Summary
Trafic membranaire neuronal contrôle dynamiquement la membrane plasmique disponibilité des protéines et un impact significatif sur la neurotransmission. À ce jour, il a été difficile de mesurer le trafic endocytose neuronale dans les neurones adultes. Ici, nous décrivons une méthode très efficace, quantitative pour mesurer les changements rapides dans l'expression des protéines de surface ex vivo dans des tranches de cerveau de courte durée.
Abstract
Traite endocytose régulée est le mécanisme central faciliter une variété d'événements de neuromodulation, en contrôlant dynamiquement récepteur, canal ionique, et le transporteur cellule présentation de surface à l'échelle minutes de temps. Il ya une grande diversité de mécanismes qui contrôlent le trafic endocytose de protéines individuelles. Les études portant sur les fondements moléculaires de la traite ont principalement invoqué biotinylation de surface à mesurer quantitativement les changements dans la protéine de membrane expression de surface en réponse à des stimuli exogènes et la manipulation génétique. Cependant, cette approche a été limitée principalement à des cellules en culture, qui peuvent ne pas refléter fidèlement les mécanismes physiologiquement pertinents en jeu dans les neurones adultes. En outre, les approches de cellules en culture peuvent sous-estimer les différences spécifiques à la région dans les mécanismes de la traite. Ici, nous décrivons une approche qui s'étend biotinylation de la surface cellulaire pour la préparation de tranches de cerveau aiguë. Nousdémontrer que cette méthode offre une approche de haute fidélité pour mesurer les changements rapides dans les niveaux de surface de la protéine de la membrane des neurones adultes. Cette approche est susceptible d'avoir une large utilité dans le domaine du trafic d'endocytose neuronale.
Introduction
Le trafic est un mécanisme d'endocytose cellulaire ubiquitaire qui affine le plasma présentation membranaire d'une variété de protéines membranaires intégrales. L'endocytose fournit des nutriments essentiels pour le milieu intracellulaire et une désensibilise la signalisation du récepteur en réponse à l'activation du récepteur 2. Endocytose recyclage en arrière de la membrane plasmatique peut en outre améliorer la signalisation cellulaire par l'augmentation des niveaux d'expression de protéines à la surface de la cellule 3. En outre, les perturbations de trafic membranaire sont impliqués dans de nombreuses maladies et conditions pathologiques 4,5, soulignant la nécessité d'étudier les mécanismes moléculaires qui gouvernent la protéine endocytose trafic. Alors que de nombreuses protéines utilisent des mécanismes d'internalisation de clathrine dépendante classiques, des preuves de montage au cours des dernières années démontre que les mécanismes d'endocytose clathrine indépendant multiples régissent le potentiel endocytose d'une gamme croissante deprotéines 6,7. Ainsi, la nécessité d'étudier les mécanismes d'endocytose facilitant la traite des systèmes physiologiques pertinentes a considérablement augmenté.
Dans le cerveau, le trafic d'endocytose des récepteurs, canaux ioniques et transporteurs de neurotransmetteurs joue un rôle primordial dans l'établissement de la plasticité synaptique 8-11 et la réponse aux drogues d'abus 12-15, en fin de compte un impact de l'excitabilité neuronale et les réponses synaptiques. À ce jour, la majorité des études de trafic neuronales compter sur des systèmes d'expression hétérologues ou neurones primaires en culture, qui ne peut refléter de façon fiable les mécanismes en jeu dans les neurones adultes. Nous rapportons ici une approche qui utilise biotinylation de surface à mesurer quantitativement les niveaux de protéines de surface dans des tranches de cerveau de courte durée provenant de rongeurs adultes. En utilisant cette approche, nous présentons des données qui démontrent que le transporteur de la dopamine du striatum de souris intériorise rapidement reréponse à phorbol ester à médiation par la protéine kinase C (PKC) activation.
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Protocol
Toutes les manipulations des animaux et la récolte de tissus a été réalisée en conformité avec les lignes directrices de l'Université de Comité institutionnel de protection des animaux Utilisez Massachusetts Medical School (IACUC), suite à l'approbation protocole # A1506 (Melikian, PI).
Solutions requises
Liquide céphalo-rachidien artificiel (ACSF) - Assurez frais tous les jours
NaCl 125 mM, KCl 2,5, 1,2 mM NaH 2 PO 4, 1,2 mM de MgCl2, 2,4 mM de CaCl2, 26 mM NaHCO 3, et 11 mM de glucose
Note: Préparer ACSF comme une solution stock de 10x, à l'exclusion de NaHCO 3 et de glucose. Faites des solutions de travail 1x tous les jours de la 10x stock, complétant avec frais glucose NaHCO 3 et.
ACSF saccharose supplémenté (SACSF) - Assurez frais tous les jours
MM succès 250s'est levé, 2,5 mM de KCl, 1,2 mM NaH 2 PO 4, 1,2 mM de MgCl2, 2,4 mM de CaCl2, 26 mM NaHCO 3, et 11 mM de glucose
Note: Préparer SACSF comme une solution stock de 10x, à l'exclusion de NaHCO 3 et de glucose. Faites des solutions de travail 1x tous les jours de la 10x stock, complétant avec frais glucose NaHCO 3 et.
Sulfo-N-hydroxysuccinyle-SS-biotine (sulfo-NHS-SS-biotine, Pierce Chemical Company)
Les solutions mères devraient être de 200 mg / ml dans le DMSO et sont résistantes à de multiples cycles de gel / dégel. Des portions aliquotes sont conservées à -20 ° C. L'ester succinyl est rapidement hydrolysé en solution aqueuse, donc les solutions de travail doit être préparée immédiatement avant l'application de tranches.
Tranche Quench Solution
ACSF supplémenté avec 100 mM de glycine
RIPA Lysis Buffer
Tris 10 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 1,0 mM, 1% de Triton-X-100, 0,1% de SDS, 1% de désoxycholate de Na
RIPA avec inhibiteurs de la protéase (RIPA / PI) - Assurez frais tous les jours
RIPA additionné de 1 pM de leupeptine, 1 pM de pepstatine, 1 uM d'aprotinine et 1 mM de fluorure de phénylméthyl sulfonyle.
Une. Préparer tranches de cerveau
- Faire SACSF 1x frais et 1x ACSF
- Réfrigérer SACSF sur la glace dans un petit bol. Ceci sera utilisé pour maintenir le cerveau de souris fraîchement récoltées.
- Saturer l'ACSF et SACSF avec de l'oxygène par barbotage avec 95% / 5% de O 2 / CO 2, 20 min sur de la glace.
- P30-38 souris doivent être utilisées pour la viabilité des tissus optimale. Sacrifier des animaux par dislocation cervicale et décapitation, et éliminer rapidement les cerveaux en prérefroidie, SACSF oxygéné.
- L'utilisation d'un microtome vibrant, faire 300 um sections du cerveau dans la région d'intérêt.
- Si vous le souhaitez, les tranches peuvent encore être disséqués avant la récupération pour enrichir certaines régions du cerveau ou droit distinct et hémisphère gauche pour les utiliser comme contrôle et tranches expérimentaux, respectivement.
- En utilisant une pipette Pasteur polie au feu, transférer tranches de filet à fond chambres prévues dans des plaques à 24 puits.
- Permettre aux tranches de récupérer pendant 40 min, 31 ° C dans l'ACSF oxygénée, avec continuelle, léger bullage.
2. Traitement de la toxicomanie (le cas échéant) et Slice Biotinylation
- Après récupération, laver tranches 3x préchauffé (37 ° C), l'ACSF oxygéné bouillonnement en permanence avec 95% / 5% O 2 / CO 2.
- Ajouter composés d'essai et incuber avec oxygénation continue.
- Pour plus de commodité, ajouter un 1/10 ème volume de 10x médicament concentré et mélanger en inversant doucement.
- Secouer doucement les plaques dans un bain d'eau à la température souhaitée.
- Suite à un traitement médicamenteux, rapidementrefroidissement des tranches de lavage 3x dans la glace ACSF froid.
3. Les protéines de surface biotinyler
- Préparer 1,0 mg / ml de sulfo-NHS-SS-biotine dans la glace ACSF froide immédiatement avant l'étiquetage.
- Ajouter 0,75 ml sulfo-NHS-SS-biotine à des tranches et des tranches incuber sur de la glace, 45 min.
- Laver les tranches trois fois rapidement avec ACSF froid de glace, puis incuber pendant 10 min dans la glace ACSF froid sur la glace.
- Laver les tranches trois fois avec un tampon tranche de refroidissement froid de glace et incuber avec 0,75 ml de tampon de refroidissement de la tranche deux fois, 25 min, sur la glace pour étancher libre sulfo-NHS-SS-biotine.
4. Préparer Lysats de tissus
- Laver les tranches trois fois dans la glace ACSF froid et transférer chaque tranche dans un tube à centrifuger à l'aide d'une pipette Pasteur polie au feu.
- Culot doucement tranche par centrifugation 200 xg, 1 min et soigneusement restant aspirer ACSF.
- Ajouter 400 ul glace froid RIPA / PI et briser le tissu par aspiration et refoulement fois par un pépin de P200ette.
- Transfert dissocié tranche / RIPA dans un nouveau tube et incuber 30 min, 4 ° C, rotation, pour compléter la lyse.
- Sédimenter les débris cellulaires par centrifugation, 18000 xg, 15 min, 4 ° C.
- Déterminer les concentrations en protéines du lysat en utilisant le dosage des protéines BCA, avec de l'albumine de sérum bovin (BSA) comme étalon.
5. Isoler biotinylés protéines
- Optimiser perle / ratio de protéine.
Remarque: Les niveaux d'expression de protéines individuelles peuvent varier considérablement selon les différentes régions du cerveau. A moins que la totalité de la protéine biotinylée dans une quantité donnée d'un lysat de tissu est capturé, il n'est pas possible de détecter avec précision les changements potentiels dans l'expression de surface. Par conséquent, il est impératif de déterminer empiriquement la perle / taux de protéines totales optimale pour une région protéine / cerveau particulier avant de se lancer sur une nouvelle étude tranche de biotinylation.- Incuber 25 billes d'agarose de streptavidine ul avec de plus en pluss de lysat de tissu (gamme approximative 25-200 pg), puis procéder comme décrit ci-dessous pour la liaison, de lavage et d'élution étapes.
- Quantifier les bandes immunoréactives résultant et choisir un rapport billes / lysat dans le domaine linéaire de la liaison qui permettra de quantifier précisément soit augmenté ou diminué expression de la protéine de surface.
- Préparer Perles streptavidine-agarose
- Déterminer le volume de billes total nécessaire pour tous les échantillons. Préparer un volume de perles suffisante pour ce montant, plus un supplémentaires (soit 4 échantillons à 25 pl / échantillon = 100 perles de pl + un supplémentaires = 125 perles ul.
- Vortex streptavidine perle actions et pipette sur désiraient volume. Si vous utilisez une pipette P200, couper l'extrémité de la pointe pour empêcher le blocage ou perle dommages.
- Lavez perles 3 fois dans 0,5-1,0 ml RIPA / PI pour éliminer les conservateurs, les vortex après chaque addition RIPA et la collecte des perles entre les lavages par centrifugation 18 000 xg, 1 min, à la salle humeurture.
- Aspirer tampon entre les lavages à l'aide d'une pipette Pasteur en verre fixé à une fiole à vide. Une pointe de P200 en plastique fixé à l'extrémité de la pipette Pasteur en verre offre un contrôle plus précis lors de l'aspiration. Il n'est pas nécessaire d'enlever absolument tout le tampon pour les deux premiers lavages, car elle risque de perles d'aspiration dans la pipette. Après le lavage final, éliminer autant que possible l'excès de tampon sans aspirer les billes.
- Ajouter RIPA / PI à apporter perles à leur volume initial, aspiration et refoulement de remettre en suspension. Évitez vortex à ce stade, comme des perles vont coller à la paroi du tube.
- perles aliquotes dans des tubes à centrifuger en utilisant un P200 avec la pointe coupée. Introduire à la pipette de haut en bas à plusieurs reprises entre le prélèvement d'assurer perles restent uniformément suspension et dispersées entre les tubes.
- Protéines biotinylées Bind pour streptavidine perles
- Distribuer des lysats de cellules dans les tubes contenant les perles d'agarose. Pour les expériences EPM re de multiples échantillons sont comparés, assurez-vous d'utiliser la même quantité de protéines pour chaque échantillon des comparaisons précises.
- Ajouter supplémentaire RIPA / PI à apporter des échantillons à un volume minimal de 200 pi. Cela assure que les échantillons se mélangent de manière adéquate lors de l'incubation et aussi unifie les concentrations de protéines dans les échantillons.
- Placer les tubes dans un dispositif de rotation de tube et mélanger pendant une nuit à 4 ° C.
- Dans des tubes séparés, délivrer un équivalent du volume de lysat total utilisé pour chaque échantillon. En variante, si les volumes d'échantillon sont élevées, une fraction du volume de lysat total peut être réservé à la place, à accommoder les volumes de charge maximales sur des gels de SDS-PAGE. Ceux-ci seront utilisés pour normaliser l'expression de surface de la quantité de protéine totale.
- Ajouter soit un volume égal de 2x ou de 1/5 volume de 6x tampon d'échantillon SDS-PAGE et soit incuber à 4 ° C, en parallèle avec les échantillons de perles, ou de conserver à -20 ° C jusqu'à ce que les échantillons sont analysés.
- Un culot de perles par centrifugation 18000 x g, 2 min, à la température ambiante.
- Aspirer le surnageant et laver perles trois fois avec 0,75 ml RIPA. Pour minimiser les pertes de perle, laissez un petit volume de la tête de tampon ci-dessus perles entre les lavages. Après le dernier lavage, éliminer autant que possible RIPA, sans perturber le culot de billes.
- Éluer les protéines biotinylées à partir de billes de streptavidine, en réduisant la liaison disulfure. Ajouter 25 pi de 2x SDS-PAGE réduisant le tampon d'échantillon, vortex et ainsi faire tourner les échantillons de 30 min, température ambiante.
Remarque: Beaucoup de protéines membranaires ont une forte tendance à s'agréger à l'ébullition dans un tampon d'échantillon SDS-PAGE, d'altérer gravement leur mobilité électrophorétique. Si cela est le cas pour la protéine objet de l'enquête, les échantillons éviter de chauffage et, à la place, éluer lentement à la température ambiante. Si l'ébullition est absolument nécessaire (par exemple, si une autre protéine évalué en parallèle nécessite ébullition), sample tampon peut être complété avec 2 M d'urée (concentration finale) afin de minimiser l'agrégation. Bien qu'ils soient efficaces dans la réduction de l'agrégation, dans certains cas, de l'urée compromet souvent les apparences de la bande. - Analyser des échantillons par immunoblot.
- Décongeler les échantillons de lysats totaux et tourner en parallèle avec des échantillons de perles, 30 min, la température ambiante.
- Protéines séparées sur des gels SDS-PAGE.
- Identifiez-protéine (s) d'intérêt par immuno.
- Assurez-vous que les bandes sont détectées dans la gamme linéaire de détection, pour la quantification adéquate.
- Pour assurer que le réactif de biotinylation n'a pas eu accès à des protéines intracellulaires par les cellules endommagées / compromis. Le mieux est accompli par immunoblot en parallèle pour une protéine intracellulaire spécifique du type de cellule à l'étude.
- Quantifier la densité de la bande et de calculer la densité relative de la surface de la protéine comme un pour cent du niveau d'expression de protéine totale.
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Representative Results
Le transporteur de la dopamine des neurones est internalisé en réponse à l'activation de la PKC dans des lignées cellulaires de 16 à 20. Malgré de nombreux rapports démontrant PKC-induites pertes de surface de DAT dans une variété de lignées cellulaires et des systèmes d'expression, il a été difficile de confirmer ce résultat dans les neurones dopaminergiques en culture de 21 à 23. Nous avons utilisé les tranches de striatum de souris pour tester directement si internalise DAT en réponse à l'activation de la PKC dans les neurones dopaminergiques adultes. Après la préparation de tranche, tranches ont été hemisected le long de la ligne médiane et les tranches de plans identiques ont été traités ± 1 uM phorbol myristate-13 acétate (PMA) pendant 30 min, 37 ° C Les tranches ont été rapidement refroidis et protéines de surface ont été biotinylés et isolés comme décrit dans le Protocole. Des immunotransferts ont été sondés pour DAT, et également pour la tyrosine hydroxylase (TH), en parallèle, pour déterminer si le réactif de biotinylation passe tout accès intracellulaire dans les neurones dopaminergiques. Comme on le voitFigure 1 (en haut), nous détectée robuste DAT expression de surface dans le striatum de souris sous base de conditions (traités avec le véhicule), avec 81,4 ± 5,8% des DAT totale à la surface de la cellule. l'activation de la PKC avec 1 uM de PMA, 30 min, 37 ° C a diminué de manière significative l'expression de surface DAT à 60,8 ± 5,2% au total DAT, ce qui correspond à une perte ~ 30% de DAT à partir de la membrane plasmique. En revanche, seulement 1,6 ± 0,4% du total TH a été biotinylé (Figure 1, bas), conformément à sa localisation intracellulaire et qui confirme que le réactif de biotinylation a été exclu de l'intérieur des cellules des neurones dopaminergiques.
Figure 1. Activation de la PKC aiguë diminue transporteur de la dopamine niveaux de surface dans les neurones du striatum adultes. Souris Striatale Slice biotineylation. Tranches striatales aiguë de la souris ont été préparés comme décrit dans le protocole et ont été traités ± 1 uM de PMA, 30 min, 37 ° C. les protéines de surface ont été couplés de manière covalente à de la biotine et sont isolés par Chromatographie sur de la streptavidine par lots. Les échantillons ont subi une SDS-PAGE et immunoblot avec des anticorps de rat anti-DAT et les anticorps anti-TH de souris. Les bandes immunoréactives ont été capturés avec une station d'imagerie CCD de la caméra VersaDoc et les densités de bandes nonsaturating ont été quantifiés en utilisant un logiciel Quantité. Top: immunoblot Représentant afficher biotinylé et totale DAT et TH suivant les traitements indiqués. Conclusion: Les données moyennes. Signal de la protéine biotinylé exprimée en% des protéines totales ± SEM * significativement différent du témoin, le test t de Student, p <0,03, n = 6.
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Discussion
Malgré la connaissance de longue date que le trafic endocytose critique impacts de signalisation synaptique dans le cerveau, il s'est avéré difficile de mesurer quantitativement les changements dans l'expression des protéines de surface des neurones adultes. Dans ce travail, nous rapportons une approche fiable pour étiqueter la protéine de surface ex vivo dans des tranches de cerveau de courte durée. préparations de tranches de cerveau ont une longue histoire d'utilité pour les enregistrements électrophysiologiques, qu'ils maintiennent des connexions synaptiques et la viabilité des cellules à des heures après leur préparation. De plus, les stratégies de tranchage peut être optimisé afin de préserver connexions synaptiques spécifiques entre les diverses régions du cerveau d'intérêt.
La plupart des travaux avant enquêter sur le trafic de la protéine neuronale dans les préparations de dérivés du cerveau a dépendu principalement de synaptosomes et les neurones en culture primaire. La méthode tranche d'approche de biotinylation aiguë possède plusieurs avantages par rapport à l'une des eese: synaptosomes sont physiquement retirés de l'axone et ne peuvent pas contenir les facteurs moléculaires nécessaires reproduire fidèlement intact neuronale trafic des protéines. En outre, les préparations synaptosomales sont souvent contaminés par des fragments de membranes qui peuvent fausser les résultats expérimentaux. Cultures primaires de neurones sont typiquement dérivés de neurones immatures de développement qui peuvent ne pas avoir convenablement différenciés dans leurs phénotypes neuronaux matures exprimant mécanismes de trafic spécifiques des cellules. En revanche, les tranches aiguës présentent un haut degré de viabilité des cellules et sont issus d'animaux adultes. En outre, le trafic de surface peut être comparé suivante manipulations moléculaires in vivo, comme gène livraison / knockdown, optogenetic neuronale stimulation / inhibition, ou à la suite de traitements médicamenteux in vivo ou adaptations comportementales.
Bien qu'il existe de nombreux avantages à l'ex vivo spoux approche, il existe plusieurs limitations. Aiguë (noncultured) des tranches de cerveau ont une viabilité limitée et ne conviennent donc pas pour des traitements chroniques de drogues. En outre, nous avons observé qu'ils ne restent pas viable au cours des expériences de changement de température, où les tranches sont rapidement refroidis et réchauffés. En outre, les tranches sont plus viable quand il est préparé à partir de souris P21-P35, qui peut limiter la quantité de temps que les traitements in vivo peuvent être réalisées avant d'effectuer les expériences. En effet, en utilisant une solution de haute saccharose coupe, nous constatons que le trafic est moins DAT reproductible observé en tranches préparées à partir de souris P35-P42 (Gabriel et Melikian, données inédites). Cependant, on observe nettement amélioré la viabilité de la tranche des animaux plus âgés en utilisant la préparation de tranche modifié tel que décrit par Zhao et al. 24 Cette approche est une excellente alternative où les paramètres méthodologiques nécessitent l'utilisation d'animaux plus âgés (c.. Eit suivanteson expression à médiation virale protéine / ARN, établissant des comportements, ou chronique dans les traitements médicamenteux in vivo).
Il ya plusieurs facteurs techniques supplémentaires qui peuvent influencer les résultats expérimentaux. Il est impératif de déterminer empiriquement le bourrelet / taux de protéine totale optimale nécessaire pour capturer la totalité de la protéine biotinylée dans une quantité donnée de protéine de lysat totale avant de tenter des expériences quantitatives. Ce problème est souvent négligé, mais peut être le facteur décisif dans la capacité de détecter des changements dans l'expression des protéines de surface. Si la totalité de la protéine biotinylé n'est pas récupérée quantitativement, les changements dans les niveaux de surface seront soit indétectable ou mal mesurée. Une autre variable qui pourrait influer sur les résultats est le volume de tampon de lyse utilisé pour dissocier les tranches de tissu. La masse de tissu absolue utilisée dépendra de la région d'intérêt à l'étude, et likely nécessitent plus ou moins un tampon de lyse afin de réaliser la solubilisation complète des tissus. En tant que tel, des concentrations finales de protéines de lysat peut aussi varier entre les régions du cerveau. Par conséquent, les conditions de lyse doivent être déterminées de manière empirique pour une région donnée du cerveau et maintenus constants entre les expériences indépendantes.
En résumé, nous fournissons un protocole détaillé pour mesurer le trafic de protéine neuronale dans les neurones adultes utilisant des tranches de cerveau ex vivo aigus. L'utilisation de cette approche est susceptible de conduire à une compréhension plus approfondie des mécanismes de la traite d'endocytose qui sous-tendent la fonction neuronale.
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Disclosures
Les auteurs n'ont aucun intérêt financier en conflit avec ce travail.
Acknowledgments
Ce travail a été financé par le NIH subventions DA15169 et DA035224 à HEM
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| sulfo NHS-SS-biotin | Pierce | 21331 | |
| Streptavidin agarose | Pierce | 20347 | |
| IgG-free, Protease-free bovine serum albumin | Sigma | A3059 | |
| Vibrating microtome sectioner | various | ||
| Shaking water bath | various | ||
| Millicell mesh-bottomed inserts (8 µm pore size) | Millipore | PI8P 012 50 | These can be washed by hand and reused |
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