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Medicine

对于资源有限设置一个负担得起的HIV-1耐药性监测方法

Published: March 30, 2014 doi: 10.3791/51242
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 2, 3, 1, 4, 1
1Africa Centre for Health and Population Studies, College of Health Sciences, University of KwaZulu-Natal, Durban, South Africa, 2Unit D11, Jembi Health Systems, 3Academic Medical Center, Department of Global Health, Amsterdam Institute for Global Health and Development (AIGHD), University of Amsterdam, 4Division of Infectious Diseases and Geographic Medicine, Centre for AIDS Research, Stanford Medical School

Summary

耐药性检测为HIV-1感染的个体没有抗逆转录病毒疗法（ART）可以指导今后的治疗，提高治疗效果。在艾滋病高流行，但资源有限的环境优化个人和人群健康状况最终将需要负担得起的和可获得的耐药基因分型和解释方法。

Abstract

HIV-1耐药性有可能会严重危及抗逆转录病毒疗法（ART）的有效性和影响。在撒哈拉以南非洲艺术活动继续扩大，对艺术的个人应密切关注耐药性的出现监控。传播耐药性跟踪病毒株，以艺术已经耐药的传播监测也很关键。不幸的是，耐药性测试仍然没有在资源有限的设置容易获得，因为基因分型是昂贵的，需要先进的实验室和数据管理基础设施。开放获取基因型耐药性的监测方法来管理个人和评估传播耐药性描述。该方法使用药物的耐药模式的解释和个别病人报告的生成免费的开源软件。基因分型协议具有大于95％的用于与AV血浆样品的扩增率iral负荷> 1,000 HIV-1 RNA拷贝/毫升。敏感度显著的病毒载量<1,000 HIV-1 RNA拷贝/毫升下降。这里描述的方法验证对测试经美国食品和药物管理局（FDA）的Viroseq基因分型方法的HIV-1耐药性的方法。这里描述的方法的局限性包括的事实，它不是自动的，并且它也未能扩增来自样品的验证面板的循环重组形式CRF02_AG，虽然它扩增亚型A和B在相同的面板。

Introduction

艾滋病疫情在南部非洲已迅速发展1与抗逆转录病毒疗法（ART）的个人伴随指数增长，尤其是在南非的2，3。作为大型的治疗方案在降低发病率4，增加在资源有限的环境预期寿命（RLS）5流行病学影响的证据不断积累，努力提高技术覆盖面将愈演愈烈。指引对检测和治疗方案下使用的治疗作为预防工具6，7的演变意味着在处理个人的绝对数量将进一步增加。大量个人的将是艺术的更长的时间作为艺术个体的平均寿命接近，艾滋病毒感染人群8。艾滋病病毒耐药性的发展和传播具有ALWAYS被认为是艺术9-12所取得的成就构成了威胁。因此，有必要更严格监视和监测药物抗性作为多的人正在发起到ART。

基因型耐药性检测（GRT）已成功地应用在发达国家，无论是监视，以及在接受ART个人监测的HIV-1耐药性。在这些情况下，GRT已经融入护理对HIV-1感染者的统一体。大多数国际指南推荐GRT成人或儿童患者未能艺术（一线和二线）13-15，儿童患者暴露预防母亲向婴儿传播（PMTCT）方案，但后来感染16，并在与设置高级别之间急性感染者13-15传播耐药性。然而，成本，技术和基础设施的要求也限制了implementation的类似的方法在RLS的耐药性监测。

南非艾滋病毒治疗和监测指南不建议目前在艺术指导选择使用GRT的个人失败的一线药物17。个人主要基于病毒学（HIV-1 RNA病毒负载）参数切换。然而，在2012年，南部非洲艾滋病临床医师学会出版了第一本南部非洲抗逆转录病毒药物耐药性检测的准则18。这些指南推荐所有成人未能一线和二线抗逆转录和感染的婴儿和儿童接触到预防艾滋病母婴传播18 GRT测试。然而，GRT不建议用于18急性感染的个体，因为没有证据显示目前在南部非洲19-29高水平的传播耐药性。预计其中一些建议将被整合随着时间的推移进入全国特雷各个国家在该地区的atment和监控指引。目前，在2013年南非治疗指南，现在有GRT的在成人二线故障时间，并在为儿童30一线或二线PI为基础的治疗失败时间的建议。

它已经表明，整合GRT到南非治疗指南的话会有潜在的成本无关。考虑到第二线疗法的药物相对比一线药物更加昂贵的成本，使用粒度，以确定病人谁真正需要切换到第二线治疗不会造成任何额外费用给程序。此外，GRT还可以找出其他原因失效，节约治疗方案，并产生对新兴的耐药模式31的信息。因此，有必要减少甚至进一步，以提高访问，护理的质量耐药性监测方法的成本ð结果。

在这里，我们提出了一个GRT方法设计为使用泛型（开放源码）引物进行反转录聚合酶链反应（PCR）和测序（ 表1），以及用于耐药性的解释大多是开源软件。临床管理，该协议是由一个全面的检讨和报告的方法与实验耐药性报告，严格遵循国家治疗指南的专家解释称赞。该协议被分成四个不同的部件：1）HIV核糖核酸（RNA）提取，2）反转录聚合酶链反应（PCR）扩增的病毒目标，3）测序和4）的生物信息学方法，色谱图中，对应的分析，策展和序列数据的解释。

Protocol

1。乙二胺四乙酸（EDTA）的全血处理中

注：血液可以收集可以被存储在4℃下不超过24小时后，立即进行处理。

  1. 工作在一个生物安全柜，让EDTA全血样品达到室温。
  2. 对于每个样品，标记足够的冷冻管与样品标识（ID），存储材料（血浆）和日期。
  3. 离心样品10分钟，在1000×g下。不要使用刹车停止离心机。这将产生3层（从顶部到底部）：血浆，白细胞（血沉棕黄层） - 一个非常薄的层 - 和红细胞，包括血小板。
  4. 小心吸出上清液（血浆），并等分500毫升到每个离心管。小心不要破坏细胞层（血沉棕黄层）或转让任何细胞。
  5. 储存于-80℃直至提取RNA或立即进行RNA提取。
ve_title“> 2。RNA提取

  1. 准备提取工作表与要提取的样本，包括正面和负面的血浆控件的ID。
  2. 每个样品要被提取，标号1.5ml的无菌微量离心管中的样本ID，提取日期和“RNA”。还标记的组装柱和收集管，以及含有与从提取工作表相应的数字工作裂解溶液2ml微量离心管中。
  3. 工作中的生物安全柜，加入200μl样品的工作裂解液相应的2 ml离心管。
  4. 涡流井后，于室温下10分钟。
  5. 10分钟后，离心反应管短暂。
  6. 加入800毫升的无水乙醇中，以每管中。
  7. 脉冲涡流和短暂离心混匀。
  8. 转移600μl的该溶液中，以相应的列/集合管组件。离心6,000×克1分钟。
  9. 转塔到一个新的收集管中，并丢弃含有滤液的老收集管。两次重复上述步骤2.8（上图）。
  10. 加入500μl洗涤缓冲液AW1到每一列和离心机在6000×g离心1分钟。
  11. 弃去滤液和收集管和柱转移至新的收集管。
  12. 加入500μl为缓冲AW2和离心20,000 xg离心3分钟。重复步骤2.11。
  13. 离心机在一个新的收集管中以20,000×g离心额外的2分钟。
  14. 在1.5 ml离心管弃去滤液，将柱。
  15. 加60微升缓冲液AVE（无RNA酶的水）的柱以确保不分配液体在塔的一侧的中间。
  16. 在室温下孵育1分钟。
  17. 离心机在6000×g离心2分钟。
  18. 丢弃柱和盖1.5 ml离心管中。
  19. 样品现在已准备好丽花SE转录。
  20. 如果测试是要立即长达6小时完成，储存在4℃。但是，如果测试是要推迟然后立即放置于-80℃。注意：不要冻结/解冻的样品超过3倍。

3。试剂制备的反转录

  1. 在开始之前，计算每个需要被处理，包括阳性和阴性对照血浆样品的数量的试剂的体积。同时添加的试剂控制。
  2. 从步骤3.1使用计算的体积（上图），准备脱氧核苷酸三磷酸（dNTP的）引物组合在一个无尘，无菌的200微升PCR管后短暂脉冲涡流。每个样品应该具有0.5微升反向引物RT21和0.5微升的dNTP， 见表2。
  3. 分装1.0微升dNTP的引物组合，以200微升PCR管。
  4. 制备反转录酶（RT）的酶混合物中加入1μ;升的10×逆转录缓冲液，1微升的0.1M DTT和2微升的25mM的MgCl 2至无菌试管随后通过涡旋和短暂离心， 见表3。
  5. 将每个酶RNAseOUT和三标逆转录酶的酶混合物管的0.5微升然后点选管轻轻混匀。
  6. 保持管与冷块上的dNTP，引物混合物和酶混合物，并移动到RNA站。

4。反转录

  1. 加入6微升的RNA样品到的dNTP，引物混合物管随后简要地涡旋混合。
  2. 在添加的RNA后，移动到PCR房间，两个的dNTP /底漆/ RNA的结构和RT酶混合物管内的冷块或冰块上。
  3. 短暂离心的dNTP /引物/ RNA的结构管（步骤4.2），并将其放置在一个热循环。
  4. 热，在65℃下进行5分钟以变性RNA。
  5. 迅速冷却至4℃，保持2分钟。
  6. 暂停的热循环，同时仍然在4℃;取出离心管。
  7. 很快，同时保持冷块上管加入5微升的酶混合物。
  8. 通过敲击管轻轻混匀，然后短暂离心管中，并返回到热循环。
  9. 持所述管在50℃进行60分钟反转录的RNA随后酶变性，在85℃下进行5分钟以停止反转录。
  10. 冷却至37°C。一旦温度到达37℃时，暂停并采取管从PCR仪。
  11. 快速加入0.5微升RNA酶H的该管子并返回到热循环。
  12. 保持在37℃20分钟，然后冷却至4°C。
  13. 将互补DNA（cDNA）可立即使用，或者可以被存储在-20℃或更低的温度，直到需要。然而，长期存储的cDNA应于-80℃。

5。试剂制备用于PCR

  1. Befo重新出发，计算出每个需要的样本被处理和控制的数量的试剂的量。除了三个控件（正，负，和试剂），您还可以添加一个PCR对照（HIV DNA）。在第一和第二轮PCR混合物可同时制备和第二主混合物储存于-20℃直至需要。混合物可以被存储为约8小时。
  2. 添加18.4微升水，2.5微升10X缓冲液，1.0微升的MgCl 2，0.5微升dNTPs和0.25微升各引物的如列在表4和旋涡。
  3. 加入0.1微升的白金Taq聚合酶（和耐热），并通过点击它轻轻混匀管。
  4. 分装23μL母液以200微升PCR管。
  5. 用冷块或冰块移动到PCR房间母液管。

6。巢式PCR

  1. 加入2μlcDNA的23微升的第一轮PCR MASTE的ř混合。
  2. 关闭该管后，把样品中的热循环，并使用以下PCR循环条件为：94℃2分钟，95℃30个循环持续30秒，58℃20秒，72℃进行2分钟，随后在72℃最终延伸10分钟，如在图1中 。

图1
图1。巢式PCR循环条件。 点击这里查看大图。

  1. 继续第二轮的PCR阶段或在-20℃或更低的温度，直到在稍后阶段需要存储第一轮PCR产物。
  2. 对于第二轮PCR，加入2μl的第一轮PCR产物，以23微升第二轮PCR扩增预混一个的D使用上图1相同的PCR程序。

7。凝胶电泳

  1. 凝胶法制备
    1. 添加0.5克琼脂糖平板中，以250毫升的玻璃烧瓶中，并加入50毫升1×TBE缓冲液的烧瓶中。
    2. 热火在微波到沸腾;经常搅动（约每30秒），直至完全溶解。使用硅胶握把或硅胶烤箱手套，以把握热点烧瓶中。琼脂糖溶液可以熬出来的烧瓶很容易如此密切监测这一过程。
    3. 在室温下冷却约10分钟。
    4. 倒入琼脂糖为含有适当大小的梳子凝胶浇注托盘;凝胶是准备在使用约20-30分钟。
    5. 放置在凝胶电泳室，并运行所推荐的制造商。
  2. 凝胶电泳和可视化。
    1. 新型涡汁，持续10秒才能使用。
    2. 稀释1微升新型果汁与5微升的DNA样本和组合。
    3. 稀3微升新型果汁与3微升分子量标记和混合。
    4. 从第7.2.2和7.2.3（以上）装入混合和运行凝胶在100 V和400 mA为40分钟，以评估PCR扩增。
    5. 阳性扩增可在UV光下显现为1315 bp的片段， 图2。

    图2
    图2。用1％琼脂糖凝胶电泳和200 bp梯度PCR扩增的凝胶确认。 点击这里查看大图。

    1. 应的负和试剂对照中没有扩增，从而表明没有污染。

    8。 PCR产物清理

    1. 在筹备测序反应，阳性第二轮PCR产物使用的PureLink PCR纯化试剂盒清理。
    2. 加入80微升的工作结合缓冲高截止（B3）项至20μlPCR产物和吸管组合。
    3. 加样品与结合缓冲液，以在集合管的旋转柱混合。
    4. 离心柱以10,000×g离心1分钟。柱转移至新的收集管中。
    5. 用650微升洗涤液用乙醇洗柱。
    6. 离心柱以10,000×g离心1分钟。柱转移至新的收集管中。
    7. 以最大速度离心柱2-3分钟，以除去任何残留的洗涤缓冲液。
    8. 将离心柱与试剂盒提供一个干净的1.7毫升洗脱管。
    9. 加入40微升的洗脱缓冲液对柱的中心，并孵育柱在室温温度场e表示1分钟。
    10. 离心柱以最大的速度持续2分钟（> 10,000×g离心）。
    11. 洗脱管包含您的纯化PCR产物准备测序。丢弃的列。
    12. 确定使用NanoDrop中的DNA的浓度和质量。
    13. 如果没有内部测序设备的情况下，将纯化的PCR产物可以被发送到一个商业测序实验室在这个阶段。

    9。测序反应

    1. PCR产物使用的是大染料终止试剂盒3.1版和4的引物对每个样品（2正向和两个反向）进行测序。引物序列示于表2中 。因此，测序运行后，每个样品将有四个​​序列装配成重叠群。
    2. 设置如表5中所示的每一个的四个引物的测序反应。
    3. 在使用之前涡旋混合排序缓冲区和引物。
    4. 混合水，通过添加大染料测序之前缓冲液和引物。涡旋混匀。
    5. 颠倒离心管或轻轻拍打它加入大测序染料混合后，轻轻地混合母液。
    6. 等分试样9微升主混合物到96孔光学板的。
    7. 为了运行24个样品/盘，立盘所示， 图3所示。

    图3
    图3。 96孔板12患者样本进行测序，每个4引物（RTC1F，RTC2R，RTC3F和RTC4R）的计划表示。 点击这里查看大图。

    1. 加入1.0微升的DNA样本（〜20-40纳克）的，覆盖板用N粘合剂铝盖，然后轻轻地混合。
    2. 离心机在3000×g离心1分钟。除去铝盖，并添加一个橡胶密封垫。
    3. 将板在热循环仪中，并运行在图4所示的下列循环程序。

    图4
    图4。 PCR循环条件进行测序 。 点击这里查看大图。

    1. 当在PCR结束后，立即清理测序产物。

    10。测序清理

    1. 对于每个测序反应中，混合50微升无水乙醇和5μl3M乙酸钠。
    2. 使用多道移液器，加55＆＃956;升的乙酸钠/乙醇溶液，以每孔中。
    3. 密封井用胶粘剂铝盖，确保每个井妥善密封。
    4. 离心机在3000×g离心20分钟。
    5. 20分钟后，取下盖​​子，翻转板，以平滑的动作，到折叠实验室组织（请勿一鼓作气摆脱上清因为这将赶走颗粒！）。
    6. 离心倒板在相同的组织中，在150×g离心2分钟。
    7. 立即加入150μl的70％冷乙醇。不要拖延，加入乙醇在这一步。
    8. 轴封采用相同的粘接铝盖和旋涡。
    9. 离心机在3000×g离心5分钟。
    10. 翻转板到一个新的折叠纸巾和离心机倒在150×g离心1分钟。
    11. 离心后，将发现在热循环仪中，在50℃下进行2分钟干燥。
    12. 一旦该板块是干的，用胶粘薄膜覆盖密封，包装箔及金属储存在-20˚C，直到准备进行无线TH测序电泳。
    13. 当准备序列，溶解清洗测序产物在10毫升高迪甲酰胺，变性和负载电泳。

    11。生物信息学

    1. 序列组装
      1. 启动该程序Geneious。
      2. 创建工作文件夹来存储序列。
      3. 进口依照该测序仪产生的使用导入工具的工作文件夹ABI的文件。 Geneious将分配比例的质量分数为导入的每个序列。
      4. 打开序列质量分数> 70％通过双击它们。
      5. 每个文件都应该在一个新的窗口中打开。该软件将指示在质量，使用淡蓝色条序列的质量色谱图的每个核苷酸位置。指示条越长，效果越好底座通话质量。
      6. 使用光标，选择序列的离开了两端的中间部分，其质量较差一般。 点击提取按钮来提取该地区具有良好的品质序列。
      7. 选择每个样品所有四个序列中提取并将它们组装与参考序列。
      8. 检查组装顺序，以确保你在正确的阅读框。如果你是在正确的读码框，蛋白酶的开始应该从以下氨基酸：PQITLW。 RT年初将开始与PISPIE。
      9. 提取重叠群区域覆盖公关的开始到第300 RT密码子。在此过程中，还要检查插入或缺失。
      10. 经过共识提取的重叠群的序列，识别任何含糊之处，并通过质量检验的基本通话（对称，高度，背景和侧翼区的肩膀）验证混合基地的位置。
      11. 选择保守序列，然后单击提取按钮，从四个引物建立的共识序列的一个单独的文件和拉贝升了适当。
      12. 顺序导出到计算机或网络文件夹上的备份存储文件夹。
    2. 序列质量评估（HIVDB）
      1. 使用HIVDB节目在分析序列http://hivdb.stanford.edu 。
      2. 检查是否有缺失和插入的摘要数据，并确保该序列覆盖了所有的99蛋白酶（PR）的密码子，并且第一300 RT密码子。
      3. 检查是否有任何突出显示的质量保证（QA）问题，同时在公关和RT地区，如终止密码子，移码，模棱两可的立场和不同寻常的残留物。
    3. 测序质量控制
      1. 对爆炸从以前的运行本地序列数据库中的新序列。
      2. 如果新的序列类似于数据库中的任何序列> 97％，该协议的所有阶段应审查，开始与序列分析和回溯到RNA提取到ensurË有没有混合起坐（采样开关，贴错标签）或污染。
      3. 如果没有发现问题，则重复从RNA提取阶段旧的和新的样本进行分析。
      4. 如果序列仍> 97％相似，回顾病史，评估对个人之间的流行病学联系。
    4. 系统发育分析
      1. 从排列在Geneious使用的ClustalW程序数据库中的所有序列。
      2. 手动检查对齐对齐序列，缺失和插入和编辑相应。
      3. 构建系统发育树使用PHYML，Geneious树构建器或其他树建设者Geneious。
      4. 检查树与短支长的样品。
      5. 复查样品短支长的可能的污染。

    12。 REGA DB资讯

    1. 序列上传
      1. 登录到REGADB使用一个唯一的用户名和密码。
      2. 在下拉菜单中，根据患者ID，选择“开始使用”。
      3. 新增病人ID，然后选择其基因型是要上载的个人。
      4. 在菜单的左边，选择“病毒隔离”。
      5. 从下病毒分离株的选项中选择“添加”。
      6. 输入采样日期，样品编号，序列号和序列日期。
      7. 选择“选择文件”，然后导航至要上传的序列的FASTA文件。
      8. 选择要上传的FASTA文件后，点击上传。
      9. 一旦上传的顺序出现在核苷酸框下的序列识别和日期，单击窗口右下角的OK按钮。
      10. 检查PR和RT蛋白排列按一下按钮蛋白质及选择公关或RT。
      11. 检查是否有耐药性突变通过点击阻力按钮。这使你从三种算法的耐药谱：ANRS，斯坦福HIVDB和RegaDB。
    2. 使用REGA报告生成
      1. 登录到RegaDB使用唯一的用户名和密码。
      2. 在下拉菜单中，根据病人ID，选择“开始使用”。
      3. 新增病人ID，然后选择其报告将产生个人。
      4. 在菜单右边，选择病毒分离。
      5. 从下病毒分离株的选项点击“视图”。
      6. 双击您要创建报告的病毒株。
      7. 对病毒分离株窗口中，单击病毒分离株的报告选项卡上。
      8. 选择算法的基因型从下拉菜单中的解释，然后选择报表模板使用。
      9. 一旦算法和模板被选中，点击按钮“生成”​​。
      10. 下载生成的RTF文档。
      11. 打开RTF做cument为Word文档。
      12. 调整治疗史图。
      13. 图表后，添加部分“临床图表和阻力的解释”。
      14. 使用电阻表和临床图表上的数据，添加患者的电阻曲线的开始与患者的治疗史的描述，​​以及药物其中病毒分离物具有抗性。还添加了患者的病毒载量的描述，并从图表CD4 +细胞计数型材。
      15. 发送报告，传染病（ID）专家审查和对未来的病人管理的建议。这一过程也是非常重要的质量保证阶段。在治疗史的基因型或出现不一致的任何错误，病毒学和免疫学资料，可以识别和审查的最终报告发送之前，所有的建议，给临床医生管理患者。

Representative Results

验证的方法是与先前报导的方法20的变形例。该Viroseq基因分型方法，这已被FDA批准，作为在验证的参考方法。从用于研究艾滋病和病毒性肝炎（ANRS）法国国家机构获得能力验证样品的面板中使用了两种方法之间的主要比较。这两种基因分型方法是100％一致确定所有重要的临床药物耐药相关突变的诠释HIVDB方案已成功通过两种方法扩增的样品。如表6所示，三对的核苷酸序列分别为99.5％相同。预测的氨基酸序列分别为100％的同一性。一个样本出来五个不可能由Viroseq被成功扩增。除了未通过Viroseq扩增样品中，在内部方法未能扩增将其所示的第二样品通过Viroseq是一个循环的重组病毒（CRF02_AG）。三个样品，与这两个方法分别扩增B亚型（两个样本）和A亚型（一个样本）。

图5
图5。使用完成作为序列的质量保证一部分HKY邻接树的。有序列很短的遗传距离4双/集群。 RES655和RES655_1之间的遗传距离（同一样品测序在不同的日子）为0.003。的是与RES637_1/RES638对一个潜在误差作为其遗传距离太短（0.075），用于从不同的流行病学无关联的个体的样品。有在树上的另一个RES637用时相比，RES638_1的距离为0.075。该CQ01/CQ02簇表明两种样品从面板是相同样品的重复。他们与B亚型参考序列，确认由REGA分型工具分配的亚型一起集群。 CQ05和CQ04集群与亚型A和G分别，而雷加分型工具分别分类为A和CRF02_AG。对于HIV亚型和重组的另一个有用的工具是SCUEL，这是可在http://www.datamonkey.org。 点击这里查看大图。

五个样品的面板是用来评估对内部方法的精度。生成各五个样品的十个复制基因型。使用16毛细管3130xl基因分析仪，分别来自24个运行产生48 50基因型，准备在同一天。对所有五个样本，预测的氨基酸序列是100％一致之间重复。对于核酸序列，第ERE的是> 99％的成对相似性。

在最初的两年使用这种方法中，重复60样本随机RNA提取测序。有序列的质量分数和的复制品之间的混合碱基数差异无统计学显著差异。为60双两个核苷酸和氨基酸成对比较均大于99％相同。因此，耐药性突变为所有对分别为100％一致。

降低成本

反应体积为RT，PCR和测序分别减少了至少一半，相对于原来的方法20，32，在不影响所产生的序列的质量。这使在50％成本的RT和PCR阶段的降低。

这种新方法的最初目的是与六测序引物序列来工作全部99个密码子的蛋白酶基因和前300个密码子的逆转录酶基因20，32的。类似的方法也可以使用6至8的引物33和34。一些最近发表的方法都用不到半年的引物，虽然有时测序蛋白酶和逆转录基因seprately 35，36。我们寻求减少的测序引物的数量从6到4，（ 图6）

图6
图6。从6比4的测序引物为1197 bp的pol序列可以覆盖所有99个HIV-1蛋白酶的密码子和第一300个密码子的逆转录酶基因的产生连续的序列的比较。242/51242fig6highres.jpg“目标=”_blank“>点击这里查看大图。

从一组从六个引物产生的17个样品的序列进行了比较，排除两个引物（MAW46和RTY）后产生的序列。该亚型分别为14 C亚型，二B亚型和一个亚型A.有顺序的质量分数无显著差异。再次，在17对核酸之间的平均成对身份是在氨基酸​​水平为99％和100％。从而，降低了测序引物从6到4导致在测序成本降低了近三分之一。

在这个协议中使用的唯一的专有软件工具是Geneious为序列组装。耐药性的解释工具，以及报告生成工具都是免费的，开放的工具。这通过消除与使用专有软件的成本进一步降低成本。此外，collectivË谈判所允许的试剂，该协议被打包成自Life Technologies方便地访问一个工具包，可作为土星/生命技术基因分型方法37。此外，土星的会员可以以折扣价获得的试剂。

临床上

所描述的协议已在监测和耐药性监测在一个农村社区的夸祖鲁 - 纳塔尔省已经实施。共有604基因型从临床标本中产生的2010年12月2013年5月之间在95％与病毒载量> 1,000 RNA拷贝/毫升样品的放大率。本临床艾滋病病毒耐药性研究经夸祖鲁 - 纳塔尔大学（参考BF052/10）的生物医学研究伦理委员会和卫生部的夸祖鲁 - 纳塔尔省部（参考HRKM十分之一百七十六）的健康研究委员会。生成并发送回诊所个别病人报告对病人的管理。

七十二（72）的基因型也产生了作为传播耐药性研究的监督的一部分，嵌套在一个大型的前瞻性人群为基础的HIV监测研究中。主要的样品收集在EDTA微管针挑破全血。在基因分型有79％的19放大率。从夸祖鲁 - 纳塔尔省生物医学研究伦理委员会的大学（参考BE066107）获得伦理委员会批准为样本，​​从监测研究的基因分型。

引物名称序列长度方向 HXB2位置
MAW-26 TTGGAAATGTGGAAA GGAAGGAC 23 向前 2028年至2050年第一轮PCR
RT-21 CTGTATTTCAGCTATC AAGTCCTTTGATGGG 31 反向 3539-3509 第一轮PCR
亲1 TAGAGCCAACAGCCC CACCA 20 向前 2147年至2166年第二轮PCR
RT-20 CTGCCAATTCTAATTC TGCTTC 22 反向 3462-3441 第二轮PCR
RTC1F ACCTACACCTGTCAA CATAATTG 23 向前 2486年至2508年测序
RTC2R TGTCAATGGCCATTG TTTAACCTTTGG 27 反向 2630至2604年测序
RTC3F CACCAGGGATTAGAT ATCAATATAATGTGC 30 向前 2956年至2994年测序
RTC4R CTAAATCAGATCCTAC ATACAAGTCATCC 29 反向 3129-3101 测序
RT-Y GTGTCTCATTGTTTAT ACTAGG 22 反向 2967年至2946年测序
MAW-46 TCCCTCAGATCACTC TTTGGCAACGAC 27 向前 2251年至2277年测序

表1中。逆转录，PCR，和在一个1197 bp的片段聚合酶覆盖所有99 HIV-1蛋白酶的密码子和第一300个密码子的反向trascriptase基因的产生用于测序的引物的自定义。

RT21（5pmol/ml） 0.5 0.2
的dNTP（10mM的） 0.5 0.4
总 1

表2。的dNTP /底漆混合的逆转录反应。

试剂体积（ml）/反应浓度/反应
第一链缓冲液（10X） 1 1
的MgCl 2（25毫摩） 2 4
DTT（0.1M） 1 0.008
RNaseOUT（40单位/毫升） 0.5 16
的Superscript III反转录酶（200U/ml组） 0.5 8
总 5

表3。酶混合进行逆转录反应。

试剂体积（ml）/反应最终浓度/反应
DEPC处理水 18.4 - </ TD>
PCR缓冲液（10倍） 2.5 1
MGCI 2（50毫米） 1 2
dNTP混合物中（10mM） 0.5 0.2
刚愎底漆（5皮摩尔/毫升） 0.25 0.05
反向引物（5皮摩尔/ ml）的 0.25 0.05
白金Taq酶（5 U / ml的） 0.1 0.02
小计 23 -

表4。主结构的巢式PCR。

试剂体积（ml）/反应浓度/反应
DEPC处理水 6.1
测序缓冲液（5X） 2 1
底漆（3.2皮摩尔/毫升） 0.5 0.16
Big Dye终止测序混 0.4 -
总 9

表5。主结构的测序反应。

Viroseq 室内 ％NA相似
样品编号亚型质量得分公关突变 RT突变亚型质量得分公关突变 RT突变
CQ01 乙 99.9 M46L，I54L，V82A，L90M D67N，T69D，K70R，M184V，T215V，K219Q 乙 99.2 M46L，I54L，V82A，L90M D67N，T69D，K70R，M184V，T215V，K219Q 100
CQ02 乙 99.5 M46L，I54L，V82A，L90M D67N，T69D，K70R，M184V，T215V，K219Q 乙 99.5 M46L，I54L，V82A，L90M D67N，T69D，K70R，M184V，T215V，K219Q 100
CQ03 不适用不适用不适用不适用不适用不适用
CQ04 CRF02_AG 98.4 I54V，V82F，I84V M41L，L74I，L210W，T215Y，V108I，Y181C 不适用不适用不适用不适用不适用
CQ05 一 99.7 K103N 一 93 K103N 100

表6。比较雷苏尔TS从Viroseq基因分型方法，并在内部使用的样品由ANRS提供一个面板的方法之间的平行分析。

Discussion

几个低成本的内部方法已经在努力，力图使艾滋病病毒耐药性基因分型更实惠33，34，36被描述。有需要对药物的抗药性测试融入护理的连续性就抗逆转录病毒疗法在资源有限的环境个人毫无疑问的。然而，大多数报道的方法集中于药物抗性基因分型中的耐药性在群体水平的监视应用程序。土星/ Life Technologies公司的基因分型方法是监测和耐药性监测一个完全集成的协议。这种方法被设计成一个负担得起的协议落实耐药性，为临床管理报告和生成的解释大多是开源和开放获取生物信息资源。

它是通过与FDA批准的Viroseq基因分型方法是比较示在确定由ANRS能力验证样品的面板，在面板的实验室样品已成功扩增100％耐药突变准确。精度也评估对C亚型病毒，在南部非洲最主要的亚型的临床标本。该方法是准确的C亚型的样品，因为它是对亚型A和B，但是，如果该方法将在世界上CRF02_AG是普遍存在的其它部分中使用，有必要对引物，因为该方法的修改未能扩增被证明具有CRF02_AG面板样品之一。可替换地，简并引物组对所有M组病毒33敏感，36可以使用在区域，进行亚型分布更加异构38。

反转录和PCR的灵敏度可提高从更高容量的血浆，如500毫升提取的RNA。等离子体可以centrifuged在21000×g离心90分钟，在进行所描述的那样的QIAamp病毒RNA提取试剂盒小型的协议之前以浓缩的病毒颗粒。

如图所示，该新方法具有它产生对个体患者的管理的综合报告一个附加的优点。这些报告是一个整合的基因型，免疫学和病毒学监测数据以及临床和治疗史从RegaDB。这是伴随着电阻档的详细解释化验后病人的临床病史同样详细的审查，以及治疗建议。使用一个专科医师审阅报告及患者提供治疗建议提供了急需的导师为执业护士以及临床医生经验不足，谁正越来越多地提供抗逆转录南非作为对任务转变世界卫生组织建议的一部分。这些临床报告已经证明是有效的教具为临床医生提供在药物抗性管理很少或没有经验。从患者的角度来看，我们的方法减少了前往中央网站访问专科艾滋病毒服务。

因此，作为一个整体所描述的协议提供了一个很好的平台，让艾滋病病毒耐药性的管理可以整合，以低廉的成本，为照顾爱滋病病毒感染人士未能艺术的统一体。可用于流行病学目的所产生的数据，以评估药物抗性，在社会的发展和传播。产生的POL片段的大小是比较复杂的系统发育分析，将产生更好的了解疫情在居群水平不够好。

Disclosures

加强卫生系统和艾滋病病毒治疗失败（HIV-：这项工作是由威康信托基金会（082384/Z/07/Z），欧盟（2007年147-790 SANTE），美国中心疾病支持通过CAPRISA（项目名称控制TFC）），以及瑞士南非联合研究计划（SSJRP）有权授予研究“瑞士普罗特/南非：蛋白质生物信息资源开发的重要的健康相关的病原体”。RL是支持的威康信托基金（批准号090999 / Z / 09 / Z轴）的资助者在研究设计，数据收集和分析，发布的决定，或准备稿子没有作用。作者宣称没有竞争的财务权益。

Acknowledgments

作者要感谢谁做这项工作可能所有的同事，尤其是玛雅人Balamane，伊丽莎白·约翰斯顿白，沙龙Sjoblom，格雷格 - 奥尔丁Zakhona Gumede，Xolile Kineri，Phindile Mabaso，Lungisa Ndwandwe，詹姆斯·加维，加文·科布，铣三Maphanga，Terusha切提，Kevi奈杜，安德鲁Skingsley，凯瑟琳·斯托特和Lungani Ndwandwe。作者还要感谢卫生署和谁工作赫拉比撒艾滋病治疗和护理方案非洲中心人员的全体人员。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Superscript III 1st strand Synthesis kit Life Technologies 18080051 Reverse Transcription
SATURN/LiFE Technologies Custom Primers Life Technologies 4473517 PCR
Platinum Taq Life Technologies 10966026 PCR
PureLink QUICK PCR Purification Kit Life Technologies K310002 PCR
Viroseq ABBOTT 4J94-20 Reverse Transcription and PCR
Agarose Tablets (Dnase/Rnase free) BIOLINE BIO-41027 PCR
TBE Buffer MERCK 1.06177.2500 PCR
O'Range Ruler 200 bp DNA Ladder Fermentas FE SM0633 PCR
Novel Juice GeneDireX LD001-1000 PCR
MiniBis Bioimaging System DNR Bioimaging Systems Ltd Gel Documentation
Power Pac 300  BIORAD Gel Electrophoresis
Big Dye Terminator Kit version 3.1 Life Technologies 4337456 Sequencing
Arrays Life Technolgies 4319899 Sequencing
PoP Life Technologies 4363785 Sequencing
10x EDTA Buffer Life Technologies 402824 Sequencing
Formamide Life Technologies 4311320 Sequencing
5x Sequencing Buffer Life Tecgnologies 4336697 Sequencing
3130 xl Genetic Analyzer Life Technologies Sequencing
GeneAmp PCR System 9700 Life Technologies RT/PCR/Sequencing
Centrifuge 5804 EPPENDORF Sample Processing
Centrifuge 5415R EPPENDORF RNA Extraction
Centrifuge 5415R EPPENDORF RT and PCR
Centrifuge 5415D EPPENDORF PCR Product Clean up
Centrifuge 5810 EPPENDORF Sequencing Clean up
Picofuge BIORAD C1301-230V RT and PCR
Vortex Genius 3 IKA RNA extraction and reagent preparation
Vortex mixer IKA Sequencing Cleanup
NanoDrop 2000 UV/VIS spectrophotometer ThermoScientific DNA quantification 
3 M Sodium Acetate MERCK 567422 Sequencing Clean up
Absolute Ethanol MERCK SAAR2233540LP Sequencing Cleanup
1.5 ml SARSTEDT Tubes BIODEX 72.692.005 RNA Extraction
2 ml SARSTEDT  Tubes BIODEX 72.693.005 RNA Extraction
2 ml Collection tubes SCIENTIFIC GROUP MCT-200-NC/S RNA Extraction
Optical MicroAmp 96-well reaction plates Life Technologies N8010560 Sequencing
200 µl 8 Strip StarPCR Tubes with attached flat caps STAR Lab - supplied by CELTIC A1402-3700 RT and PCR
200 µl PCR individual tubes Scientific Group CR/3745 RT and PCR
Geneious  Biomatters Sequence analysis
Internet Access Preferrably high speed
Web resources
hivdb.stanford.edu Stanford University Drug reistance analysis
http://bioafrica.mrc.ac.za:8080/regadb-ui/RegaDB SATuRN database
http://bioafrica.mrc.ac.za/tools/pppweb.html SATuRN Sequence quality tool

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