Summary
神経細胞の膜輸送を動的に原形質膜タンパク質の可用性と大幅に影響を与える神経伝達を制御します。今日まで、成体ニューロンにおけるニューロンのエンドサイトーシス輸送を測定するために挑戦してきた。ここでは、急性の脳切片における表面タンパク質発現のex vivoでの急速な変化を測定するための非常に効果的な、定量的な方法を記載している。
Abstract
エンドサイトーシス調節トラフィッキングを動的分の時間スケール上の受容体、イオンチャネル及びトランスポーターの細胞表面提示を制御することにより、神経調節様々なイベントを容易に中枢機構である。個々のタンパク質のエンドサイトーシス輸送を制御する機構の幅広い多様性があります。売買の分子基盤を調査する研究は、主に定量的に、外因性刺激および遺伝子操作に応答して、膜タンパク質の表面発現の変化を測定する表面ビオチン化に依存してきた。しかし、このアプローチは、主に忠実に、成人ニューロンにおける遊んで生理学的に関連するメカニズムとは異なる場合があり、培養細胞が挙げられるが、これらに限定されています。また、培養細胞のアプローチは、人身売買の仕組みにおける領域特異的な差異を過小評価することができる。ここでは、急性脳スライス標本に細胞表面ビオチン化を拡張する手法を記載している。我々この方法は、成人ニューロンにおける膜タンパク質の表面レベルの急激な変化を測定するために、忠実度の高いアプローチを提供することを実証する。このアプローチは、神経細胞のエンドサイトーシス輸送の分野において広範な有用性を有する可能性がある。
Introduction
エンドサイトーシスの人身売買は、内在性膜タンパク質の様々な形質膜提示を微調整ユビキタス細胞メカニズムである。エンドサイトーシスは、細胞内環境1に重要な栄養素を提供し、受容体の活性化2に対応して受容体のシグナル伝達を脱感作する。バック形質膜へのエンドサイトーシス再循環はさらに、細胞表面3でのタンパク質の発現レベルを増加させることによって細胞内シグナル伝達を増強することができる。また、膜輸送の摂動は、タンパク質のエンドサイトーシス輸送を支配する分子メカニズムを研究する必要性を強調し、多数の疾患および病的状態に関与している4,5。多くのタンパク質は、古典的なクラスリン依存性内在化機構を利用しながら、過去数年間の証拠をマウントすると、複数のクラスリン非依存エンドサイトーシスの機構が増加、アレイのエンドサイトーシスの可能性を支配することを実証しているタンパク質6,7。従って、生理学的関連システム売買を容易にするエンドサイトーシスの機構を調査する必要性が大幅に高まっている。
脳では、受容体、イオンチャネルや神経伝達物質輸送体のエンドサイトーシスの人身売買は、シナプス可塑8月11日 、最終的には神経細胞の興奮性とシナプス応答に影響を与える虐待12月15日の薬物に対する応答を確立する上で主要な役割を持っています。神経細胞のトラフィッキング研究の大半は、異種発現系または培養一次ニューロンのいずれかに依存して、今日まで、どちらも確実成体ニューロンにおける再生時のメカニズムを反映することができる。ここでは、定量的に成体齧歯類に由来する急性脳スライスにおける表面タンパク質レベルを測定する表面ビオチン化を使用するアプローチを報告する。このアプローチを使用して、我々は、マウスの線条体ドーパミントランスポーターが急速に再内在ことを実証するデータを提示するホルボールエステルにより媒介されるプロテインキナーゼC（PKC）の活性化に応答。
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Protocol
全ての動物の取り扱いと組織の収穫は、承認されたプロトコール番号のA1506（Melikian、PI）以下、マサチューセッツ大学医学部動物実験使用委員会（IACUC）大学のガイドラインに従って行われた。
必要な溶液
人工脳脊髄液（ACSF） -新鮮な毎日を作る
125mMの塩化ナトリウム、2.5mMのKCl、1.2mMののNaH 2 PO 4、1.2のMgCl 2、2.4のCaCl 2、26 mMの炭酸水素ナトリウム、および11 mMグルコース
注： 炭酸水素ナトリウムとグルコースを除いた、10倍の原液としてACSFを準備します。新鮮なNaHCO 3およびグルコースを補う、10倍のストックから毎日1X使用液を作る。
ショ糖を補充ACSF（SACSF） -新鮮な毎日を作る
250 mMの成功、2.5mMのKCl、1.2mMののNaH 2 PO 4、1.2のMgCl 2、2.4のCaCl 2、26 mMの炭酸水素ナトリウム、および11 mMグルコースローズ
注： 炭酸水素ナトリウムとグルコースを除いた、10倍の原液としてSACSFを準備します。新鮮なNaHCO 3およびグルコースを補う、10倍のストックから毎日1X使用液を作る。
スルホ-N-ヒドロキシスクシニル-SS-ビオチン （スルホ-NHS-SS-ビオチン、ピアース·ケミカル·カンパニー）
原液をDMSO中200 mg / mlのも、複数回の凍結/融解サイクルに耐性がある必要があります。アリコートを-20℃で保存するサクシニルエステルは急速に水溶液中で加水分解されるので、作業溶液は、前のスライスに適用するにすぐに準備する必要があります。
スライスクエンチソリューション
100 mMグリシンを補給しACSF
RIPA溶解BuffeR
10mMのトリス、pH7.4、150mMのNaCl、1.0mMのEDTA、1％トリトン-X-100、0.1％SDS、1％デオキシコール酸ナトリウム
プロテアーゼ阻害剤（RIPA / PI）でRIPA -新鮮な毎日を作る
RIPAは、1μMロイペプチン、1μMペプスタチン、1μMアプロチニン、および1mMフェニルメチルスルホニルフルオを補った。
1。脳スライスを準備します
- 作る新鮮な1X SACSFおよび1X ACSF
- 小さなビーカーに氷の上SACSFを冷やす。これは、新たに採取したマウスの脳を保持するために使用される。
- 95％/ 10％のO 2 / CO 2、氷上で20分でバブリングして酸素とACSFとSACSFを飽和さ。
- P30-38マウスは、最適な組織の生存のために使用されるべきである。頸椎脱臼や断頭により動物を犠牲にし、急速に予備冷却、酸素化SACSFに脳を削除します。
- 振動ミクロトームを用いて、関心領域内の300μmの脳切片を作る。
- 必要に応じて、スライスはさらにそれぞれ、対照および実験スライスとして使用するために、特定の脳領域または別々の左右の半球を濃縮する前に回復を解剖することができます。
- 熱加工パスツールピペットを用いて、24ウェルプレートにセットチャンバ底メッシュのスライスを転送する。
- スライスが継続的、穏やかな泡立ちで、酸素化ACSF中で、40分間31℃を回復することができます。
2。薬物治療（該当する場合）とスライスビオチン化
- 回収に続いて、スライスを3回洗浄する予め温めた（37℃）で、酸素化ACSF 95％/ 5％O 2 / CO 2でバブリング絶えず。
- 試験化合物を追加し、継続的な酸素化でインキュベートする。
- 便宜のために、10倍濃縮された薬剤の1/10の容量を追加して、静かに転倒混和。
- 所望の温度の水浴中で穏やかにプレートを振る。
- 次の薬物治療、急速に氷冷たいACSFで3回洗浄することにより、スライスを冷やす。
3。ビオチン表面タンパク質
- 直前のラベルに、氷冷ACSFでの準備1.0 mg / mlのスルホ-NHS-SS-ビオチン。
- スライスに0.75ミリリットルスルホ-NHS-SS-ビオチンを加え、氷上で45分のスライスをインキュベートする。
- 氷上の氷冷ACSF中で10分間インキュベートして、氷冷ACSFで迅速にスライスを3回洗浄します。
- 氷冷たいスライスクエンチバッファーでスライス3回洗浄し、無料のスルホ-NHS-SS-ビオチンを急冷し、氷上で、0.75ミリリットルスライスクエンチ緩衝液で2回、25分間インキュベートする。
4。組織溶解物を準備します
- 氷冷ACSF内のスライス3回洗浄し、ファイアーポリッシュパスツールピペットを用いてマイクロ遠心チューブに各スライスを転送する。
- 200 XG、1分、慎重に吸引残りのACSFを遠心分離することにより穏やかにペレットをスライス。
- P200ピップを通して一度ダウンして400μLの氷冷RIPA / PIを加え、ピペッティングにより組織を破壊し、ディスケット。
- 転写を新しいチューブにスライス/ RIPA解離し、溶解を完了するために、回転、30分間、4℃でインキュベートする。
- 遠心分離して細胞破片をペレット化し、18,000×gで、15分間、4℃
- 標準としてウシ血清アルブミン（BSA）を用いて、BCAタンパク質アッセイを用いて溶解物のタンパク質濃度を決定する。
5。ビオチン化タンパク質を単離
- ビーズ/総タンパク質比を最適化します。
注：個々のタンパク質発現レベルは、異なる脳領域を横切って広く変えることができる。組織溶解物の所与の量のビオチン化タンパク質の全てが捕捉されない限り、正確表面発現の潜在的な変化を検出することができない。したがって、経験的に前の新しいスライスビオチン化研究に着手する特定のタンパク質/脳領域のための最適なビーズ/総タンパク質比を決定することが不可欠である。- 増加量が25μlのストレプトアビジンアガロースビーズをインキュベートその後、組織溶解液（おおよその範囲25〜200μgの）のS、および結合、洗浄および溶出工程のために以下に記載するように進んでください。
- 得られた免疫反応性のバンドを定量化し、その結合の線形範囲内のビーズ/溶解物比を選択すると、増加またはタンパク質の表面発現の減少のいずれかの正確な定量化を可能にする。
- ストレプトアビジン - アガロースビーズを準備します
- すべてのサンプルに必要な総ビーズ体積を決定します。 25μL/サンプル= 100μlのビーズ+ 1余分= 125μlのビーズで、その量に十分なビーズ容量プラス1の余分な（ つまり 4サンプルを準備します。
- 渦ストレプトアビジンビーズストックピペットから所望のボリューム。 P200ピペットを使用している場合は、閉塞またはビーズの損傷を防ぐために、チップの先端を切り落とした。
- 部屋の気性で、18,000×gで1分間遠心分離することにより保存料、各RIPA添加後ボルテックスと洗浄の間に収集ビーズを除去するために0.5〜1.0ミリリットルRIPA / PIでビーズを3回洗浄しますature。
- 真空フラスコに付着したガラスパスツールピペットを用いて洗浄の間にバッファをオフに吸引除去する。吸引時にガラスパスツールピペットの先端に取り付けられたプラスチックのP200チップはより細かい制御を提供します。それがピペットにビーズを吸引するリスクなどには、最初の2回の洗浄のために絶対的に全てのバッファを削除する必要はありません。最終洗浄後、ビーズを吸引することなく、可能な限り余分なバッファを削除します。
- 再懸濁するために上下にピペッティングして、戻って、元のボリュームにビーズを持って来るRIPA / PIを追加します。ビーズが管壁に固執するように、この時点では、ボルテックスを避けてください。
- カットオフチップでP200を使用したマイクロ遠心チューブに一定分量ビーズ。ピペットは、ビーズを確保するために、サンプリングの間に数回上下に均等にチューブの中で懸濁し、分散したまま。
- ストレプトアビジンビーズに結合ビオチン化タンパク質
- アガロースビーズを含むチューブに細胞溶解物を配布します。実験用のWHE複数のサンプルが比較されているRE、正確な比較のために、各サンプルについて同量のタンパク質を使用してください。
- 200μlの最小体積をサンプルにもたらすために、追加のRIPA / PIを追加します。これはサンプルがインキュベーション中に十分に混合することを保証し、また、サンプル間でタンパク質濃度を統一。
- チューブローテーターにチューブをセットし、4℃で一晩混合
- 別々のチューブにおいて、各サンプルに対して使用される全ライセート体積と同等のものを分注する。試料容積が高い場合あるいは、総溶解物体積の割合は、SDS-PAGEゲル上で最大負荷容量を収容するために、代わりに予約することができる。これらは、総タンパク量を表面発現を正規化するために使用される。
- 等しい体積の2倍または6×SDS-PAGE試料緩衝液の1/5体積いずれかのサンプルが分析されるまで-20℃でビーズ試料、またはストアと並行して、4℃にてインキュベートのいずれかを追加する。
- 室温で、18,000×gで、2分間遠心分離することにより、ビーズを沈殿。
- 上清を吸引し、洗浄ビーズ0.75ミリリットルRIPAで3回。ビーズの損失を最小限に抑えるには、洗浄の間にビーズ上のバッファの小さなヘッド体積を残す。最後の洗浄後、ビーズペレットを中断することなく、可能な限り多くのRIPAを削除します。
- ジスルフィド結合を還元することによりストレプトアビジンビーズからのビオチン化タンパク質を溶出する。サンプルバッファーを減らす25μlの2X SDS-PAGEは、ウェルに加え、ボルテックスし、試料を30分間回転させ、室温。
注：多くの膜タンパク質は厳しく、その電気泳動移動度を損なう、SDS-PAGEサンプル緩衝液中で煮沸したときに凝集する傾向が高い。これは調査されたタンパク質の場合である場合には、試料の加熱を回避し、その代わりに、室温で徐々に溶出する。沸騰（並列に評価し、他のタンパク質が沸騰を必要とする場合など ）絶対に必要であるならば、SAMPL電子バッファは、凝集を最小限にするために2 M尿素（最終濃度）を補充することができる。いくつかの場合に凝集を低減するのに有効であるが、尿素はしばしばバンド外観を損なう。 - イムノブロットによりサンプルを分析する。
- 総溶解物試料を解凍し、ビーズ試料を、30分間、室温と平行に回転する。
- SDS-PAGEゲル上の別々のタンパク質。
- 免疫ブロッティングにより目的のタンパク質を同定する。
- バンドは適切な定量化のための検出の直線範囲内で検出されたことを確信。
- ビオチン化試薬が破損/侵害の細胞を介した細胞内タンパク質へのアクセスを得ていないことを保証する。これは、最良の調査中の細胞型に特異的な細胞内タンパク質について並行して免疫ブロットにより達成される。
- バンド密度を定量化し、総タンパク質発現レベルの％として相対タンパク質表面密度を計算する。
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Representative Results
ニューロンのドーパミントランスポーターは、細胞株16-20におけるPKCの活性化に応答して内在化される。細胞株および種々の発現系におけるPKC誘発DAT表面損失を実証する多くの報告にもかかわらず、培養されたドーパミン作動性ニューロン21-23でこの知見を確認するために挑戦してきた。私たちは、直接DATが大人のドーパミン作動性ニューロンにおけるPKCの活性化に応答して内部化するかどうかをテストするために、マウスの線条体スライスを使用していました。スライス標本に続いて、スライスは、同一の面からの正中線とスライスに沿って二等分し、37℃で、30分間、1μMホルボールミリステート13アセテート（PMA）±処理し、スライスは急速に冷却されたであり、表面タンパク質がビオチン化プロトコールに記載のように単離した。イムノブロットは、ビオチン化試薬は、ドーパミン作動性ニューロン内の任意の細胞内へのアクセスを得たかどうかを測定するために、並行して、DATのため、また、チロシンヒドロキシラーゼ（TH）のために探索した。に見られるように図1（ 上）は 、我々は、細胞表面での総DATの81.4±5.8％で、基礎（ビヒクル処理した）条件の下で、マウスの線条体における堅牢なDAT表面発現を検出した。 1μMのPMA、30分、37℃でのPKC活性化が大幅に形質膜からのDATの約30％の損失に相当する60.8±5.2％、全DAT、DATに表面発現を減少させた。これとは対照的に、総THのわずか1.6±0.4％が、その細胞内局在およびビオチン化試薬は、ドーパミン作動性ニューロンの細胞内部から排除されたことを確認すると一致します（ 図1、下）、ビオチン化した。
図1。急性PKC活性化は、成体線条体ニューロンにおけるドーパミントランスポーター表面レベルを減少させます。マウス線条体スライスビオチンylation。急性マウスの線条体切片を、 プロトコルに記載のように調製し、±1μMのPMA、30分間、37℃で処理した表面タンパク質は、共有結合、ビオチンに結合し、そしてバッチストレプトアビジンクロマトグラフィーによって単離した。試料は、ラット抗DATおよびマウス抗TH抗体でSDS-PAGEおよびイムノブロッティングを行った。免疫反応性バンドを数量Oneソフトウェアを用いて定量した非飽和バンドからのVersaDoc CCDカメライメージングステーションと密度で捕捉した。上：示された処置後、ビオチン化し、合計DATとTHを表示する代表イムノブロット。下：平均データ。ビオチン化タンパク質の信号が制御有意差SEM *±％の全タンパク質、スチューデントのt検定、p <0.03、N = 6で表されます。
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Discussion
脳内での批判的な影響シナプスシグナリングエンドサイトーシスの人身売買は、それが定量的に大人の神経細胞内のタンパク質表面発現の変化を測定することが困難な証明されたことを長年の知識にもかかわらず。本研究では、急性脳スライスにex vivoで表面タンパク質を標識するために信頼性の高いアプローチを報告する。彼らはシナプス結合およびその調製時間後に細胞生存率アップを維持するように、脳のスライス標本は、電気生理学的記録のためのユーティリティの長年の歴史を持っています。また、スライシング戦略は、目的の種々の脳領域間の特定のシナプス結合を維持するために最適化することができる。
脳由来の製剤で、神経細胞タンパク質輸送を調査する前の作業の多くは、主に、シナプトソームと初代培養神経細胞に依存しています。急性スライスのビオチン化のアプローチ法は、目のいずれかに比べていくつかの利点を誇っていますESE：シナプトソームは、物理的に軸索から削除され、忠実に完全な神経細胞のタンパク質輸送を再現するために必要な分子の要因が含まれていない場合があります。さらに、シナプトソーム調製物は、しばしば、実験結果をゆがめることができる膜断片で汚染されている。一次神経細胞培養は通常、適切に細胞特異的な人身売買の仕組みを表現する彼らの成熟したニューロン表現型に分化していない可能性があり、発達未熟な神経細胞に由来している。対照的に、急性切片は、細胞生存度が高く示し、成体動物に由来する。また、表面の人身売買は、このような遺伝子送達/ノックダウン、optogenetic、神経刺激/阻害、またはin vivoでの薬物治療や行動の適応で 、次のようなin vivoでの分子操作には、次の比較することができます。
ex vivoでのSには多くの利点がありますがシラミのアプローチは、いくつかの制限がそこにもある。急性（noncultured）脳スライスは、限られた生存能力を有し、したがって、慢性薬物治療には適していません。また、我々は、それらがスライスが急速に冷却し再び温められている温度シフト実験中に生存可能なままでいないことを観察した。 P21-P35マウスから調製された場合、さらに、スライスは、潜在的にin vivoでの治療は、事前の実験を行うに行うことができる時間の量を制限する、最も生存可能である。実際、高ショ糖切削液を用いて、我々が、DATの人身売買が少なく再現性P35-P42マウス（ガブリエルとMelikian、未発表データ）から調製されたスライスで観察されていることがわかります。しかし、我々は、このアプローチは、方法論的パラメータは、高齢の動物（ すなわちを使用する必要が優れた選択肢である趙ら 24に記載されているように修正されたスライス標本を用いて、高齢の動物で顕著に改善されたスライスの生存率を観察します。次のEIT彼女のウイルス媒介タンパク質/ RNA発現、行動を確立する、またはin vivo薬物治療中の慢性）。
実験的な結果に影響を与えることができるいくつかの追加の技術的な要因がある。これは、経験的に事前の定量的な実験を試みる総タンパク質溶解物の一定量のビオチン化タンパク質の全てを捕捉するのに必要な最適なビーズ/総タンパク質比を決定することが不可欠である。この問題は、しばしば見過ごされているが、タンパク質表面発現の変化を検出することが可能であることに決定的な要因であることができる。ビオチン化タンパク質の全てが定量的に回収されない場合、表面レベルの変化は検出不可能または不正確に測定されたいずれかである。成果に影響を与える可能性が別の変数は、組織切片を解離するために使用される溶解緩衝液の体積である。使用絶対組織塊が検討されて、関心のある領域に依存し、likelますyは、完全な組織の可溶化を達成するために、多かれ少なかれ溶解緩衝液を必要とする。このように、最終的な溶解物のタンパク質濃度はまた、脳の領域にわたって変化し得る。したがって、溶解条件は、経験的に与えられた脳領域について決定し、独立した実験の間に一定に保たれるべきである。
要約すると、我々は、ex vivo急性脳スライスを使用して大人の神経細胞内の神経タンパク質輸送を測定するための詳細なプロトコルを提供する。このアプローチの利用は、神経機能の基礎となる、エンドサイトーシスの人身売買メカニズムのより深い理解につながる可能性がある。
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Disclosures
著者らは、この研究と矛盾する財政的利害関係はありません。
Acknowledgments
この作品は、裾には、NIHの助成金DA15169およびDA035224によって賄われていた
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| sulfo NHS-SS-biotin | Pierce | 21331 | |
| Streptavidin agarose | Pierce | 20347 | |
| IgG-free, Protease-free bovine serum albumin | Sigma | A3059 | |
| Vibrating microtome sectioner | various | ||
| Shaking water bath | various | ||
| Millicell mesh-bottomed inserts (8 µm pore size) | Millipore | PI8P 012 50 | These can be washed by hand and reused |
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