Summary
神经元膜贩运动态控制细胞膜蛋白的可用性和显著影响神经传递。迄今为止，它已经挑战来衡量成人的神经元的神经元内吞贩运。在这里，我们描述了一个非常有效的，量化的方法来衡量在急性脑切片的表面蛋白表达体外快速变化。
Abstract
调节内吞贩运是中央机制，促进多种神经调节活动，通过动态控制在分钟时间尺度受体，离子通道和转运细胞表面呈现。还有就是控制个别蛋白质的内吞机制拐卖了广泛的多样性。研究调查贩卖人口的分子基础主要依赖于表面生物素定量测量响应外源性刺激和基因操作改变膜蛋白的表面表达。然而，这种方法已被主要限于培养的细胞，这可能不是忠实地反映在游戏中成年神经元的生理学相关的机制。此外，培养细胞的方法可能低估贩运机制特定地区的差异。在这里，我们描述了一个扩展的细胞表面生物素的急性脑片制备的方法。我们表明，该方法提供了高精确度的方法来测量在膜表面蛋白水平的快速变化在成年神经元。这种方法可能在神经元内吞贩运领域广泛的实用性。
Introduction
内吞贩运是微调的各种整合膜蛋白的细胞膜呈现一个无处不在的细胞机制。内吞作用提供重要的营养物质向细胞内环境1和麻痹受体信号响应受体激活2。内吞再循环回至质膜可以通过增加蛋白质的表达水平在细胞表面3还增强细胞信号传导。此外，膜运输扰动有牵连的许多疾病和病理条件下4,5，强调需要调查支配蛋白质内吞贩运分子机制。而许多蛋白质利用经典的网格蛋白依赖的内化机制，越来越多的证据，在过去数年证明了多个网格蛋白独立的内吞机制支配的增加数组的内吞潜在蛋白质6,7。因此，有必要探讨促进生理系统有关拐卖的内吞机制已有很大的增长。
在大脑中，受体，离子通道和神经递质转运蛋白的内吞贩运在建立突触可塑性8-11和应对滥用药物12-15，最终影响神经细胞的兴奋性和突触反应的基础性作用。两者都不迄今为止，大多数神经元拐卖的研究都依赖于异源表达系统或原代培养的神经元，可以可靠地反映在作怪成年神经元的机制。在这里，我们报告说，使用表面生物素定量测量表面蛋白水平在成年啮齿类动物源性急性脑切片的方法。使用这种方法，我们提出了证明小鼠纹状体多巴胺转运蛋白迅速内化在数据重响应对佛波酯介导的蛋白激酶C（PKC）的活化。
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Protocol
所有的动物处理和组织收获是按照美国马萨诸塞大学医学院实验动物管理使用委员会大学（IACUC）的指引进行，继批准的协议＃A1506（Melikian，PI）。
所需的解决方案
人工脑脊液（学联） -使每日新鲜
125 mM氯化钠，2.5 mM的氯化钾，1.2毫米的NaH 2 PO 4，1.2毫摩尔MgCl 2，2.4 mM的氯化钙 ，26毫米的NaHCO 3，和11毫摩尔葡萄糖
注：准备学联为10倍原液，不含碳酸氢钠和葡萄糖。每天做从10倍股票1X工作溶液，用新鲜的碳酸氢钠和葡萄糖补充。
蔗糖补充学联（SACSF） -使每日新鲜
250毫米SUC升，2.5毫米氯化钾，1.2毫米的NaH 2 PO 4，1.2毫摩尔MgCl 2，2.4 mM的氯化钙 ，26毫米的NaHCO 3，和11毫摩尔葡萄糖
注：准备SACSF为10倍的贮备液，不含碳酸氢钠和葡萄糖。每天做从10倍股票1X工作溶液，用新鲜的碳酸氢钠和葡萄糖补充。
磺基-N-羟基琥珀酰基-SS-生物素 （磺基-NHS-SS-生物素，Pierce化学公司）
储备溶液应为200 mg / ml的DMSO中，并能抵抗多种冷冻/解冻循环。等分试样贮存于-20℃。琥珀酰酯水解迅速在水溶液中，使工作液应立即应用到片前做好准备。
片淬火解决方案
ACSF补充有100mM甘氨酸
RIPA裂解BuffeŘ
的10mM Tris，pH值7.4，150 mM氯化钠，1.0毫摩尔EDTA，1％的Triton-X-100，0.1％SDS，1％脱氧胆酸盐钠
RIPA与蛋白酶抑制剂（RIPA / PI） -使每日新鲜
RIPA补充了1μM的亮肽素，1μM的胃蛋白酶抑制剂，1μM的抑肽酶和1mM苯甲基磺酰氟。
1。准备脑片
- 让新鲜的1X SACSF和1x学联
- 在一个小烧杯寒意SACSF冰上。这将被用于保持新鲜收获小鼠脑。
- 通过用95％/ 5％的O 2 / CO 2，20分钟，在冰上鼓泡饱和的ACSF和SACSF与氧气。
- P30-38的小鼠应使用最佳的组织的生存能力。牺牲动物通过颈椎脱位和断头，迅速取出大脑进入预冷，含氧SACSF。
- 用振动切片机，使感兴趣区域300μm的脑切片。
- 如果需要的话，可以将它们进一步回收前解剖以富集特定脑区域或单独的左右半球分别作为对照组和实验的切片使用。
- 用火抛光的巴斯德吸液管，转移切片网眼底套入24孔板腔。
- 允许切片恢复为40分钟，31℃，含氧学联，具有持续，温和起泡。
2。药物治疗（如适用）和生物素片
- 以下恢复，洗净切片3倍于预热（37℃），含氧学联冒泡不断与95％/ 5％O 2 / CO 2。
- 添加测试化合物，并培育具有连续充氧。
- 为方便起见，加10倍浓缩的药物一个1/10量，并通过轻轻颠倒混匀。
- 摇板轻轻地在水浴中在所需的温度。
- 继药物治疗，迅速寒意片在冰冷学联洗3次。
3。表面生物素化的蛋白质
- 准备1.0毫克/毫升的前夕标签硫代NHS-SS-生物素在冰冷的学联。
- 添加0.75毫升硫代NHS-SS-生物素片和切片孵育在冰上，45分钟。
- 用冰冷学联快速洗片三次，然后孵育在冰冰冷学联10分钟。
- 用冰冷的切片淬灭缓冲液冲洗切片3次，并培育与0.75毫升片骤冷缓冲液2次，25分钟，在冰上骤冷自由磺基-NHS-SS-生物素。
4。准备组织裂解液
- 在冰冷学联洗净切片三次，用火抛光的巴斯德吸管每片转移到离心管中。
- 轻轻离心200×g离心1分钟，小心吸出剩余学联沉淀切片。
- 加入400μl冰冷的RIPA / PI和移液器向上打破了组织，下一次通过P200的点子ETTE。
- 转移解离片/ RIPA到一个新的管和孵育30分钟，4℃，旋转，完成溶解。
- 通过离心沉淀细胞碎片，18,000×g离心，15分钟，4°C。
- 确定裂解物中的蛋白浓度使用BCA蛋白测定法，以牛血清白蛋白（BSA）作为标准。
5。分离蛋白质生物素
- 优化珠/总蛋白的比例。
注：个别蛋白表达水平可以有很大的不同在不同的脑区。除非所有的组织裂解液的一定量的生物素化的蛋白质的被捕获，这是不可能精确地检测在表面上表达的任何潜在的变化。因此，就必须根据经验确定特定蛋白质/大脑区域产生一个新的切片生物素化研究着手之前最佳珠/总蛋白比率。- 孵育25μL链亲和素琼脂糖珠的增加量组织裂解液（大致范围25-200微克），然后第继续进行如下所述的结合，洗涤和洗脱步骤。
- 量化所产生的免疫反应带，并选择绑定，这将允许增加或减少蛋白质表面表达准确定量的线性范围珠/裂解液的比例。
- 准备链霉亲和琼脂糖珠
- 确定所需的所有样品总珠体积。准备了充足的珠子体积的金额加上一个额外的（ 即 4个样品在25μL/样本= 100μL珠+一个额外= 125μL珠。
- 旋涡链霉亲珠股票和吸管出所需的音量。如果使用的是P200的移液器，切断尖底，以防止堵塞或损坏珠。
- 在0.5-1.0毫升RIPA / PI珠洗3次离心18,000×g离心1分钟以去除防腐剂，每RIPA加入后涡旋和清洗间收集珠子，在室温脾气ATURE。
- 吸过使用连接到一个保温瓶玻璃巴斯德吸管清洗之间的缓冲区。吸气时，附着在玻璃巴斯德吸管的末端的塑料P200尖提供更精细的控制。它没有必要完全除去所有的缓冲器的第2次洗涤，如它的风险珠吸进移液管。最后一次洗涤后，去除尽可能多的多余的缓冲尽量不吸珠。
- 加入RIPA / PI带来珠回到他们原来的音量，上下吹打重悬。避免涡流在这一点上，作为珠会坚持到管壁。
- 分装成小珠用P200与尖端的离心管切断。吸管向上和向下采样之间数次，以确保珠保持均匀悬浮分散管中。
- 结合生物素蛋白链亲和素磁珠
- 分发细胞裂解物，以含有的琼脂糖珠的管中。对于实验磨片再多个样品进行比较，确保使用的蛋白质相同数量的每个样品进行精确的比较。
- 添加额外的RIPA / PI带给样品200μl的最小体积。这保证了样品将在孵化过程中充分混合，也统一了整个样品的蛋白浓度。
- 放置在管的管肩和搅拌过夜，在4℃下
- 在单独的管中，分配用于每个样品的总裂解物体积的等效。另外，如果样品体积都高，总裂解物体积的一小部分可以被保留，而不是，以适应在SDS-PAGE凝胶上的最大负载量。这些将被用于归一化的表面表达的总蛋白量。
- 加2倍的任一个等于或体积的1/5体积的6倍SDS-PAGE样品缓冲液并任孵育在4℃下，在平行珠的样品，或储存在-20℃直至样品进行了分析。
- 通过离心18,000×g离心2分钟，在室温下沉淀的珠子。
- 吸上清，洗珠三次0.75毫升RIPA。为了尽量减少损失珠，留下缓冲的一个小头体积上面珠洗之间。最后一次洗涤后，除去尽可能多的RIPA尽可能不破坏珠粒料。
- 通过减少二硫键洗脱生物素蛋白链菌素的磁珠。加25μl的2×SDS-PAGE还原样品缓冲液，涡旋以及与旋转样品30分钟，室温。
注意：许多膜蛋白具有较高的聚集倾向时，在SDS-PAGE样品缓冲液煮沸，严重影响其电泳迁移率。如果这是正在研究的蛋白质的情况下，避免加热样品，相反，洗脱在室温下缓慢。如果煮沸是绝对必要的（ 例如 ，如果在平行评估的另一种蛋白，需要煮沸），SAMPLë缓冲器可以用2M尿素（终浓度）进行补充，以减少聚集。而有效地减少聚集在某些情况下，尿素往往损害带的外观。 - 通过免疫印迹分析样品。
- 解冻总裂解物样品，并旋转的同时，胎圈的样品，30分钟，室温。
- 分离的蛋白质在SDS-PAGE凝胶。
- 通过免疫印迹鉴定目的蛋白（S）。
- 可以肯定的是，乐队在检测的正确量化的线性范围检测。
- 以确保该生物素化试剂并没有通过受损/受损细胞得以进入细胞内的蛋白质。这最好是通过免疫印迹法在平行于特定于被研究的细胞类型的细胞内蛋白质来实现的。
- 量化带的密度，并计算相对蛋白质表面密度为总蛋白的表达水平的百分比。
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Representative Results
神经元的多巴胺转运蛋白被内响应于PKC活化在细胞系16-20。尽管许多报告表明在各种细胞系和表达系统的PKC诱导的DAT表面的损失，已经具有挑战性证实这一发现在培养的多巴胺能神经元21-23。我们用小鼠纹状体切片直接测试DAT是否内化响应于PKC活化在成年多巴胺能神经元。以下切片制备，切片沿着从相同平面上的中线和切片切成对半收治±1μM佛波醇肉豆蔻酸酯-13乙酸酯（PMA）处理30分钟，37℃。切片迅速冷却和表面蛋白进行生物素化，并作为议定书所述隔离。免疫印迹进行探测为DAT，同时还为酪氨酸羟化酶（TH），并联，以测量生物素化试剂是否获得了在多巴胺能神经元的细胞内的任何访问。如见于图1（ 顶部），我们发现在小鼠纹状体健壮DAT表面表达下基底（载体处理的）的条件下，总的DAT在细胞表面的81.4±5.8％。 PKC活化与1μM的PMA，30分钟，37℃下的DAT表面表达显著下降到60.8±5.2％的总的DAT，其对应于约30％的损失的DAT从质膜。相比之下，只有1.6±0.4％的总TH的生物素化（ 图1，下图），而其细胞内定位和确认该生物素化试剂被排除在多巴胺能神经元的细胞内是一致的。
图1。急性PKC活化降低成年纹状体神经元多巴胺转运体表面的水平。鼠纹状体切片生物素ylation。急性小鼠纹状体切片制备如协议描述和治疗±1微米的PMA，30分钟，37°C。表面蛋白进行共价偶联到生物素并进行分离，批次链霉亲和层析。样品进行SDS-PAGE和免疫印迹法用大鼠抗-DAT和小鼠抗TH抗体。免疫反应带被抓获来自nonsaturating带一个VersaDoc CCD相机成像站和密度，使用数量One软件定量。上图：代表免疫生物素标记的显示和总DAT和TH以下的指示处理。底部：平均数据。生物素化的蛋白质的信号表示为％总数，学生的t检验，p <0.03，N = 6蛋白±标准差*从控制显着差异。
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Discussion
尽管长期以来知识内吞贩卖大脑危重影响突触信号，它已被证明具有挑战性的定量测量在成年神经元中的变化的蛋白质的表面表达。在这项工作中，我们提出一个可靠的方法来治疗急性脑片表面标记蛋白体外 。脑片制剂有实用的电生理记录的悠久历史，因为他们保持突触连接和细胞存活率高达小时的准备后。另外，切片的策略可以进行优化，以保持各种感兴趣的大脑区域之间的特定突触连接。
许多以前的工作中脑源性准备调查神经蛋白贩运已经主要取决于突触体和原代培养的神经细胞依赖。急性切片生物素化的方式方法，无论是多届的拥有几大优势ESE：突触体在物理上与轴突删除，可能不包含所需的分子因素忠实地复述完整的神经元蛋白质运输。此外，突触的准备活动往往与污染膜碎片可能会扭曲的实验结果。初级神经细胞通常来源于可能没有适当地分化为成熟的神经细胞表型表达细胞特异性拐卖机制发育未成熟的神经元。与此相反，急性切片显示出细胞存活率高度和从成年动物而得。此外，表面可以贩卖下列体内分子操作，如基因递送/击倒，光遗传学神经刺激/抑制，或在体内的药物治疗或行为适应以下进行比较。
虽然有许多优势，以体外 s虱的方法，有几个局限性。急性（未培养）脑片具有有限的可行性，因此不适合长期的药物治疗。此外，我们观察到，它们不会在温度变化的实验中，其中条带被迅速冷却和再加热保持活力。进一步，从P21-P35小鼠制备时，可能会限制的时间， 在体内治疗之前可以进行实验所进行的金额的片为最可行的。事实上，使用高蔗糖裁剪解决方案，我们发现，DAT贩运从P35-P42小鼠（Gabriel和Melikian，未发表资料）编制少片再现观察。但是，我们观察到显着提高生存能力片在老年动物使用所描述的赵某等人 24这种方法就是方法的参数需要使用旧的动物（ 即一个很好的替代修改后的切片准备。以下企业所得税她的病毒介导的蛋白质/ RNA的表达，建立行为或慢性体内的药物治疗）。
还有一些额外的技术因素可能影响实验结果。当务之急是凭经验确定最优珠/总蛋白需要尝试定量实验之前捕获在总裂解液蛋白的一定量的所有生物素化的蛋白质的比例。这个问题经常被忽视，但可以在能够检测在蛋白质表面表达变化的决定因素。如果所有的生物素化的蛋白质是不定量回收，改变表面的水平将是要么不到或不准确计量。可能影响结果的另一变量是用于离解的组织切片的裂解缓冲液的体积。所使用的绝对组织肿块，将取决于利益被调查的地区，将likelŸ需要更多或更少的裂解缓冲液，以达到完整的组织溶解。因此，最终的裂解液蛋白浓度也各脑区有所不同。因此，裂解条件应根据经验来确定对于给定的脑部区域，并保持恒定的独立实验之间。
综上所述，我们提供了一个详细的协议，用于测量神经元蛋白质运输在成年神经元采用体外急性脑片。这种方法的使用很可能会导致一个更深入的了解所依据神经元功能的内吞贩运机制。
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Disclosures
作者没有财务利益，这项工作冲突。
Acknowledgments
这项工作是由美国国立卫生研究院资助DA15169和DA035224到下摆
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| sulfo NHS-SS-biotin | Pierce | 21331 | |
| Streptavidin agarose | Pierce | 20347 | |
| IgG-free, Protease-free bovine serum albumin | Sigma | A3059 | |
| Vibrating microtome sectioner | various | ||
| Shaking water bath | various | ||
| Millicell mesh-bottomed inserts (8 µm pore size) | Millipore | PI8P 012 50 | These can be washed by hand and reused |
References
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