Summary
סחר קרום עצבי דינמי שולט זמינה פלזמה קרום חלבון ומשמעותי עצבית משפיע. נכון להיום, זה כבר מאתגר למדוד סחר endocytic עצבי בנוירונים בוגרים. כאן אנו מתארים שיטה יעילה מאוד, כמוני למדידת שינויים מהירים בביטוי חלבון פני השטח vivo לשעבר בפרוסות מוח חריפות.
Abstract
סחר endocytic מוסדר הוא המנגנון המרכזי המאפשר מגוון רחב של אירועי neuromodulatory, על ידי השליטה באופן דינמי קולט, ערוץ יון, והצגה פני תא טרנספורטר בזמן בקנה מידה דקות. יש מגוון רחב של מנגנונים ששולטים בסחר endocytic של חלבונים בודדים. מחקרים חוקרים את הבסיס המולקולרי של סחר הסתמכו בעיקר על biotinylation פני השטח כדי למדוד באופן כמו שינויים בביטוי פני חלבון קרום בתגובה לגירויים אקסוגניים ומניפולציה גנטית. עם זאת, גישה זו הייתה מוגבלת בעיקר לתאים בתרבית, אשר לא יכול לשקף נאמנה את המנגנונים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית במשחק בנוירונים בוגרים. יתר על כן, גישות תאים בתרבית עשויות לזלזל הבדלי אזור ספציפי במנגנוני סחר בנשים. כאן, אנו מתארים את הגישה המרחיבה biotinylation פני תא להכנת פרוסה המוח החריף. אנחנולהוכיח כי שיטה זו מספקת גישה באיכות גבוהה למדידת שינויים מהירים ברמות פני חלבון קרום בנוירונים בוגרים. גישה זו עלולה להיות כלי רחב בתחום הסחר בendocytic העצבית.
Introduction
סחר endocytic הוא מנגנון סלולארי בכל מקום שמכוונן מצגת קרום הפלזמה של מגוון רחב של חלבוני קרום נפרד. אנדוציטוזה מספקת חומרים מזינים חיוניים לסביבה תאית 1 וdesensitizes איתות קולטן בתגובה לקולטן הפעלה 2. Endocytic מחזור חזרה לקרום הפלזמה יכולה בנוסף לשפר את האיתות תאית על ידי הגדלת רמות ביטוי חלבון על פני תא 3. יתר על כן, הפרעות סחר קרום הם מעורבים במספר רב של מחלות ומצבים פתולוגיים 4,5, והדגישו את הצורך לחקור את המנגנונים המולקולריים השולטים בסחר endocytic חלבון. בעוד חלבונים רבים לנצל מנגנונים קלאסיים clathrin תלוי הפנמה, הרכבה ראיות בשנים האחרונות מוכיח כי מנגנוני endocytic clathrin עצמאי מרובים לשלוט בפוטנציאל endocytic של מערך הולך וגדל שלחלבונים 6,7. לכן, הצורך לחקור את מנגנוני endocytic הקלת סחר במערכות רלוונטיות פיסיולוגיות גדל במידה ניכרת.
במוח, סחר endocytic של קולטנים, תעלות יונים ומובילי הנוירוטרנסמיטר יש תפקיד עיקרי בהקמת פלסטיות הסינפטית 8-11 ותגובה לתרופות של התעללות 12-15, סופו של דבר משפיעות על רגישות עצבית ותגובות הסינפטי. עד כה רוב מחקרי סחר עצביים להסתמך על שני מערכות ביטוי Heterologous או נוירונים בתרבית ראשוניים, אף אחד מהם עשוי באופן מהימן משקפים מנגנונים במשחק בנוירונים בוגרים. כאן אנו מדווחים גישה המשתמשת biotinylation פני השטח כדי למדוד באופן כמו רמות חלבון פני השטח בפרוסות מוח חריפות הנגזרות ממכרסמים מבוגרים. שימוש בגישה זו, אנו מציגים נתונים שמראים כי טרנספורטר דופאמין striatal העכבר במהירות מפנים מחדשsponse ל-C phorbol תיווך אסתר החלבון kinase הפעלה (PKC).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הטיפול בבעלי החיים וקצירת רקמה בוצע בהתאם להנחיות של אוניברסיטת ועדת שימוש בבעלי חיים מוסדי טיפול בית הספר לרפואה של מסצ'וסטס (IACUC), בעקבות # פרוטוקול A1506 אישר (Melikian, PI).
פתרונות נדרשים
נוזל השדרתי מלאכותי (ACSF) - הפוך טרי מדי יום
125 mM NaCl, 2.5 מ"מ KCl, 1.2 מ"מ אא 2 PO 4, 1.2 מ"מ MgCl 2, 2.4 מ"מ CaCl 2, 26 מ"מ NaHCO 3, ו11 מ"מ גלוקוז
הערה: הכן ACSF כפתרון מניות 10x, למעט NaHCO 3 וגלוקוז. הפוך את הפתרונות עובדים 1x יומי מהמניות 10x, להשלים עם גלוקוז NaHCO 3 וטרי.
ACSF-תוספת סוכרוז (SACSF) - הפוך טרי מדי יום
250 suc מ"מעלה, 2.5 מ"מ KCl, 1.2 מ"מ אא 2 PO 4, 1.2 מ"מ MgCl 2, 2.4 מ"מ CaCl 2, 26 מ"מ NaHCO 3, ו11 גלוקוז מ"מ
הערה: הכן SACSF כפתרון מניות 10x, למעט NaHCO 3 וגלוקוז. הפוך את הפתרונות עובדים 1x יומי מהמניות 10x, להשלים עם גלוקוז NaHCO 3 וטרי.
Sulfo-N-hydroxysuccinyl-SS-ביוטין (sulfo-NHS-SS-ביוטין, פירס כימיקלים)
פתרונות מניות צריכים להיות 200 מ"ג / מיליליטר בDMSO והם עמידים להקפאה / הפשרה מחזורים מרובים. Aliquots מאוחסנים ב -20 ° C. אסתר succinyl היא הידרוליזה במהירות בתמיסה מימית, ולכן צריכים להיות מוכנים פתרונות לעבוד מייד לפני הגשת בקשה לפרוסות.
פורסים להרוות פתרון
ACSF בתוספת גליצין 100 מ"מ
ריפה תמוגה Buffer
10 מ"מ טריס, 7.4 pH, 150 mM NaCl, 1.0 mM EDTA, 1% Triton-X-100, 0.1% SDS, 1% deoxycholate Na
ריפה עם מעכבי פרוטאז (ריפה / PI) - הפוך טרי מדי יום
ריפה בתוספת leupeptin 1 מיקרומטר, pepstatin 1 מיקרומטר, aprotinin 1 מיקרומטר, ופלואוריד sulfonyl 1 מ"מ phenylmethyl.
1. הכן את פרוסות המוח
- הפוך SACSF 1x הטרי ו1x ACSF
- צ'יל SACSF על קרח בכוס קטנה. זה ישמש כדי להחזיק את מוח עכבר שזה עתה נקטף.
- להרוות את ACSF וSACSF עם חמצן על ידי מבעבע עם O 95% / 5% 2/2 CO, 20 דקות על קרח.
- יש להשתמש P30-38 עכברים לכדאיות רקמות אופטימליות. להקריב בעלי חיים על ידי נקע בצוואר הרחם ועריפת ראש, ומהירות להסיר את המוח לSACSF prechilled, מחומצן.
- באמצעות microtome רוטט, להפוך 300 חלקים במוח מיקרומטר באזור של עניין.
- אם תרצה, פרוסות יכולות להיות גזורים נוספות לפני ההתאוששות להעשיר לאזורים מסוימים במוח או זכות נפרדת וההמיספרות עזבו לשימוש כבקרה ופרוסות ניסיוניות, בהתאמה.
- בעזרת פיפטה פסטר אש מלוטשת, להעביר פרוסות לרשת תחתית-תאים להגדיר ל24 גם צלחות.
- לאפשר פרוסות להתאושש במשך 40 דקות, ביום 31 במעלות צלזיוס בACSF מחומץ, עם בעבוע מתמיד, עדין.
2. טיפול תרופתי (במידת צורך) ופורסים Biotinylation
- בעקבות התאוששות, לשטוף פרוסות 3x בprewarmed (37 מעלות צלזיוס), מבעבע ACSF מחומצן עם 95% / 5% O 2 / CO 2 כל הזמן.
- הוספת תרכובות מבחן ודגירה עם חמצון מתמשך.
- לנוחיותכם, להוסיף 1/10 ה נפח של 10x תרופה מרוכזת, ומערבבים בעדינות על ידי היפוך.
- Shake צלחות בעדינות באמבט מים בטמפרטורה הרצויה.
- טיפול תרופתי שלאחר מכן, במהירותפרוסות צינה על ידי שטיפת 3x בACSF הקר כקרח.
3. משטח חלבונים Biotinylate
- הכן 1.0 מ"ג / מיליליטר sulfo-NHS-SS-ביוטין בACSF הקר קרח מייד לפני התיוג.
- הוספת 0.75 מיליליטר sulfo-NHS-SS-ביוטין לפרוסות ודגירת פרוסות על קרח, 45 דקות.
- לשטוף פרוסות שלוש פעמים במהירות עם ACSF הקר כקרח, ואז דגירה של 10 דקות בACSF קר כקרח על קרח.
- לשטוף פרוסות שלוש פעמים עם חיץ להרוות הפרוסה קר כקרח ודגירה עם 0.75 מיליליטר חיץ להרוות פרוס שתי פעמים, 25 דקות, על קרח כדי להרוות sulfo-NHS-SS-ביוטין בחינם.
4. הכן Lysates רקמות
- לשטוף פרוסות שלוש פעמים בACSF קר כקרח ולהעביר כל פרוסה לצינור microcentrifuge באמצעות פיפטה פסטר אש מלוטשת.
- בעדינות גלולה פרוסה ידי צנטריפוגה XG 200, 1 דקות וACSF זהירות לשאוב הנותר.
- להוסיף 400 ריפה / PI הקרח קר μl ולשבור את הרקמה על ידי pipetting למעלה ולמטה פעם דרך פיפס P200ette.
- העברה ניתקה פרוסה / ריפה לצינור טרי ודגירת 30 דקות, 4 ° C, מסתובבת, כדי להשלים תמוגה.
- גלולה פסולת הסלולר על ידי צנטריפוגה, 18,000 XG, 15 דקות, 4 ° C.
- קביעת ריכוזי חלבון lysate באמצעות assay חלבון BCA, עם אלבומין בסרום שור (BSA) כסטנדרט.
5. לבודד חלבונים Biotinylated
- לייעל ביד / סך הכל יחס חלבון.
הערה: רמות ביטוי חלבון בודדות יכולות להשתנות במידה רבה על פני אזורים שונים במוח. אלא אם כן כל חלבון biotinylated בכמות נתונה של lysate הרקמה הוא נתפס, לא ניתן לזהות במדויק כל שינויים אפשריים בביטוי על פני השטח. לכן, קיים הכרח לקבוע באופן אמפירי את החרוז / סך הכל יחס חלבון האופטימלי לאזור חלבון / מוח בפרט לפני היציאה על מחקר biotinylation פרוסה חדש.- דגירה 25 חרוזים agarose streptavidin μl עם כמות הולכת וגדלהים של lysate רקמות (מיקרוגרם 25-200 הטווח משוער), ולאחר מכן להמשיך כמתואר בהמשך לכריכה, שלבי כביסה וelution.
- לכמת את להקות immunoreactive וכתוצאה מכך ולבחור יחס חרוז / lysate בטווח ליניארי של מחייב שיאפשר כימות מדויק של או להגדיל או להקטין את הביטוי פני חלבון.
- הכן את חרוזים streptavidin-Agarose
- לקבוע חרוז כולל דרוש לכל דגימות נפח. הכן מספיק חרוז נפח לסכום זה ועוד אחד (כלומר 4 דגימות נוספות ב25 μl / מדגם = 100 חרוזים μl = 125 חרוזים μl נוספים + אחד.
- ורטקס מניות חרוזים Streptavidin ו פיפטה את הנפח רצוי. אם באמצעות פיפטה P200, לחתוך את הקצה של הקצה כדי למנוע נזק חסימה או חרוז.
- לשטוף חרוזים 3 פעמים ב0.5-1.0 מיליליטר ריפה / PI כדי להסיר חומרים משמרים, vortexing לאחר כל הוספת ריפה וחרוזים איסוף בין שוטף על ידי צנטריפוגה 18,000 XG, 1 דקות, ברוח חדרשבמקום.
- לשאוב את החיץ בין שוטף באמצעות פיפטה פסטר זכוכית שמחוברת לבקבוק ריק. טיפ P200 פלסטיק מצורף בסוף של הזכוכית פיפטה פסטר מספק שליטה עדינה יותר כאשר נשיפה. אין זה הכרחי כדי להסיר לחלוטין את כל המאגר לשתי שטיפות הראשונות, כפי שהוא מסתכן בחרוזי נשיפה לתוך פיפטה. לאחר לשטוף הסופי, להסיר כמה שיותר עודפי חיץ ככל האפשר בלי נשיפת חרוזים.
- הוספת ריפה / PI להביא חרוזים חזרה לנפח המקורי שלהם, pipetting למעלה ולמטה כדי resuspend. הימנע vortexing בשלב זה, כפי שחרוזים יהיו להיצמד לקיר הצינור.
- חרוזים aliquot לתוך צינורות microcentrifuge באמצעות P200 עם הקצה החתוך. פיפטה מעלה ומטה מספר פעמים בין הדגימה כדי להבטיח חרוזים להישאר באופן שווה על תנאי ופורד בין הצינורות.
- חלבוני biotinylated להיקשר streptavidin חרוזים
- הפץ lysates תא לצינורות המכילים חרוזים agarose. עבור ניסויים whe מחדש דגימות מרובות עוברות בהשוואה, הקפד להשתמש באותה הכמות של חלבון עבור כל דגימה להשוואות מדויקות.
- הוספת ריפה / PI נוסף כדי להביא לדגימות לנפח מינימאלי μl 200. זה מבטיח כי דגימות תהיה לערבב כראוי במהלך הדגירה וגם מאחדת את ריכוזי חלבון על פני דגימות.
- הנח צינורות במסובבים צינור ומערבבים לילה בשעה 4 ° C.
- בצינורות נפרדים, לוותר מקביל של סך lysate משמש עבור כל נפח דגימה. לחלופין, אם כרכי המדגם הם גבוהים, כל חלק בסך הכל lysate נפח יכול להיות שמורות במקום, כדי להתאים כרכי עומס מקסימאלי על ג'לי-SDS. אלה ישמשו כדי לנרמל את הביטוי על פני השטח לסך כמות החלבון.
- הוספה או נפח שווה של 2x או 1/5 בנפח של חיץ מדגם SDS-PAGE 6x וגם דגירה על 4 מעלות צלזיוס, במקביל לדגימות חרוז, או בחנות ב-20 ° C עד דגימות מנותחות.
- גלולה החרוזים על ידי צנטריפוגה 18,000 XG, 2 דקות, בטמפרטורת חדר.
- חרוזים לשאוב supernatant ולשטוף שלוש פעמים עם 0.75 מיליליטר ריפה. כדי להקטין את איבוד חרוז, להשאיר את הראש נפח קטן של חיץ מעל חרוזים בין שוטף. לאחר לשטוף הסופי, להסיר כמה שיותר ריפה ככל האפשר, מבלי לשבש את גלולה חרוז.
- Elute חלבוני biotinylated מחרוזי streptavidin על ידי הפחתת הצמדת דיסולפיד. הוסף 25 μl 2x-SDS צמצום חיץ מדגם, מערבולת היטב ולסובב את דגימות 30 דקות, בטמפרטורת חדר.
שים לב: יש לי חלבוני קרום רבים יש נטייה גבוהה לצבירה כאשר מבושל בחיץ מדגם SDS-PAGE, קשה לפגוע ניידות electrophoretic שלהם. אם זה במקרה של החלבון הנחקר, להימנע מחימום דגימות, ובמקום זאת, elute לאט בטמפרטורת חדר. אם רותח הוא הכרחי (למשל, אם חלבון אחר העריך במקביל דורש רתיחה), samplחיץ דואר ניתן בתוספת 2 M אוריאה (ריכוז סופי) כדי למזער את הצבירה. אמנם יעיל בהפחתת הצטברות בחלק ממקרים, אוריאה לעתים קרובות פשרות הופעות להקה. - ניתוח דגימות על ידי immunoblot.
- להפשיר כוללת דגימות lysate ולסובב במקביל לדגימות חרוז, 30 דקות, בטמפרטורת חדר.
- חלבונים נפרדים על ג'לי-SDS.
- זיהוי חלבון (ים) של עניין על ידי immunoblotting.
- הייה בטוח כי להקות מזוהות בטווח ליניארי של זיהוי לכימות נכון.
- כדי להבטיח שמגיב biotinylation לא קבל גישה לחלבונים תאיים באמצעות תאים פגועים / בסכנה. המטרה זו מושגת על ידי מיטב immunoblotting במקביל לחלבון תאיים ספציפי לסוג התא הנחקר.
- לכמת צפיפויות להקה ולחשב צפיפות פני חלבון יחסית כאחוז מרמת ביטוי חלבון בסך הכל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
טרנספורטר דופאמין העצבי הפנים בתגובה להפעלת PKC בשורות תאי 16-20. למרות דיווחים רבים הוכחת הפסדי משטח DAT-Induced PKC במגוון רחב של שורות תאים ומערכות ביטוי, זה כבר מאתגר כדי לאשר את הממצא הזה בנוירונים דופאמין בתרבית 21-23. אנחנו השתמשנו פרוסות של הסטריאטום עכבר כדי לבדוק ישירות אם DAT מפנים בתגובה להפעלת PKC בנוירונים דופאמין המבוגרים. בעקבות הכנת פרוסה, פרוסות היו התפצלו לפתע לאורך קו האמצע ופרוסות ממטוסים זהים טופלו ± 1 מיקרומטר phorbol אצטט Myristate-13 (PMA) ל30 דקות, 37 ° C. פרוסות היו במהירות מצוננות וחלבונים פני השטח היו biotinylated ומבודד כפי שתוארו בפרוטוקול. Immunoblots נבדקו עבור DAT, וגם לhydroxylase טירוזין (TH), במקביל, כדי למדוד אם מגיב biotinylation צבר כל גישה תאית בנוירונים דופאמין. כפי שניתן לראות באיור 1 (למעלה), זיהינו ביטוי משטח DAT חזק בסטריאטום עכבר תחת תנאים בסיסיים (רכב שטופלה), עם 81.4 ± 5.8% מDAT המוחלט על פני התא. הפעלת PKC עם PMA 1 מיקרומטר, 30 דקות, 37 ° C ירידה משמעותית ביטוי משטח DAT ל60.8 ± DAT הכולל 5.2%, אשר תואם ~ אובדן 30% מDAT מקרום הפלזמה. לעומת זאת, רק 1.6 ± 0.4% מTH סך הכל היה biotinylated (איור 1, למטה), עולה בקנה אחד עם הלוקליזציה תאית שלה ומאשר שמגיב biotinylation הוצא מהתא הפנימי של נוירונים דופאמין.
איור 1. הפעלת PKC חריפה מקטינה את רמות משטח טרנספורטר דופאמין בנוירונים של הסטריאטום מבוגרים. עכבר striatal פרוס ביוטיןylation. פרוסות של הסטריאטום עכבר חריפים הוכנו כמתואר בפרוטוקול וטופלו ± PMA 1 מיקרומטר, 30 דקות, 37 ° C. חלבוני פני השטח היו מצמידים קוולנטית לביוטין ובודדו על ידי כרומטוגרפיה streptavidin אצווה. דגימות עברו SDS-PAGE וimmunoblotting עם עכברוש אנטי DAT ונוגדנים נגד TH עכבר. להקות immunoreactive נתפסו עם תחנת VersaDoc CCD מצלמה הדמיה וצפיפויות מלהקות nonsaturating היו לכמת באמצעות תוכנת כמות אחת. למעלה: immunoblot נציג מוצגות DAT biotinylated והכולל וTH בעקבות הטיפולים שצוינו. תחתון: נתונים ממוצע. אות חלבון Biotinylated מבוטאת% חלבון כולל ± SEM * שונה באופן משמעותי משליטה, של הסטודנטים מבחן t, p <0.03, n = 6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
למרות ידע רב שנים שסחר endocytic ביקורתי איתות הסינפטי משפיע במוח, זה הוכיח מאתגר למדוד כמותית שינויים בביטוי פני חלבון בתאי עצב בוגרים. בעבודה זו, אנו מדווחים גישה אמינה לתייג חלבון משטח vivo לשעבר בפרוסות מוח חריפות. יש הכנות פרוסה מוח בעל היסטוריה ארוכה של שירות עבור קלטות אלקטרו, כפי שהם שומרים על קשרים סינפטיים ותא כדאיות עד שעות לאחר ההכנה שלהם. יתר על כן, יכולה להיות מותאמים אסטרטגיות חיתוך לשמר קשרים סינפטיים מסוימים בין אזורי מוח השונים של עניין.
חלק גדול מהעבודה לפני חקירת סחר חלבון עצבי בהכנות הנגזרים מוח תלוי בראש ובראשונה על synaptosomes ונוירונים בתרבית ראשוני. שיטת גישת biotinylation פרוסה חריפה מתגאה מספר יתרונות על פני כל אחד מן המז: synaptosomes יוסרו פיזי מהאקסון ואינו יכול להכיל את הגורמים מולקולריים הדרושים כדי לשחזר סחר חלבון עצבי שלם בנאמנות. בנוסף, הכנות synaptosomal לעתים קרובות מזוהמות בשברי קרום שעשוי להטות את תוצאות ניסוי. תרבויות עצביות עיקריות נובעות בדרך כלל מתא עצב התפתחותית לא בשלה כי לא יכול להיות מובחנים כראוי לפנוטיפים עצביים הבוגר שלהם להביע את מנגנוני סחר בתא ספציפי. לעומת זאת, פרוסות חריפות להפגין רמה גבוהה של כדאיות תא ונגזרות מבעלי חיים מבוגרים. יתר על כן, סחר במשטח ניתן להשוות הבא מניפולציות מולקולריות in vivo, כגון משלוח / מציאה גן, גירוי / עיכוב עצבי optogenetic, או הבא בטיפולים תרופתיים vivo או עיבודים התנהגותיות.
למרות שיש יתרונות רבים לvivo לשעבר שלכיני גישה, ישנן מספר מגבלות גם כן. יש לי פרוסות מוח חריף (noncultured) כדאיות מוגבלת ולכן הם אינם מתאימים לטיפולים תרופתיים כרוניים. יתר על כן, שמנו לב שהם לא נשארים קיימא במהלך ניסויי שינוי טמפרטורה, שבו פרוסות במהירות מצוננות ומחממים מחדש. יתר על כן, פרוסות הן מעשית ביותר כאשר הכינו מעכברי p21 ל- P35, שעלול להגביל את כמות הזמן שיכולים להתבצע בvivo טיפולים קודם לביצוע ניסויים. ואכן, באמצעות פתרון חיתוך גבוה סוכרוז, אנו מוצאים כי סחר DAT הוא ציין פחות reproducibly בפרוסות מוכנות מעכברי P35-P42 (גבריאל וMelikian, נתונים שלא פורסמו). עם זאת, אנו צופים כדאיות הפרוסה השתפרה מאוד בבעלי חיים מבוגרים יותר באמצעות הכנת פרוסה שונה כפי שתואר על ידי זאו et al. 24 גישה זו היא אלטרנטיבה מצוינת שבו פרמטרים מתודולוגיים דורשים שימוש בבעלי חיים מבוגרים (כלומר. Eit הבאביטויה בתיווך החלבון הנגיפי / RNA, התנהגויות הקמת, או כרוני בטיפולים תרופתיים vivo).
ישנם גורמים טכניים נוספים כמה שעשוי להשפיע על תוצאות הניסוי. זה הכרחי כדי לקבוע את חרוז / יחס החלבון הכולל האופטימלי הדרוש כדי ללכוד את כל חלבון biotinylated בכמות נתונה בסך הכל חלבון lysate של לפני שתנסה ניסויים כמותיים באופן אמפירי. בעיה זו היא לעתים קרובות התעלמה, אבל יכולה להיות הגורם המכריע ביכולת לזהות שינויים בביטוי פני חלבון. אם כל חלבון biotinylated לא התאוששו מבחינה כמותית, השינויים ברמות פני השטח יהיו גם בלתי ניתן לגילוי או נמדד לא מדויק. משתנה נוסף שיכול להשפיע על תוצאות הוא היקף מאגר תמוגה נהג לנתק את פרוסות הרקמה. מסת הרקמה המוחלטת בשימוש תהיה תלויה באזור של נחקרת על ריבית, ותהיה likely דורש פחות או יותר מאגר תמוגה על מנת להשיג solubilization רקמה שלם. ככזה, ריכוזי חלבון lysate סופיים עשויים גם להשתנות על פני אזורים במוח. לכן, תנאי תמוגה צריכים להיקבע באופן אמפירי לאזור במוח שניתן והמשיכו מתמיד בין ניסויים בלתי תלויים.
לסיכום, אנו מספקים פרוטוקול מפורט למדידת סחר חלבון עצבי בנוירונים בוגרים באמצעות פרוסות מוח vivo לשעבר חריפות. ניצול של גישה זו עשוי להוביל להבנה מעמיקה יותר של מנגנוני סחר endocytic העומדים בבסיס תפקוד עצבי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש המחברים אין אינטרסים כלכליים סכסוך שעם העבודה הזאת.
Acknowledgments
עבודה זו מומנה על ידי NIH מענקי DA15169 וDA035224 לHEM
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| sulfo NHS-SS-biotin | Pierce | 21331 | |
| Streptavidin agarose | Pierce | 20347 | |
| IgG-free, Protease-free bovine serum albumin | Sigma | A3059 | |
| Vibrating microtome sectioner | various | ||
| Shaking water bath | various | ||
| Millicell mesh-bottomed inserts (8 µm pore size) | Millipore | PI8P 012 50 | These can be washed by hand and reused |
References
- Conner, S. D., Schmid, S. L. Regulated portals of entry into the cell. Nature. 422, 37-44 (2003).
- Zastrow, M., Williams, J. T. Modulating neuromodulation by receptor membrane traffic in the endocytic pathway. Neuron. 76, 22-32 (2012).
- Leto, D., Saltiel, A. R. Regulation of glucose transport by insulin: traffic control of GLUT4. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 13, 383-396 (2012).
- Liu, Y. W., Lukiyanchuk, V., Schmid, S. L. Common membrane trafficking defects of disease-associated dynamin 2 mutations. Traffic. 12, 1620-1633 (2011).
- Li, X., DiFiglia, M. The recycling endosome and its role in neurological disorders. Prog. Neurobiol. , 127-141 (2012).
- Sandvig, K., Pust, S., Skotland, T., van Deurs, B. Clathrin-independent endocytosis: mechanisms and function. Curr. Opin. Cell Biol. 23, 413-420 (2011).
- Kumari, S., Mg, S., Mayor, S. Endocytosis unplugged: multiple ways to enter the cell. Cell Res. 20, 256-275 (2010).
- Barry, M. F., Ziff, E. B. Receptor trafficking and the plasticity of excitatory synapses. Curr. Opin. Neurobiol. 12, 279-286 (2002).
- Bredt, D. S., Nicoll, R. A. AMPA receptor trafficking at excitatory synapses. Neuron. 40, 361-379 (2003).
- Kerchner, G. A., Nicoll, R. A. Silent synapses and the emergence of a postsynaptic mechanism for LTP. Nat. Rev. Neurosci. 9, 813-825 (2008).
- Malinow, R., Malenka, R. C. AMPA receptor trafficking and synaptic plasticity. Annu. Rev. Neurosci. 25, 103-126 (2002).
- Borgland, S. L., Malenka, R. C., Bonci, A. Acute and chronic cocaine-induced potentiation of synaptic strength in the ventral tegmental area: electrophysiological and behavioral correlates in individual rats. J. Neurosci. 24, 7482-7490 (2004).
- Dong, Y., et al. Cocaine-induced potentiation of synaptic strength in dopamine neurons: Behavioral correlates in GluRA(-/-) mice. PNAS. 101, 14282-14287 (2004).
- Hyman, S. E., Malenka, R. C., Nestler, E. J. Neural mechanisms of addiction: the role of reward-related learning and memory. Annu. Rev. Neurosci. 29, 565-598 (2006).
- Thomas, M. J., Malenka, R. C. Synaptic plasticity in the mesolimbic dopamine system. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 358, 815-819 (2003).
- Sorkina, T., Hoover, B. R., Zahniser, N. R., Sorkin, A. Constitutive and protein kinase C-induced internalization of the dopamine transporter is mediated by a clathrin-dependent mechanism. Traffic. 6, 157-170 (2005).
- Holton, K. L., Loder, M. K., Melikian, H. E. Nonclassical, distinct endocytic signals dictate constitutive and PKC-regulated neurotransmitter transporter internalization. Nat. Neurosci. 8, 881-888 (2005).
- Loder, M. K., Melikian, H. E. The dopamine transporter constitutively internalizes and recycles in a protein kinase C-regulated manner in stably transfected PC12 cell lines. J. Biol. Chem. 278, 22168-22174 (2003).
- Melikian, H. E., Buckley, K. M. Membrane trafficking regulates the activity of the human dopamine transporter. J. Neurosci. 19, 7699-7710 (1999).
- Daniels, G. M., Amara, S. G. Regulated trafficking of the human dopamine transporter. Clathrin-mediated internalization and lysosomal degradation in response to phorbol esters. J. Biol. Chem. 274, 35794-35801 (1999).
- Sorkina, T., et al. RNA interference screen reveals an essential role of Nedd4-2 in dopamine transporter ubiquitination and endocytosis. J. Neurosci. 26, 8195-8205 (2006).
- Eriksen, J., et al. Visualization of dopamine transporter trafficking in live neurons by use of fluorescent cocaine analogs. J. Neurosci. 29, 6794-6808 (2009).
- Rao, A., Simmons, D., Sorkin, A. Differential subcellular distribution of endosomal compartments and the dopamine transporter in dopaminergic neurons. Mol. Cell Neurosci. 46, 148-158 (2011).
- Zhao, S., et al. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nat. Methods. 8, 745-752 (2011).
