Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Brain Slice Biotinylering: En doi: 10.3791/51240 Published: April 3, 2014

Summary

Neuronal membran menneskehandel dynamisk styrer plasmamembranprotein tilgængelighed og markant indvirkning neurotransmission. Til dato har det været en udfordring at måle neuronal endocytisk handel med voksne neuroner. Her beskriver vi en meget effektiv, kvantitativ metode til måling af hurtige ændringer i overfladeprotein ekspression ex vivo i akutte hjernesnit.

Abstract

Reguleret endocytisk menneskehandel er den centrale mekanisme letter en række neuromodulatory begivenheder, ved dynamisk styring af receptoren, ionkanal, og transportør celleoverfladen præsentation på et minut tidsskala. Der er en bred mangfoldighed af mekanismer, der styrer endocytisk handel med enkelte proteiner. Studier, der undersøger de molekylære fundament for menneskehandel har primært påberåbes overflade biotinyleringen til kvantitativ måling af ændringer i membran-protein overflade udtryk som reaktion på eksogene stimuli og genmanipulation. Imidlertid har denne tilgang hovedsagelig været begrænset til dyrkede celler, som måske ikke et retvisende billede af fysiologisk relevante mekanismer på spil i voksne neuroner. Desuden kan dyrkede celle tilgange undervurdere regionsspecifikke forskelle i mekanismerne smuglerruter. Her beskriver vi en fremgangsmåde, der strækker celleoverflade biotinylering den akutte hjernesnit forberedelse. Vipåvise, at denne metode giver et high-fidelity tilgang til måling af hurtige ændringer i membran protein overflade niveauer i voksne neuroner. Denne tilgang vil sandsynligvis have bred anvendelighed inden for neuronale endocytisk menneskehandel.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Endocytisk menneskehandel er en allestedsnærværende cellulære mekanisme, der finjusterer plasmamembranen præsentationen af ​​en række integrerede membranproteiner. Endocytose leverer vigtige næringsstoffer til det intracellulære miljø 1 og desensibiliserer receptor signalering som respons på receptor-aktivering 2. Endocytic genbrug tilbage til plasmamembranen kan desuden forbedre cellulær signalering ved at øge protein-ekspressionsniveauer på celleoverfladen 3. Desuden er forstyrrelser membran trafficking impliceret i talrige sygdomme og patologiske tilstande 4,5, understreger behovet for at undersøge de molekylære mekanismer, der styrer protein endocytic menneskehandel. Mens mange proteiner udnytte klassiske clathrin-afhængige internalisering mekanismer, montering beviser i løbet af de sidste mange år, viser, at flere clathrin-uafhængig endocytiske mekanismer regulerer endocytiske potentiale et stigende udbud afproteiner 6,7. Således har behovet for at undersøge endocytiske mekanismer, der letter handel med fysiologiske relevante systemer vokset betydeligt.

I hjernen endocytiske handel med receptorer, ionkanaler og neurotransmitter transportere har en primær rolle i etableringen af synaptisk plasticitet 8-11 og reaktion på misbrugsstoffer 12-15, i sidste ende påvirker neuronal excitabilitet og synaptiske reaktioner. Til dato hovedparten af ​​undersøgelserne neuronale menneskehandel stole på enten heterolog ekspression systemer eller dyrkede primære neuroner, kan hverken som pålideligt afspejle mekanismer på spil i voksne neuroner. Her rapporterer vi en tilgang, der bruger overflade biotinyleringen til kvantitativ måling af overflade protein niveauer i akut hjernen skiver stammer fra voksne gnavere. Ved hjælp af denne fremgangsmåde, vi præsenterer data, der viser, at musen striatale dopamin-transporteren hurtigt internaliserer i respons at phorbolester-medierede proteinkinase C (PKC) aktivering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alle dyr håndtering og væv høst blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne fra University of Massachusetts Medical School Institutional Animal Care Brug Komité (IACUC), efter den godkendte protokol # A1506 (Melikian, PI).

Krævede løsninger

Kunstig cerebrospinalvæske (ACSF) - Lav frisk hver dag

125 mM NaCl, 2,5 mM KCI, 1,2 mM NaH 2PO 4, 1,2 mM MgCl2, 2,4 mM CaCl2, 26 mM NaHCO3, og 11 mM glucose

Bemærk: Forbered ACSF som en 10x stamopløsning eksklusive NaHCO3 og glucose. Sørg 1x arbejder løsninger dagligt fra 10x bestand, supplere med frisk NaHCO3 og glucose.

Saccharose-suppleret ACSF (SACSF) - Lav frisk hver dag

250 mM sucrose, 2,5 mM KCI, 1,2 mM NaH 2PO 4, 1,2 mM MgCl2, 2,4 mM CaCl2, 26 mM NaHCO3 og 11 mM glucose

Bemærk: Forbered SACSF som en 10x stamopløsning eksklusive NaHCO3 og glucose. Sørg 1x arbejder løsninger dagligt fra 10x bestand, supplere med frisk NaHCO3 og glucose.

Sulfo-N-hydroxysuccinyl-SS-Biotin (sulfo-NHS-SS-biotin, Pierce Chemical Company)

Stamopløsninger bør være 200 mg / ml i DMSO og er resistente over for flere fryse / optøningscykler. Alikvoter opbevaret ved -20 ° C. Den succinyl ester hydrolyseres hurtigt i vandig opløsning, så arbejder opløsninger skal tilberedes umiddelbart forud for anvendelsen til skiver.

Slice dæmpning Solution

ACSF suppleret med 100 mM glycin

RIPA Lysis Buffer

10 mM Tris, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1,0 mM EDTA, 1% Triton-X-100, 0,1% SDS, 1% Na-deoxycholat

RIPA med proteasehæmmere (RIPA / PI) - Lav frisk hver dag

RIPA suppleret med 1 uM leupeptin, 1 uM pepstatin, 1 pM aprotinin og 1 mM phenylmethylsulfonylfluorid.

1.. Forbered hjerneskiver

  1. Gøre frisk 1x SACSF og 1x ACSF
  2. Chill SACSF på is i et lille bæger. Dette vil blive brugt til at holde frisk høstet musehjerne.
  3. Mætte ACSF og SACSF med ilt ved at boble med 95% / 5% O 2 / CO 2, 20 minutter på is.
  4. P30-38 mus bør anvendes til optimal vævslevedygtighed. Sacrifice dyrene ved cervikal dislokation og halshugning, og hurtigt fjerne hjerner i forud afkølet, iltet SACSF.
  5. Ved hjælp af en vibrerende mikrotom, gør 300 um hjerne sektioner i region af interesse.
  6. Hvis det ønskes, kan skiver yderligere dissekeres forud for nyttiggørelse at berige for bestemte områder af hjernen eller separate venstre og højre hjernehalvdel til at bruge som kontrol og eksperimentelle skiver, hhv.
  7. Ved hjælp af en brand-poleret Pasteur pipette skiver til mesh rundbundede kamre sat i 24-brønds plader.
  8. Tillad udsnit til at komme sig i 40 min, 31 ° C i oxygeneret ACSF ved kontinuerlig, blid bobling.

2. Drug Treatment (eventuelt) og Slice Biotinylering

  1. Efter genvinding, vask skiver 3x i forvarmet (37 ° C), iltet ACSF boblende konstant med 95% / 5% O 2 / CO 2.
  2. Tilføj testforbindelser og inkuberes med kontinuerlig iltning.
    1. For nemheds skyld, tilføje en 1/10 th volumen 10x koncentreret stof, og der blandes ved forsigtigt at vende.
    2. Ryst pladerne forsigtigt i et vandbad ved den ønskede temperatur.
  3. Efter lægemiddelbehandling hurtigtchill skiver ved vask 3x i iskold ACSF.

3. Biotinylere overfladeproteiner

  1. Klargør 1,0 mg / ml sulfo-NHS-SS-biotin i iskold ACSF umiddelbart før mærkning.
  2. Tilføj 0,75 ml sulfo-NHS-SS-biotin til skiver og inkuberes skiver på is, 45 min.
  3. Vask skiver tre gange hurtigt med iskold ACSF, derefter inkuberes i 10 minutter i iskold ACSF på is.
  4. Vask skiver tre gange med iskold skive Dæmpningen buffer og inkuberes med 0,75 ml skive Dæmpningen buffer to gange, 25 min, på is til at slukke gratis sulfo-NHS-SS-biotin.

4.. Forbered Tissue Lysater

  1. Vask skiver tre gange i iskold ACSF og overføre hver skive til en mikrocentrifugerør ved hjælp af en brand-poleret Pasteur pipette.
  2. Bundfælde Forsigtigt skive ved centrifugering 200 xg, 1 min og omhyggeligt aspirer resterende ACSF.
  3. Tilsæt 400 pi iskold RIPA / PI og bryde op væv ved pipettering op og ned en gang gennem et P200 pipette.
  4. Overførsel dissocieret skive / RIPA til et frisk rør og inkuberes 30 minutter, 4 ° C, rotation for at fuldføre lysis.
  5. Pelletere cellulært debris ved centrifugering, 18.000 xg, 15 min, 4 ° C.
  6. Bestem lysat proteinkoncentrationer anvendelse af BCA-protein-assay med bovint serumalbumin (BSA) som standard.

5.. Isoler Biotinylerede Proteiner

  1. Optimer Bead / total protein-forholdet.
    Bemærk: Individuelle proteinekspressionsniveauer kan variere meget på tværs af forskellige områder i hjernen. Medmindre alle biotinyleret protein i en given mængde væv lysat er fanget, er det ikke muligt præcist at påvise eventuelle ændringer i overfladen udtryk. Derfor er det bydende nødvendigt at empirisk bestemme den optimale perle / total protein-forholdet for et bestemt protein / område af hjernen, før man indlader sig på en ny skive biotinylering undersøgelse.
    1. Inkuber 25 pi streptavidin agaroseperler med stigende mængdes væv lysat (omtrent 25-200 ug), og fortsæt derefter som beskrevet nedenfor for binding, vask og eluering trin.
    2. Måle den immunreaktive bånd og vælge en perle / lysat-forhold i det lineære område af binding, der vil tillade nøjagtig kvantificering af enten øget eller nedsat proteinet overfladeekspression.
  2. Forbered Streptavidin-agaroseperler
    1. Bestem den samlede perlevolumen nødvendig for alle prøver. Forbered en tilstrækkelig perlevolumen for dette beløb plus en ekstra (dvs. 4 prøver på 25 gl / prøve = 100 ul perler + en ekstra = 125 gl perler.
    2. Vortex Streptavidin perle materiel og pipette ud ønskede volumen. Hvis du bruger en P200 pipette afbrød ende af spidsen for at forhindre blokering eller perle skader.
    3. Vask perler 3 gange i 0,5-1,0 ml RIPA / PI at fjerne konserveringsmidler, vortex efter hver RIPA tilsætning og indsamle perler mellem hver vask ved centrifugering 18.000 xg, 1 min, ved stuetemperatur temperamentperaturen.
    4. Aspirer off buffer mellem vask ved hjælp af en glas Pasteur-pipette fastgjort til en vakuumkolbe. En plastik P200 spids fastgjort til enden af ​​glasset Pasteur-pipette giver finere kontrol, når sugning. Det er ikke nødvendigt at fjerne absolut alle bufferen for de to første vask, da det risikerer at aspirere perler ind i pipetten. Efter den sidste vask fjerne så meget overskydende buffer som muligt uden at aspirere perlerne.
    5. Tilføj RIPA / PI at bringe perler tilbage til deres oprindelige volumen, pipettering op og ned til resuspender. Undgå vortex på dette punkt, da perler vil holde sig til rørvæggen.
    6. Alikvote perler ind mikrocentrifugerør ved hjælp af en P200 med spidsen afskåret. Pipette op og ned flere gange mellem prøvetagning at forsikre perler forbliver jævnt suspenderet og spredt blandt rørene.
  3. Binder biotinylerede proteiner streptavidinperler
    1. Fordel cellelysater til rørene indeholdende agaroseperlerne. Til forsøg whe re flere prøver som sammenlignes, sørg for at bruge den samme mængde protein for hver prøve for præcise sammenligninger.
    2. Tilføj yderligere RIPA / PI at bringe prøverne til en 200 gl minimal volumen. Dette sikrer, at prøver vil blande tilstrækkeligt under inkubationen, og også forener proteinkoncentrationer over prøverne.
    3. Rørene anbringes i et rør rotator og blandes natten over ved 4 ° C.
    4. I separate rør, dispensere en ækvivalent af den samlede lysat anvendte volumen for hver prøve. Alternativt, hvis prøvevolumener er høje, en brøkdel af den samlede lysat volumen kan reserveres i stedet, for at imødekomme maksimal belastning mængderne på SDS-PAGE-geler. Disse vil blive anvendt til at normalisere overfladen udtryk for den samlede proteinmængde.
    5. Enten tilføje et tilsvarende volumen 2x eller 1/5 volumen 6x SDS-PAGE-prøvebuffer og enten inkuberes ved 4 ° C, parallelt med perle prøver, eller opbevares ved -20 ° C, indtil prøverne analyseres.
ove_title "> 6. Elute og analysere prøver

  1. Pelletere perlerne ved centrifugering 18.000 x g, 2 minutter ved stuetemperatur.
  2. Aspirer supernatanten og vaske perler tre gange med 0,75 ml RIPA. For at minimere tab af perler, efterlade en lille hoved volumen buffer over perler mellem hver vask. Efter den sidste vask fjerne så meget RIPA som muligt, uden at forstyrre perlen pellet.
  3. Eluere biotinylerede proteiner fra streptavidinkugler ved at reducere disulfid-binding. Tilsæt 25 pi 2x SDS-PAGE reducerende prøvebuffer vortex godt og rotere prøver 30 min, stuetemperatur.
    Bemærk: Mange membranproteiner har en høj tendens til at aggregere, når kogt i SDS-PAGE prøvebuffer, alvorligt svække deres elektroforetiske mobilitet. Hvis dette er tilfældet for det protein, der undersøges, undgå opvarmning af prøver, og i stedet elueres langsomt ved stuetemperatur. Hvis kogning er absolut nødvendigt (fx hvis et andet protein vurderes parallelt kræver kogning), sample puffer kan suppleres med 2 M urinstof (slutkoncentration) for at minimere aggregering. Mens effektiv til at reducere aggregation i nogle tilfælde, urinstof ofte kompromiser band udseende.
  4. Analysere prøver af immunoblot.
  5. Tø samlede lysatprøver og rotere parallelt med perle prøver, 30 min, stuetemperatur.
  6. Separate proteiner på SDS-PAGE-geler.
  7. Identificer protein (r) af interesse ved immunoblotting.
    1. Vær sikker på, at båndene bliver afsløret i det lineære område for afsløring for korrekt kvantificering.
    2. For at sikre, at biotinyleringsreagens ikke har fået adgang til intracellulære proteiner via beskadigede / kompromitteret celler. Dette opnås bedst ved immunoblotting sideløbende i et intracellulært protein specifik celletype, der undersøges.
    3. Kvantificere band tætheder og beregne relative proteinkoncentration overfladedensitet som en procent af det totale protein ekspressionsniveauet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Neuronal dopamin-transporteren internaliseres reaktion på PKC-aktivering i cellelinier 16-20. Trods mange rapporter, som viser PKC-induceret tab DAT overflade i en række forskellige cellelinjer og ekspressionssystemer, har det været en udfordring at bekræfte dette fund i dyrkede dopaminerge neuroner 21-23. Vi anvendte mus striatale skiver direkte teste, om DAT internaliserer reaktion på PKC-aktivering hos voksne dopaminerge neuroner. Efter skive udarbejdelse, skiver hemisected langs midterlinien og skiver fra identiske fly blev behandlet ± 1 pM phorbol myristat-13-acetat (PMA) i 30 min, 37 ° C. Skiver var hurtigt kølet og overfladeproteiner blev biotinyleret og isoleret som beskrevet i protokollen. Immunoblots probedes for DAT, og også for tyrosinhydroxylase (TH) sideløbende at måle, om biotinyleringsreagens opnået nogen intracellulær adgang i dopaminerge neuroner. Som det ses iFigur 1 (øverst), vi opdaget robust DAT overflade udtryk i mus striatum under basal (bærerbehandlede) betingelser, med 81,4 ± 5,8% af den samlede DAT på celleoverfladen. PKC-aktivering med 1 uM PMA, 30 min, 37 ° C faldt betydeligt DAT overfladeekspression til 60,8 ± 5,2% total DAT, hvilket svarer til ~ 30% tab af DAT fra plasmamembranen. I modsætning hertil var kun 1,6 ± 0,4% af den samlede TH biotinyleret (figur 1, nederst), i overensstemmelse med dens intracellulære lokalisering og bekræfter, at biotinyleringsreagens blev udelukket fra cellens indre af dopaminerge neuroner.

Figur 1
Figur 1. Akut PKC-aktivering reducerer dopamin-transporteren overflade niveauer i voksne striatalneuroner. Mouse Striatal Slice Biotinylation. Akutte mus striatale skiver blev fremstillet som beskrevet i protokol og blev behandlet ± 1 uM PMA, 30 min, 37 ° C. Overfladeproteiner blev kovalent koblet til biotin og blev isoleret ved batch streptavidin kromatografi. Prøver undergik SDS-PAGE og immunoblotting med rotte-anti-DAT og muse-anti-TH-antistoffer. Immunreaktive bands blev fanget med en VersaDoc CCD-kamera imaging station og tætheder fra nonsaturating bånd blev kvantificeret ved hjælp Mængde One-softwaren. Top: Repræsentativ immunblot viser biotinyleret og total DAT og TH efter de angivne behandlinger. Nederst: Gennemsnitlige data. Biotinyleret protein signal udtrykt som% total protein ± SEM * Signifikant forskellig fra kontrol, Student t-test, p <0,03, n = 6.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Trods mangeårige viden, endocytisk handel kritisk påvirkninger synaptisk signalering i hjernen, har det vist sig udfordrende til kvantitativ måling af ændringer i protein-overflade udtryk hos voksne neuroner. I dette arbejde rapporterer vi en pålidelig metode til at mærke overfladeprotein ex vivo i akutte hjernesnit. Brain skive præparater har en mangeårig historie af nytte for elektrofysiologiske optagelser, da de opretholder synaptiske forbindelser og celle levedygtighed op til timer efter tilvirkningen. Desuden kan udskæring strategier optimeres for at bevare specifikke synaptiske forbindelser mellem forskellige områder af hjernen af ​​interesse.

Meget af det forudgående arbejde undersøger neuronal protein handel med hjerne-afledte præparater har været afhængig primært på synaptosomerne og primære dyrkede neuroner. Den akutte skive biotinyleringen tilgang metode kan prale af flere fordele i forhold til en af ​​thESE: synaptosomerne er fysisk fjernet fra Axon og må ikke indeholde de nødvendige molekylære faktorer trofast rekapitulere intakt neuronal protein menneskehandel. Derudover er synaptosomale præparater ofte forurenet med membranfragmenter, der kan give en skævhed eksperimentelle resultater. Primære neuronale kulturer er typisk stammer fra udviklingsmæssigt umodne neuroner, som måske ikke har passende differentierede i deres modne neuronale fænotyper udtrykker mekanismer menneskehandel cellespecifikke. I modsætning hertil akutte skiver udviser høj grad af cellelevedygtighed og er afledt fra voksne dyr. Desuden kan overflade handel sammenlignes efter in vivo molekylære manipulationer, såsom genadministration / knockdown, optogenetic neuronal stimulation / hæmning, eller efter in vivo lægemiddelbehandlinger eller adfærdsmæssige tilpasninger.

Selvom der er mange fordele ved at ex vivo slus fremgangsmåde, der er flere begrænsninger samt. Akut (noncultured) hjerneskiver har begrænset levedygtighed og er derfor ikke egnet til kroniske medicinske behandlingsmetoder. Desuden observerede vi, at de ikke forbliver levedygtige i temperatur shift forsøg, hvor skiverne hurtigt kølet og rewarmed. Endvidere udsnit er mest levedygtige når de fremstilles fra P21-P35-mus, potentielt at begrænse mængden af tid, der in vivo behandlinger kan foretages før udførelse eksperimenter. Faktisk, ved hjælp af en high-sucrose skære løsning, finder vi, at DAT menneskehandel mindre reproducerbart observeret i skiver fremstillet fra P35-P42 mus (Gabriel og Melikian, upublicerede data). Men vi observere markant forbedret skive levedygtighed i ældre dyr ved hjælp af den modificerede forberedelse skive som beskrevet af Zhao et al. 24. Denne tilgang er et glimrende alternativ, hvis metodiske parametre kræver brug af ældre dyr (dvs.. Efter EIThendes viral-medieret protein / RNA udtryk oprettelse adfærd, eller kronisk in vivo lægemiddelbehandlinger).

Der er flere andre tekniske faktorer, der kan påvirke den eksperimentelle resultat. Det er bydende nødvendigt at empirisk bestemme den optimale perle / totalt protein-forhold er nødvendig for at fange alle de biotinyleret protein i en given mængde af det samlede lysat protein inden du forsøger kvantitative eksperimenter. Dette spørgsmål er ofte overset, men kan være den afgørende faktor i at kunne detektere ændringer i protein-overflade udtryk. Hvis intet af biotinyleret protein ikke er kvantitativt inddrives, vil ændringer i overfladen niveauer enten være målbart eller unøjagtigt målt. En anden variabel, der kunne påvirke resultaterne er mængden af ​​lysis buffer, der bruges til at adskille de vævssnit. Den absolutte vævsmasse anvendes, vil afhænge af det område af interesse ved at blive undersøgt, og vil likely kræver mere eller mindre lysisbuffer for at opnå fuldstændig væv solubilisering. Som sådan kan slutkoncentrationerne lysat protein også variere på tværs af områder af hjernen. Derfor bør lysebetingelser bestemmes empirisk for et givet område af hjernen og holdes konstant mellem uafhængige forsøg.

Sammenfattende giver vi en detaljeret protokol til måling af neuronal protein handel med voksne neuroner ved hjælp af ex vivo akut hjernen skiver. Udnyttelse af denne tilgang vil sandsynligvis føre til en mere dybdegående forståelse af mekanismer endocytiske menneskehandel, der ligger til grund for neuronal funktion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen økonomiske interesser, der strider mod dette arbejde.

Acknowledgments

Dette arbejde blev finansieret af NIH tilskud DA15169 og DA035224 til HEM

Materials

Name Company Catalog Number Comments
sulfo NHS-SS-biotin Pierce 21331
Streptavidin agarose Pierce 20347
IgG-free, Protease-free bovine serum albumin Sigma A3059
Vibrating microtome sectioner various
Shaking water bath various
Millicell mesh-bottomed inserts (8 µm pore size) Millipore PI8P 012 50 These can be washed by hand and reused

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Conner, S. D., Schmid, S. L. Regulated portals of entry into the cell. Nature. 422, 37-44 (2003).
  2. Zastrow, M., Williams, J. T. Modulating neuromodulation by receptor membrane traffic in the endocytic pathway. Neuron. 76, 22-32 (2012).
  3. Leto, D., Saltiel, A. R. Regulation of glucose transport by insulin: traffic control of GLUT4. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 13, 383-396 (2012).
  4. Liu, Y. W., Lukiyanchuk, V., Schmid, S. L. Common membrane trafficking defects of disease-associated dynamin 2 mutations. Traffic. 12, 1620-1633 (2011).
  5. Li, X., DiFiglia, M. The recycling endosome and its role in neurological disorders. Prog. Neurobiol. 127-141 (2012).
  6. Sandvig, K., Pust, S., Skotland, T., van Deurs, B. Clathrin-independent endocytosis: mechanisms and function. Curr. Opin. Cell Biol. 23, 413-420 (2011).
  7. Kumari, S., Mg, S., Mayor, S. Endocytosis unplugged: multiple ways to enter the cell. Cell Res. 20, 256-275 (2010).
  8. Barry, M. F., Ziff, E. B. Receptor trafficking and the plasticity of excitatory synapses. Curr. Opin. Neurobiol. 12, 279-286 (2002).
  9. Bredt, D. S., Nicoll, R. A. AMPA receptor trafficking at excitatory synapses. Neuron. 40, 361-379 (2003).
  10. Kerchner, G. A., Nicoll, R. A. Silent synapses and the emergence of a postsynaptic mechanism for LTP. Nat. Rev. Neurosci. 9, 813-825 (2008).
  11. Malinow, R., Malenka, R. C. AMPA receptor trafficking and synaptic plasticity. Annu. Rev. Neurosci. 25, 103-126 (2002).
  12. Borgland, S. L., Malenka, R. C., Bonci, A. Acute and chronic cocaine-induced potentiation of synaptic strength in the ventral tegmental area: electrophysiological and behavioral correlates in individual rats. J. Neurosci. 24, 7482-7490 (2004).
  13. Dong, Y., et al. Cocaine-induced potentiation of synaptic strength in dopamine neurons: Behavioral correlates in GluRA(-/-) mice. PNAS. 101, 14282-14287 (2004).
  14. Hyman, S. E., Malenka, R. C., Nestler, E. J. Neural mechanisms of addiction: the role of reward-related learning and memory. Annu. Rev. Neurosci. 29, 565-598 (2006).
  15. Thomas, M. J., Malenka, R. C. Synaptic plasticity in the mesolimbic dopamine system. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 358, 815-819 (2003).
  16. Sorkina, T., Hoover, B. R., Zahniser, N. R., Sorkin, A. Constitutive and protein kinase C-induced internalization of the dopamine transporter is mediated by a clathrin-dependent mechanism. Traffic. 6, 157-170 (2005).
  17. Holton, K. L., Loder, M. K., Melikian, H. E. Nonclassical, distinct endocytic signals dictate constitutive and PKC-regulated neurotransmitter transporter internalization. Nat. Neurosci. 8, 881-888 (2005).
  18. Loder, M. K., Melikian, H. E. The dopamine transporter constitutively internalizes and recycles in a protein kinase C-regulated manner in stably transfected PC12 cell lines. J. Biol. Chem. 278, 22168-22174 (2003).
  19. Melikian, H. E., Buckley, K. M. Membrane trafficking regulates the activity of the human dopamine transporter. J. Neurosci. 19, 7699-7710 (1999).
  20. Daniels, G. M., Amara, S. G. Regulated trafficking of the human dopamine transporter. Clathrin-mediated internalization and lysosomal degradation in response to phorbol esters. J. Biol. Chem. 274, 35794-35801 (1999).
  21. Sorkina, T., et al. RNA interference screen reveals an essential role of Nedd4-2 in dopamine transporter ubiquitination and endocytosis. J. Neurosci. 26, 8195-8205 (2006).
  22. Eriksen, J., et al. Visualization of dopamine transporter trafficking in live neurons by use of fluorescent cocaine analogs. J. Neurosci. 29, 6794-6808 (2009).
  23. Rao, A., Simmons, D., Sorkin, A. Differential subcellular distribution of endosomal compartments and the dopamine transporter in dopaminergic neurons. Mol. Cell Neurosci. 46, 148-158 (2011).
  24. Zhao, S., et al. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nat. Methods. 8, 745-752 (2011).
Brain Slice Biotinylering: En<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Tilgang til Measure Region-specifikke plasmamembranprotein Trafficking in Adult neuroner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gabriel, L. R., Wu, S., Melikian, H. E. Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons. J. Vis. Exp. (86), e51240, doi:10.3791/51240 (2014).More

Gabriel, L. R., Wu, S., Melikian, H. E. Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons. J. Vis. Exp. (86), e51240, doi:10.3791/51240 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter