyon için alternatif yapıştırma konstruktlarının Şekil 1.. Tasarımı. (A) TriTag-1 diyagramları Splice, (b) TriTag-2, ve (c) TriTag-3 non-hedefleme sekansları gösteren (gri), kloroplast hedefleme sekansları (açık yeşil), peroksizom hedefleme sekansları (portakal) ve geçici ekspresyon deneylerinde kullanılan GFP kodlama dizisi. TriTag-1 ve-2 TriTag alternatif yapıştırma yapıları oluşur; TriTag-3 kloroplast dizisinin düşük karmaşıklık bölgesi içinde gömülü bir peroksizom sinyali oluşur. Dizileri
Şekil 2, Gibson düzeneği için şematik:.. DNA fragmanlarının örtüşen montajı için yeni bir yöntem plasmid yapımı için 12,13 Gibson montaj yöntemi hızlı bir şekilde pek çok laboratuvarda geleneksel kısıtlama ligasyon klonlama yerini almaktadır. Esasen, bir çeşitli kaynaklardan elde edilen amplifiye PCR ürünleri oluşan tam olarak, ilgi konusu DNA içeren silico bir yapı tasarlayabilir. Birbirine tamamlayıcı olan primerler dizayn ve renkli primerler ile PCR fragmanının her biri-yükseltmek. Enzim karışımı ile tek bir tüp içine tüm parçaları ekleyin ve E dönüşümü coli yetkili hücreleri. l görüntülemek için buraya tıklayınArger görüntü.
Şekil 3,. Kontrol muameleleri N. içine bombardıman benthamina yaprak epidermal hücreler. (AC) Etiketsiz GFP. (a) Yeşil kanalı. Etiketlenmemiş GFP sitoplazmada karşılık gelen, çekirdekte ve hücre çevresi etrafında ifade ancak değil vakuol. (B) Kırmızı kloroplast klorofil otoflüoresanı göstermektedir. (C) Kaplama. Bu yapı, floresans olarak, çekirdek ve sadece sitosol gözlenen değil, kloroplast. (Df) Kloroplast GFP-etiketli kontrol. (D) Green kanal edilir. GFP tarif edildiği gibi bir hücre ile büyük organeller, olarak ifade edilir. (E) Red kloroplast klor Otoflöresans göstermektedirophyll. (f) Yerleşimi. Bu durumda, sarı kloroplast GFP (yeşil) kloroplasta hedeflenir belirten gözlenir. Izni 11 ile yayımlanmaktadır. resmi büyütmek için buraya tıklayın.
Şekil 4. Tri-Tag-1, 2, 3 etiketli GFP görüntüleri birleşti. (A) Tri-tag1. Bu durumda, sarı bir kloroplast çeperleri GFP kloroplasta hedeflenir belirten gözlenir. GFP da sitoplazmada hem de peroksizomlar olabilir küçük noktalı organellerde görülmektedir. (B) Tri-TAg2. Bu durumda, sarı bir kloroplast çeperleri GFP c hedef olduğunu gösteren, gözlenmektedir hloroplast. GFP da sitoplazmada hem de peroksizomlar olabilir küçük noktalı organellerde görülmektedir. (C) Tri-TAG3. Bu durumda, sarı bir kloroplast gibi peroksizomlar olabilir küçük noktasal organel olarak gözlenir. Ama GFP sitosolde gözlenmemiştir. Izni 11 ile yayımlanmaktadır. resmi büyütmek için buraya tıklayın.
Şekil 5,. Tipik tütün yaprak epidermal hücre Bölmeler. Burada göreceli boyutları ve hücre içindeki yerleri gösterildiği üzere, ve göreli ekspresyon seviyeleri konfokal mikroskopi ile gözlenir. Izni 11 ile yayımlanmaktadır./ 51234/51234fig5highres.jpg "target =" _blank "> büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu çalışmada, basit yöntemler bitkilerde çok sayıda hücresel bölümlerin, tek bir transgenik proteini lokalize için tarif edilmiştir. Amaç, Nicotiana benthamiana birden fazla organelde tek bir gen ifade edecek bir yapı tasarlamaktı. Rasyonel stratejiler GFP bazlı DNA konstruktlarının tasarımı, Gibson montaj, Gene Gun yaprak hücrelere plasmidlerin teslimat ve konfokal mikroskobu ile sonuçların gözlenmesi bulunur.
Üç farklı kısa, N-terminal etiketler 11 hedef eşzamanlı kloroplast, peroksisam ve sitosolde için tasarlanmıştır. Bu "TriTags" kloroplast artı sitoplazma 6 veya peroksisom artı sitoplazma 17 ya da kodlanmış proteinlerin doğrudan alternatif olarak eklenmiş mRNA kodlayan, doğal olarak oluşan DNAlar birleştirilmesi ile tasarlanmıştır. TriTag-3 alternatif eklenmeye bağlı olarak kullanan ve bir na bir kloroplast hedefleme sekansı oluşur etmezturally yapısal olmayan bölümü bir peroksisomal hedefleme dizisi 15,17 ile değiştirilmiştir. Nicotiana benthamiana yaprak epidermal hücrelerde GFP (Şekil 5) hedef in vivo TriTags işlevi.
Konfokal mikroskop etkili bir kloroplast, peroksisom ve sitoplazmada bu TriTag-1 ve TriTag-2 hedef GFP gösterdi, ama sırasıyla kloroplast ve peroksisom için tercih ile (Şekil 4a ve 4b). TriTag-3 hedefler kloroplasta ve peroksisom sadece GFP değil, sitosol (Şekil 4c). Toplamda, bu etiketleri süresini azaltabilir ve kaynakları kloroplastlarda ve peroksizomlarda belirli ifade ihtiyacı olanlar için, bitki metabolik mühendislik için klonlama geçirdi.
Değişiklikler ve Sorun Giderme
Gibi şu anda inşa TriTags oldukça statik. Bununla birlikte, underlyinFarklı yere özgü etiketlerin olanak sağlamak için teknoloji g, alternatif yapıştırma, esnektir. Mevcut kloroplast ve / veya peroksisom spesifik etiketleri bu salgı yolu, mitokondri, ER ikamet etiketi, vakuol olması, başka herhangi bir organel değişmiş olabilir. Bu da, vb tohumlar, çiçekler, kökler, yapraklar, saplar için, örneğin dokuya özgü promoterler ile birleştirilebilir
Böylesi biri yapıları klonlama için Gibson montaj yöntemi 12-14 gibi bir proje için idealdir. Bu, kısıtlama sitelerinin sınırlamalar olmadan herhangi bir sırada alt klonlamak için basit, güçlü bir araçtır. Bir adım reaksiyonlarda, Gibson montaj hızla klonlama az çaba ile yapıları ve kontrolleri yarattı. Gibson montaj tekniği çok uzun şablon dizileri, PCR ile amplifiye edilmesi gibi arzu edilen herhangi bir sekans için hemen hemen sonsuz bir değiştirilebilir. Bu örnekte, Gibson tertibatı, sindirilmiş plasmid ile gösterilmiştir rağmenPCR-yükselterek vektör sindirilmiş miniprep kullanarak daha iyi çalışma eğilimindedir.
Bu dergide 18,19 tarafından kurulmuştur gibi Gen Tabancası, hücrelerin geçici transfeksiyonu için bir hızlı ve etkili bir yöntemdir. Nicotiana benthamiana büyük, loplu yaprak epidermal Gene Gun ile transfeksiyon için hem de idealdir hücreleri, aynı zamanda için var konfokal mikroskobu ile gözlem. Mermi yapmak için protokolü iyi bilinmektedir. Altın, şimdiye kadar literatürde çok deneylerde bir mikro olarak kullanılmıştır, ama tungsten mikro taşıyıcılar düşük maliyetle en son mevcuttur.
Teknikleri Sınırlamalar
Gibson yöntemin bir önemli bir sınırlama, tekrarlanan sıralı varlığıdır: daha fazla üst üste binen bölge daha az yan ürün sonucudur. DpnI ile PCR ürünleri sindirim plasmid şablonu, kirletici kaldırabilir; Genellikle yan kaynağı olanürünleri. Enzimler tek şeritli içine çift kordonlu DNA dan DNA fragmanları sindirimi. DNA fragmanlarının uçlarına (~ 1 kb) yakın tekrar dizilerinin varlığı önemli ölçüde uygun olmayan rekombinasyon olasılığını arttırır. Yanı sıra, dizilerin içinde tekrarlar da bir sınırlama teşkil: Bilindiği ve T5 eksonükleaz çiğniyor tek sarmallı DNA geri ne kadar kontrol etmek zor değildir. Ekzonükleaz aktivitesi hızla yüksek bir reaksiyon sıcaklığında, sonunda denatüre enzimi (50-55 ° C) ve bu çözelti içinde genel hareket azalan viskozite ile tavlanır. Reaksiyon aşamaları, sırası ve ligasyon bağımsız klonlama (dilim) daha ince ayar için 20 tercih edilir.
Gen tabancası tekniğin önemli bir sınırlama sadece çekim olay başına 1-10 geçici olarak dönüştürülmüş hücrelerin sırasına üretmesidir.
Varolan Yöntemleri Açısından Önemi
Gibson montaj tekniği kolaylığı, esneklik ve adaptasyon için hızlı benimsenmesini keyif alıyor. Geleneksel kısıtlama / ligasyon klonlama daha hızlı bir protokoldür ve bu sınırlama sindirimi için gerekli olanlar gibi özel dizileri gerekli değildir. Bu yeniden bir araya gereken iki ya da üç fragman ile sınırlı değildir; Orijinal araştırmacılar sınırlı verim ile de olsa, 10 kadar parçalar için başarılı bir şekilde göstermiştir. Birçok araştırmacı için Gibson montaj pozitif klonların daha büyük bir sayı için yapar.
Biolistic teknikleri ile transformantlar için, ya da dönüştürülmüş kallus doku oluşturulması için, bir kabin tarzı biyolistik aygıt (örneğin BioRad PDS-1000) kullanılmasıdır kullanılmalıdır. Alternatif bir yöntem, Agrobacterium sızıntıdır.
Gelecekteki Uygulamalar
Gibson montaj için, DNA'nın büyük ve daha büyük kümeler monte edilmesini sağlarmaksimum limiti görülmemiştir noktası. Orijinal Yazarlar DNA 13 birkaç yüz kilobaz birleştirmek için kullanmıştır.
Selektif bir şekilde tek bir genetik yapısı ile çok sayıda hedef organeller yeteneği dönüştürülmüş olması gerek gen sayısını azaltmak için potansiyele sahiptir. Büyük ve daha büyük DNA parçaları (ve dolayısıyla daha büyük metabolik yolların) teslimi yakın vadeli bir hedeftir. Izoprenoit yollar biolistik yöntemlerle kloroplasta teslim edilmiştir; Bu tür alternatif karbon fiksasyonu yollar gibi diğer gen kümeleri ufukta.
Protokol kapsamında Kritik Adımlar.
Gibson montajda, şablon dizileri hedef rekombinasyon haricinde birbirine homolojiye sahip olmadığından emin olun.
Nicotiana bitkilerin biyolistik dönüşüm olarak, yaklaşık 10-15 cm yaprakların üzerindeki gen tabancası tutmak için dikkatli birnd 200-250 psi helyum basıncı tutmak. Bundan daha yakın, kırılgan yaprak patlayabilir, ve daha uzak onlar da dönüştürülmüş olmayacağını daha olacaktır. Düzgün dönüştürülmüş ise Nakilden iki gün sonra çürük yaprak üzerinde görünmelidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Yazarlar Nicotiana benthamiana fidan cömert bağış için Massachusetts Genel Hastanesi Jen Sheen teşekkür etmek istiyorum. Jen Bush bitkilerin büyüyen ve büyüme odası alanı kurma tavsiyesi bize büyük ölçüde yardımcı oldu. Wyss Enstitüsü'nden Tom Ferrante konfokal mikroskobu ile çok önemli yardım teklif etti. Yazarlar, özellikle Boston Çocuk Hastanesi'nden Don Ingber ve Gen Tabancası ve ilgili malzemeleri cömert bağış için Wyss Enstitüsü'ne teşekkür etmek istiyorum. Bu proje için finansman PAS, JCW, ve MDM Enerji İleri Araştırma Projeleri Ajansı Başkanlığı (ARPA-E Ödül # DE-000079) ile bir işbirliği anlaşması ile sağlanan ve Chimerion Biyoteknoloji, Inc aracılığıyla MJV için yapıldı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Oligonucleotide primers | IDT | (custom) | Design specifically for construct |
| GeneBlocks | IDT | (custom) | 500 bp oligonucleotides |
| ApE software | U Utah | (download) | http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/ |
| MinElute kit | Qiagen | 28004 | Used to purify PCR products |
| QIAprep spin miniprep kit | Qiagen | 27104 | Used to prepare cloning-appropriate amounts of plasmid |
| Phusion Master Mix with GC Buffer | NEB | M0532S | Used to PCR-amplify gene of interest |
| Gibson assembly reaction mix | NEB | E2611L | Master mix of the following 9 ingredients |
| 1 M Tris-HCl pH7.5 | Teknova | T1075 | Gibson assembly mix |
| 1 M MgCl2 | G Biosiences | 82023-086 | Gibson assembly mix |
| dNTP mix | Fermentas | R0192 | Gibson assembly mix |
| 1 M DTT | Fermentas | R0861 | Gibson assembly mix |
| PEG-8000 | Affymetrix | 19966 | Gibson assembly mix |
| NAD | Applichem | A1124,0005 | Gibson assembly mix |
| T5 exonuclease | Epicentre | T5E4111K | Gibson assembly mix |
| Phusion polymerase | NEB | F530S | Gibson assembly mix |
| Taq DNA ligase | NEB | M0208L | Gibson assembly mix |
| Gibthon.org | Website to simplify calculations | ||
| Plasmid PLUS Maxi kit | Qiagen | 12963 | Used to prepare DNA for gene gun bullets |
| Gene Gun system | BioRad | 165-2451 | Includes all parts necessary |
| Nicotania benthamiana | (n/a) | (n/a) | Gift of Jen Sheen, MGH |
| Confocal microscope | Leica | SP5 X MP | Imaging of resultant cells |
| Deep well slides | Electron Microscopy Sciences | 71561-01 | Used for confocal imaging |
| A Plasmid Editor (ApE) | University of Utah | http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape | |
| Gibthon:Ligation calculator | http://django.gibthon.org/tools/ligcalc/ |
References
- Que, Q., et al. Trait stacking in transgenic crops: challenges and opportunities. GM crops. 1 (4), 220-229 (2010).
- Reddy, A. S. N., Rogers, M. F., Richardson, D. N., Hamilton, M., Ben-Hur, A. Deciphering the plant splicing code: experimental and computational approaches for predicting alternative splicing and splicing regulatory elements. Frontiers in Plant Science. 3 (18), (2012).
- Hickey, S. F., et al. Transgene regulation in plants by alternative splicing of a suicide exon. Nucleic Acids Research. 40 (10), 4701-4710 (2012).
- Syed, N. H., Kalyna, M., Marquez, Y., Barta, A., Brown, J. W. S. Alternative splicing in plants - coming of age. Trends in Plant Science. 17 (10), 616-623 (2012).
- Black, D. L. Mechanisms of alternative pre-messenger RNA splicing. Annual Review of Biochemistry. 72, 291-336 (2003).
- Dinkins, R. D., et al. Changing transcriptional initiation sites and alternative 5'- and 3'-splice site selection of the first intron deploys Arabidopsis protein isoaspartyl methyltransferase2 variants to different subcellular compartments. The Plant Journal: for Cell and Molecular Biology. 55 (1), 1-13 (2008).
- Kebeish, R., et al. Chloroplastic photorespiratory bypass increases photosynthesis and biomass production in Arabidopsis thaliana. Nature Biotechnology. 25 (5), 593-599 (2007).
- Maier, A., et al. Transgenic Introduction of a Glycolate Oxidative Cycle into A. thaliana Chloroplasts Leads to Growth Improvement. Frontiers in Plant Science. 3 (38), 1-12 (2012).
- Kumar, S., et al. Remodeling the isoprenoid pathway in tobacco by expressing the cytoplasmic mevalonate pathway in chloroplasts. Metabolic Engineering. 14 (1), (2012).
- Sapir-Mir, M., et al. Peroxisomal localization of Arabidopsis isopentenyl diphosphate isomerases suggests that part of the plant isoprenoid mevalonic acid pathway is compartmentalized to peroxisomes. Plant Physiology. 148 (3), 1219-1228 (2008).
- Voges, M. J., Silver, P. A., Way, J. C., Mattozzi, M. D. Targeting a heterologous protein to multiple plant organelles via rationally designed 5' mRNA tags. Journal of Biological Engineering. 7 (20), (2013).
- Gibson, D. G. Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments. Methods in Enzymology. 498, 349-361 (2011).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 12-16 (2009).
- Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A., Venter, J. C., Merryman, C. Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome. Nature Methods. 7 (11), 901-903 (2010).
- Lowenson, J. D., Clarke, S. Recognition of D-aspartyl residues in polypeptides by the erythrocyte L-isoaspartyl/D-aspartyl protein methyltransferase. Implications for the repair hypothesis. The Journal of Biological Chemistry. 267 (9), 5985-5995 (1992).
- Lanyon-Hogg, T., Warriner, S. L., Baker, A. Getting a camel through the eye of a needle: the import of folded proteins by peroxisomes. Biology of the Cell / under the auspices of the European Cell Biology Organization. 102 (4), 245-263 (2010).
- Reumann, S., et al. Proteome analysis of Arabidopsis leaf peroxisomes reveals novel targeting peptides, metabolic pathways, and defense mechanisms. The Plant Cell. 19 (10), 3170-3193 (2007).
- Woods, G., Zito, K. Preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture. J. Vis. Exp. (12), (2008).
- Hollender, C. A., Liu, Z. Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene. (40), (2010).
- Li, M. Z., Elledge, S. J. Harnessing homologous recombination in vitro to generate recombinant DNA via SLIC. Nature Methods. 4 (3), 251-256 (2007).
