Summary
Nevronale membran menneskehandel dynamisk styrer plasma membran protein tilgjengelighet og betydelig påvirker nevrotransmisjon. Til dags dato har det vært utfordrende å måle nevronale endocytic menneskehandel i voksen nevroner. Her beskriver vi en svært effektiv, kvantitativ metode for å måle hurtige forandringer i overflateprotein ekspresjon ex vivo i akutte hjerneskiver.
Abstract
Regulert endocytic trafficking er den sentrale mekanismen tilrettelegge en rekke neuromodulatory hendelser, ved dynamisk styring reseptor, ionekanal, og transporter celleoverflaten presentasjon på en minutters tidsskala. Det er et bredt mangfold av mekanismer som styrer endocytic smugling av enkelte proteiner. Studier som undersøker de molekylære grunnlaget for menneskehandel har først og fremst stole på overflaten biotinylering å kvantitativt måle endringer i membran protein overflate uttrykk som svar på eksogene stimuli og genmanipulering. Imidlertid har denne tilnærmingen i hovedsak vært begrenset til dyrkede celler, noe som kanskje ikke trofast gjenspeiler de fysiologisk relevante mekanismer som spiller inn i voksen nevroner. Videre kan dyrkede celle tilnærminger undervurdere regionsspesifikke forskjeller i trafficking mekanismer. Her beskriver vi en tilnærming som strekker celleoverflaten biotinylering til den akutte hjernen skive forberedelse. Viviser at denne metoden gir et high-fidelity tilnærming for å måle raske endringer i membranproteinoverflatenivået hos voksne nevroner. Denne tilnærmingen er sannsynlig å ha bred nytte innen nevronale endocytic menneskehandel.
Introduction
Endocytic menneskehandel er en allestedsnærværende cellulær mekanisme som fintuner plasma membran presentasjon av en rekke integrerte membran proteiner. Endocytose gir viktige næringsstoffer til det intracellulære miljøet 1 og desensitizes reseptor signal som respons på reseptoraktivering 2.. Endocytic resirkulering tilbake til plasmamembranen kan i tillegg øke cellulær signalisering ved å øke protein uttrykk nivåer på celleoverflaten 3.. Videre er membran trafficking forstyrrelsene innblandet i en rekke sykdommer og patologiske tilstander 4,5, understreker behovet for å undersøke de molekylære mekanismer som styrer protein endocytic menneskehandel. Mens mange proteiner utnytte klassiske clathrin avhengige internalise mekanismer, monterings bevis i løpet av de siste årene viser at flere clathrin uavhengig endocytiske mekanismer styrer endocytic potensialet i et økende utvalg avproteiner 6,7. Dermed har behovet for å undersøke endocytiske mekanismer tilrettelegge menneskehandel i fysiologiske relevante systemer vokst betraktelig.
I hjernen har endocytic smugling av reseptorer, ionekanaler og nevrotransmitter transportører en primær rolle i etableringen av synaptisk plastisitet 8-11 og respons til narkotika misbruk 12-15, til syvende og sist påvirker nevronal eksitabilitet og synaptiske responser. Hittil flertallet av nevrale trafficking studier er avhengige av enten heterologe ekspresjonssystemer eller dyrkede primære nevroner, kan verken som pålitelig reflektere mekanismer som spiller inn i voksen nevroner. Her rapporterer vi en tilnærming som bruker overflaten biotinylering å kvantitativt måle overflateproteinnivåer i akutte hjernen skiver avledet fra voksne gnagere. Ved hjelp av denne tilnærmingen, presenterer vi data som viser at musen striatal dopamin transporter internalizes raskt i resom reaksjon på phorbol ester-mediert protein kinase C (PKC) aktivering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyr håndtering og vev høsting ble utført i samsvar med retningslinjene fra University of Massachusetts Medical School Institutional Animal Care bruk Committee (IACUC), etter den godkjente protokollen # A1506 (Melikian, PI).
Nødvendige løsninger
Kunstig cerebrospinalvæsken (ACSF) - Make fersk daglig
125 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,2 mM NaH 2 PO 4, 1,2 mM MgCl 2, 2,4 mM CaCl 2, 26 mM NaHCO 3, og 11 mM glukose
Merk: Forbered ACSF som en 10x stamløsning, med unntak av NaHCO3 og glukose. Gjør 1x arbeidsløsninger daglig fra 10x lager, supplere med fersk NaHCO 3 og glukose.
Sukrose-supplert ACSF (SACSF) - Make fersk daglig
250 mM lykkesrose, 2,5 mM KCl, 1,2 mM NaH 2 PO 4, 1,2 mM MgCl 2, 2,4 mM CaCl 2, 26 mM NaHCO 3, og 11 mM glukose
Merk: Forbered SACSF som en 10x stamløsning, med unntak av NaHCO3 og glukose. Gjør 1x arbeidsløsninger daglig fra 10x lager, supplere med fersk NaHCO 3 og glukose.
Sulfo-N-hydroxysuccinyl-SS-Biotin (sulfo-NHS-SS-biotin, Pierce Chemical Company)
Lager løsninger bør være 200 mg / ml i DMSO og er motstandsdyktig mot flere fryse / tine sykluser. Aliquoter blir lagret ved -20 ° C. Den succinyl ester blir raskt hydrolyseres i vandig oppløsning, slik at arbeidsløsninger bør fremstilles umiddelbart før anvendelse til skiver.
Slice Slukk Solution
ACSF supplert med 100 mM glysin
RIPA Lysis Buffer
10 mM Tris, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1,0 mM EDTA, 1% Triton-X-100, 0,1% SDS, 1% Na-deoksykolat
RIPA med proteasehemmere (RIPA / PI) - Make fersk daglig
RIPA supplert med 1 pM leupeptin, 1 mM pepstatin, 1 mM aprotinin og 1 mM fenylmetyl-sulfonyl-fluorid.
En. Forbered hjernen skiver
- Gjør frisk 1x SACSF og 1x ACSF
- Chill SACSF på is i et lite begerglass. Dette blir brukt til å holde den nyhøstet musehjerne.
- Mett ACSF og SACSF med oksygen av boblende med 95% / 5% O 2 / CO 2, 20 min på is.
- P30-38 mus brukes for optimal vevets levedyktighet. Ofre dyr ved halshugging og halshogging, og raskt fjerne hjernen til prechilled, oksygenrikt SACSF.
- Ved hjelp av en vibrerende mikrotom, gjør 300 mikrometer hjernen seksjoner i regionen av interesse.
- Om ønskelig, kan skiver bli ytterligere dissekert før utvinning å berike for bestemte områder av hjernen eller separat høyre og venstre hjernehalvdel å bruke som kontroll og eksperimentelle stykker, henholdsvis.
- Ved hjelp av en brann-polert Pasteur pipette, overføre skiver til mesh bunn kamre satt inn i 24-brønners plater.
- Tillat skiver å gjenopprette for 40 min, 31 ° C i oksygenrikt ACSF, med kontinuerlig, milde boblende.
2. Drug Treatment (eventuelt) og Slice Biotinvlerina
- Etter gjenvinning, vaskes skiver 3x i forvarmet (37 ° C) oksygenert ACSF bobler kontinuerlig med 95% / 5% O 2/2 CO.
- Legg testforbindelser og inkuber med kontinuerlig oksygentilførsel.
- For enkelthets skyld legge til en 1/10 th volum på 10x konsentrert stoffet, og bland ved å forsiktig snu.
- Rist platene forsiktig i et vannbad ved den ønskede temperatur.
- Etter behandling, rasktChill skiver ved å vaske 3x i iskald ACSF.
Tre. Biotinylere overflateproteiner
- Forbered 1,0 mg / ml sulfo-NHS-SS-biotin i iskald ACSF umiddelbart før merking.
- Til 0,75 ml sulfo-NHS-SS-biotin til skiver og stykker inkuber på is, 45 min.
- Vask skiver raskt tre ganger med iskald ACSF, deretter inkuberes i 10 min i iskaldt ACSF på is.
- Vask skiver tre ganger med iskald skive quench buffer og inkuberes med 0,75 ml skive quench buffer to ganger, 25 min, på is for å slukke gratis sulfo-NHS-SS-biotin.
4. Forbered Tissue Lysates
- Vask skiver tre ganger i iskald ACSF og overføre hver skive til en mikrosentrifuge tube ved hjelp av en brann-polert Pasteur pipette.
- Forsiktig pellet skive ved sentrifuge 200 xg, 1 min og nøye aspirer rester ACSF.
- Tilsett 400 mL iskald RIPA / PI og bryte opp vev ved pipettering opp og ned en gang gjennom en P200 pipette.
- Overføring dissosiert skive / RIPA til et friskt rør og inkuberes 30 min, 4 ° C, rotasjon, for å fullføre lyse.
- Pellet cellerester ved sentrifugering, 18 000 xg, 15 min, 4 ° C.
- Bestem lysat proteinkonsentrasjon ved hjelp av BCA protein-analyse, med bovint serumalbumin (BSA) som en standard.
5. Isoler Biotinylated Proteiner
- Optimaliser Bead / total protein ratio.
Merk: Enkelt protein uttrykk nivåer kan variere mye mellom ulike områder av hjernen. Hvis ikke alle de biotinylerte protein i en gitt mengde av vev-lysat som tas opp, er det ikke mulig å nøyaktig detektere eventuelle endringer i overflate ekspresjon. Derfor er det viktig å empirisk fastslå den optimale perle / total protein ratio for et bestemt protein / hjernen regionen før du tar fatt på en ny skive biotinylering studie.- Inkuber 25 mL streptavidin agaroseperler med økende mengdes vev lysatet (omtrentlig rekkevidde 25-200 mikrogram), og deretter fortsette som beskrevet nedenfor for binding, vasking og eluering trinn.
- Tall de resulterende immunoreaktive bånd og velger en perle / lysat forholdet i den lineære rekke binding som vil muliggjøre nøyaktig kvantifisering av enten økt eller redusert protein overflate uttrykk.
- Forbered streptavidinagarose Perler
- Bestem totalt perlevolum nødvendig for alle prøver. Forbered en tilstrekkelig perle volum for at beløpet pluss en ekstra (dvs. fire prøver på 25 mL / sample = 100 mL perler + en ekstra = 125 mL perler.
- Vortex Streptavidin perle lager og pipette ut ønsket volum. Hvis du bruker en P200 pipette, kuttet av enden av spissen for å hindre blokkering eller perle skade.
- Vask perler tre ganger i 0,5-1,0 ml RIPA / PI å fjerne konserveringsmidler, virvling etter hvert RIPA tillegg og samle perler mellom vasker ved sentrifuge 18000 xg, 1 min, på rommet temperamentperatur.
- Aspirer off buffer mellom vaskinger ved hjelp av en glass Pasteur pipette er koblet til en vakuum-kolbe. En plast P200 spiss festet til enden av glass Pasteur pipette gir bedre kontroll når aspirere. Det er ikke nødvendig å fjerne absolutt all buffer for de første to vaskinger, som det risikerer suger perler inn i pipetten. Etter den siste vask, fjerne så mye overflødig buffer som mulig uten å aspirere perlene.
- Legg RIPA / PI å bringe perler tilbake til sitt opprinnelige volum, pipettering opp og ned til resuspender. Unngå virvling på dette punktet, som perler vil holde seg til rørveggen.
- Delmengde perler inn mikrosentrifugerør ved hjelp av en P200 med spissen avskåret. Pipetter opp og ned flere ganger mellom prøvetaking for å sikre perler forblir jevnt suspendert og dispergert mellom rørene.
- Bind biotinylerte proteiner til streptavidin perler
- Fordel cellelysater til rørene inneholdende agarose-perler. For eksperimenter Whe re flere prøver blir sammenlignet, sørg for å bruke samme mengde protein for hver prøve for nøyaktige sammenligninger.
- Legg ekstra RIPA / PI å ta med til prøver til en 200 mL minimalt volum. Dette sikrer at prøvene vil blande seg hensiktsmessig i løpet av inkubasjonen og også forener proteinkonsentrasjon på tvers av prøvene.
- Plasser rørene i et rør rotator og blandes over natten ved 4 ° C.
- I separate rør, dispensere en tilsvarende av det totale lysate volum som benyttes for hver prøve. Alternativt, hvis prøven volumer er høy, en brøkdel av den totale lysat volum kan reserveres i stedet, for å imøtekomme maksimale lastevolum på SDS-PAGE-geler. Disse vil bli brukt til å normalisere den overflate uttrykk til den totale mengde protein.
- Til enten et likt volum av 2x eller 1/5 volum av 6x SDS-PAGE prøvebuffer og enten inkuber ved 4 ° C, i parallell med kuleprøver, eller lagres ved -20 ° C inntil prøvene er analysert.
- Pellet kuler ved sentrifugering 18000 x g, 2 min, ved romtemperatur.
- Aspirer supernatanten og vask perler tre ganger med 0,75 ml RIPA. For å minimere perle tap, la et lite hode volum av buffer ovenfor perler mellom hver vask. Etter den siste vask, fjerne så mye RIPA som mulig, uten å forstyrre perlen pellet.
- Elueres biotinylerte proteiner fra streptavidin perler ved å redusere disulfidbinding. Tilsett 25 pl 2x SDS-PAGE reduserende prøvebuffer, vortex godt og rotere prøver 30 minutter, romtemperatur.
Merk: Mange membranproteiner har en høy tendens til å aggregere ved kokt i SDS-PAGE prøvebuffer, alvorlig svekker deres elektroforetiske mobilitet. Hvis dette er tilfelle for proteinet blir etterforsket, unngå oppvarming prøver, og i stedet, eluert langsomt ved romtemperatur. Dersom kokende er absolutt nødvendig (for eksempel hvis et annet protein vurderes parallelt krever koking), sample buffer kan bli supplert med 2 M urea (sluttkonsentrasjon) for å minimalisere aggregering. Mens effektivt til å redusere aggregering i visse tilfeller, urea kompromisser ofte bånd skinn. - Analysere prøver av immunoblot.
- Tine totale lysatet prøver og roter parallelt med perle prøver, 30 min, romtemperatur.
- Separate proteiner på SDS-PAGE geler.
- Identifiser protein (er) av interesse ved immunoblotting.
- Vær sikker på at band blir oppdaget i den lineære område for deteksjon for riktig kvantifisering.
- For å sikre at biotinylering reagenset ikke har fått tilgang til intracellulære proteiner via skadede / kompromittert celler. Dette oppnås best ved immuno i parallell for et intracellulært protein spesifikke for den celletype som undersøkes.
- Tallbåndtetthet og beregne relative proteinoverflatetetthet som en prosent av det totale protein expression nivå.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den neuronal dopamin transportøren er internalisert i respons til aktivering av PKC i cellelinjer 16-20. Til tross for mange rapporter som viser PKC-indusert DAT overflate tap i en rekke cellelinjer og ekspresjonssystemer, har det vært vanskelig å få bekreftet dette funnet i dyrkede dopaminerge nevroner 21-23. Vi brukte mus striatum-skiver til direkte å teste om DAT internalizes som reaksjon på PKC aktivering hos voksne dopaminerge nevroner. Etter skive fremstilling, ble skiver hemisected langs midtlinjen, og skiver fra identiske fly ble behandlet ± 1 uM phorbol-myristat-13-acetat (PMA) i 30 min, 37 ° C. Skiver ble hurtig avkjølt og overflateproteiner ble biotinylert og isolert som beskrevet i protokollen. Immunoblots ble analysert for DAT, og også for tyrosin hydroksylase (TH), i parallell, for å måle om biotinylering reagens oppnådd noen intracellulær adgang i dopaminerge neuroner. Som sett iFigur 1 (øverst), har vi oppdaget at robust DAT overflate ekspresjon i mus striatum i henhold til basal (bærer-behandlede) forhold, med 81,4 ± 5,8% av totalt DAT på celleoverflaten. PKC aktivering med 1 pM PMA, 30 min, 37 ° C sunket betraktelig DAT overflate uttrykk til 60,8 ± 5,2% total DAT, som svarer til ~ 30% tap av DAT fra plasmamembranen. I motsetning til dette var bare 1,6 ± 0,4% av totalt TH biotinylert (Figur 1, nederst), i samsvar med dens intracellulære lokalisering og bekrefter at biotinylering reagens ble ekskludert fra cellen indre av dopaminerge nevroner.
Figur 1. Akutt aktivering PKC reduserer dopamin transporter overflatenivået hos voksne striatale nevroner. Mouse striatal Slice Biotinylation. Akutte mus striatum-skiver ble fremstilt som beskrevet i protokoll og ble behandlet ± 1 pM PMA, 30 min, 37 ° C. Overflate proteiner ble kovalent bundet til biotin, og ble isolert ved batch streptavidin kromatografi. Prøver gikk SDS-PAGE og immunoblotting med rotte anti-DAT og mus anti-TH antistoffer. Immunoreaktive band ble tatt med en VersaDoc CCD kamera bildebehandling stasjonen og tettheter fra metnings band ble kvantifisert ved hjelp Antall One-programvaren. Topp: Representant immunoblot viser biotinylated og total DAT og TH følge de angitte behandlingene. Bunn: Gjennomsnittlig data. Biotinylated protein signal uttrykt som% total protein ± SEM * signifikant forskjellig fra kontroll, Student t-test, p <0,03, n = 6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Til tross for lang erfaring som endocytic menneskehandel kritisk påvirker synaptiske signalering i hjernen, har det vist seg utfordrende å kvantitativt måle endringer i protein overflate uttrykk hos voksne nevroner. I dette arbeidet, rapporterer vi en pålitelig tilnærming til å merke overflateprotein ex vivo i akutte hjernen skiver. Brain slice forberedelser har en lang historie av verktøy for elektrofysiologiske opptak, som de opprettholder synaptiske forbindelser og celleviabilitet opptil timer etter tilberedningen. Videre kan slicing strategier være optimalisert for å bevare bestemte synaptiske forbindelser mellom ulike områder av hjernen av interesse.
Mye av den tidligere arbeids etterforsker nevronale protein trafficking i hjerne-avledet forberedelsene har vært avhengig primært på synaptosomer og primær dyrkede nerveceller. Den akutte skive biotinylering tilnærming metoden har flere fordeler i forhold til en av these: synaptosomer blir fysisk fjernet fra aksonet og kan ikke inneholde de nødvendige molekylære faktorer å trofast rekapitulere intakt nevronale protein trafficking. I tillegg er synaptosomale preparater ofte forurenset med membranfragmenter som kan skjev eksperimentelle resultater. Primære nevrale kulturer er vanligvis avledet fra utviklingshemmede umodne nevroner som kanskje ikke har riktig differensiert i sine modne nevronale fenotyper uttrykker cellespesifikke trafficking mekanismer. I kontrast, akutte skiver oppviser høy grad av cellelevedyktighet og er avledet fra voksne dyr. Videre kan overflaten menneskehandel sammenlignes etter in vivo molekylære manipulasjoner, for eksempel genet levering / knockdown, optogenetic neuronal stimulering / hemming, eller etter in vivo medikamentelle behandlinger eller atferds tilpasninger.
Selv om det er mange fordeler med den ex vivo slus tilnærming, er det flere begrensninger i tillegg. Akutt (noncultured) hjernen skiver ha begrenset levedyktighet og er derfor ikke egnet for kronisk medikamentelle behandlinger. Videre observerte vi at de ikke forblir levedyktig under temperaturskift eksperimenter, hvor skiver er raskt kjølt og rewarmed. Videre skiver er mest levedyktig når forberedt fra P21-P35 mus, potensielt begrense mengden av tid som i vivo behandlinger kan foretas før du utfører eksperimenter. Faktisk, ved hjelp av en høy sukrose cutting løsning, finner vi at DAT menneskehandel er mindre reproduserbart observert i skiver forberedt fra P35-P42 mus (Gabriel og Melikian, upubliserte data). Men vi observerer markant forbedret skive levedyktighet i eldre dyr ved hjelp av den modifiserte skive forberedelse som beskrevet av Zhao et al. 24 Denne tilnærmingen er et utmerket alternativ der metodiske parametere krever bruker eldre dyr (dvs.. Etter eithennes viral-mediert protein / RNA uttrykk, etablere atferd, eller kronisk in vivo medikamentelle behandlinger).
Det finnes flere andre tekniske forhold som kan påvirke den eksperimentelle utfallet. Det er absolutt nødvendig empirisk å bestemme den optimale vulsten / totalt protein-forhold er nødvendig for å fange opp alle de biotinylerte protein i en gitt mengde av total lysat protein før forsøk kvantitative eksperimenter. Dette problemet er ofte oversett, men kan være den avgjørende faktor i å kunne oppdage endringer i protein overflate uttrykk. Hvis alt det biotinylerte protein er ikke kvantitativt gjenvunnet, vil endringer i overflatenivået være enten umulig å oppdage eller unøyaktig målt. En annen variabel som kan påvirke resultatene er volumet av lysis buffer som brukes til å distansere vev skiver. Den absolutte vev masse som brukes vil avhenge av regionen av interesse under etterforskning, og vil likely kreve mer eller mindre lyseringsbuffer for å oppnå fullstendig vev solubilization. Som sådan, kan slutt lysate proteinkonsentrasjoner også varierer på tvers av hjernen. Derfor bør lysis forhold bestemmes empirisk for en gitt hjerneregion og holdt konstant mellom uavhengige eksperimenter.
Oppsummert gir vi en detaljert protokoll for måling nevronale protein trafficking i voksen nevroner bruker ex vivo akutte hjernen skiver. Utnyttelse av denne tilnærmingen vil sannsynligvis føre til en mer inngående forståelse av endocytiske menneskehandel mekanismene som ligger bak nervecellefunksjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen økonomiske interesser som er i konflikt med dette arbeidet.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert av NIH tilskudd DA15169 og DA035224 til HEM
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| sulfo NHS-SS-biotin | Pierce | 21331 | |
| Streptavidin agarose | Pierce | 20347 | |
| IgG-free, Protease-free bovine serum albumin | Sigma | A3059 | |
| Vibrating microtome sectioner | various | ||
| Shaking water bath | various | ||
| Millicell mesh-bottomed inserts (8 µm pore size) | Millipore | PI8P 012 50 | These can be washed by hand and reused |
References
- Conner, S. D., Schmid, S. L. Regulated portals of entry into the cell. Nature. 422, 37-44 (2003).
- Zastrow, M., Williams, J. T. Modulating neuromodulation by receptor membrane traffic in the endocytic pathway. Neuron. 76, 22-32 (2012).
- Leto, D., Saltiel, A. R. Regulation of glucose transport by insulin: traffic control of GLUT4. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 13, 383-396 (2012).
- Liu, Y. W., Lukiyanchuk, V., Schmid, S. L. Common membrane trafficking defects of disease-associated dynamin 2 mutations. Traffic. 12, 1620-1633 (2011).
- Li, X., DiFiglia, M. The recycling endosome and its role in neurological disorders. Prog. Neurobiol. , 127-141 (2012).
- Sandvig, K., Pust, S., Skotland, T., van Deurs, B. Clathrin-independent endocytosis: mechanisms and function. Curr. Opin. Cell Biol. 23, 413-420 (2011).
- Kumari, S., Mg, S., Mayor, S. Endocytosis unplugged: multiple ways to enter the cell. Cell Res. 20, 256-275 (2010).
- Barry, M. F., Ziff, E. B. Receptor trafficking and the plasticity of excitatory synapses. Curr. Opin. Neurobiol. 12, 279-286 (2002).
- Bredt, D. S., Nicoll, R. A. AMPA receptor trafficking at excitatory synapses. Neuron. 40, 361-379 (2003).
- Kerchner, G. A., Nicoll, R. A. Silent synapses and the emergence of a postsynaptic mechanism for LTP. Nat. Rev. Neurosci. 9, 813-825 (2008).
- Malinow, R., Malenka, R. C. AMPA receptor trafficking and synaptic plasticity. Annu. Rev. Neurosci. 25, 103-126 (2002).
- Borgland, S. L., Malenka, R. C., Bonci, A. Acute and chronic cocaine-induced potentiation of synaptic strength in the ventral tegmental area: electrophysiological and behavioral correlates in individual rats. J. Neurosci. 24, 7482-7490 (2004).
- Dong, Y., et al. Cocaine-induced potentiation of synaptic strength in dopamine neurons: Behavioral correlates in GluRA(-/-) mice. PNAS. 101, 14282-14287 (2004).
- Hyman, S. E., Malenka, R. C., Nestler, E. J. Neural mechanisms of addiction: the role of reward-related learning and memory. Annu. Rev. Neurosci. 29, 565-598 (2006).
- Thomas, M. J., Malenka, R. C. Synaptic plasticity in the mesolimbic dopamine system. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 358, 815-819 (2003).
- Sorkina, T., Hoover, B. R., Zahniser, N. R., Sorkin, A. Constitutive and protein kinase C-induced internalization of the dopamine transporter is mediated by a clathrin-dependent mechanism. Traffic. 6, 157-170 (2005).
- Holton, K. L., Loder, M. K., Melikian, H. E. Nonclassical, distinct endocytic signals dictate constitutive and PKC-regulated neurotransmitter transporter internalization. Nat. Neurosci. 8, 881-888 (2005).
- Loder, M. K., Melikian, H. E. The dopamine transporter constitutively internalizes and recycles in a protein kinase C-regulated manner in stably transfected PC12 cell lines. J. Biol. Chem. 278, 22168-22174 (2003).
- Melikian, H. E., Buckley, K. M. Membrane trafficking regulates the activity of the human dopamine transporter. J. Neurosci. 19, 7699-7710 (1999).
- Daniels, G. M., Amara, S. G. Regulated trafficking of the human dopamine transporter. Clathrin-mediated internalization and lysosomal degradation in response to phorbol esters. J. Biol. Chem. 274, 35794-35801 (1999).
- Sorkina, T., et al. RNA interference screen reveals an essential role of Nedd4-2 in dopamine transporter ubiquitination and endocytosis. J. Neurosci. 26, 8195-8205 (2006).
- Eriksen, J., et al. Visualization of dopamine transporter trafficking in live neurons by use of fluorescent cocaine analogs. J. Neurosci. 29, 6794-6808 (2009).
- Rao, A., Simmons, D., Sorkin, A. Differential subcellular distribution of endosomal compartments and the dopamine transporter in dopaminergic neurons. Mol. Cell Neurosci. 46, 148-158 (2011).
- Zhao, S., et al. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nat. Methods. 8, 745-752 (2011).
