Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

على طريقة الرصد بأسعار معقولة HIV-1 المقاومة للمخدرات المناطق ذات الموارد المحدودة

Published: March 30, 2014 doi: 10.3791/51242
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 2, 3, 1, 4, 1
1Africa Centre for Health and Population Studies, College of Health Sciences, University of KwaZulu-Natal, Durban, South Africa, 2Unit D11, Jembi Health Systems, 3Academic Medical Center, Department of Global Health, Amsterdam Institute for Global Health and Development (AIGHD), University of Amsterdam, 4Division of Infectious Diseases and Geographic Medicine, Centre for AIDS Research, Stanford Medical School

Summary

اختبار مقاومة العقاقير عن HIV-1 الأفراد المصابين بالفشل العلاج المضاد للفيروسات الرجعية (ART) يمكن أن توجه العلاجات المستقبلية وتحسين نتائج العلاج. سوف تحسين النتائج الصحية الفردية والسكان في انتشار فيروس نقص المناعة البشرية عالية ولكن المناطق ذات الموارد المحدودة تتطلب في نهاية المطاف بأسعار معقولة وفي متناول التنميط الجيني مقاومة المخدرات وطرق التفسير.

Abstract

HIV-1 المقاومة للأدوية لديه القدرة على تقديم تنازلات جدية فعالية وتأثير العلاج المضاد للفيروسات الرجعية (ART). مع استمرار برامج ART في أفريقيا جنوب الصحراء الكبرى لتوسيع والأفراد على ART ينبغي مراقبتها عن كثب لظهور المقاومة للأدوية. مراقبة مقاومة الدواء ينتقل إلى تتبع انتقال سلالات فيروسية مقاومة بالفعل إلى ART أمر بالغ الأهمية أيضا. للأسف، واختبار مقاومة المخدرات لا تزال لا يمكن الوصول إليها بسهولة في المناطق ذات الموارد المحدودة، وذلك لأن التنميط الجيني مكلفة وتتطلب المختبرات المتطورة والبنية التحتية لإدارة البيانات. يوصف وصول مفتوحة الوراثي طريقة الرصد مقاومة المخدرات لإدارة الأفراد وتقييم مقاومة الأدوية المرسلة. يستخدم الأسلوب البرمجيات الحرة ومفتوحة المصدر لتفسير أنماط المقاومة للأدوية وتوليد تقارير المريض الفردية. بروتوكول التنميط الجيني لديه معدل التضخيم أكبر من 95٪ للعينات البلازما مع مركباتتحميل iral> 1،000 HIV-1 نسخ الحمض النووي الريبي / مل. يقلل من حساسية بشكل كبير للأحمال الفيروسية <نسخ 1،000 HIV-1 RNA / مل. تم التحقق من صحة الطريقة الموصوفة هنا ضد وسيلة لمقاومة HIV-1 اختبار المخدرات التي وافقت عليها إدارة الأغذية والأدوية الأمريكية (FDA)، وطريقة التنميط الجيني Viroseq. وتشمل القيود المفروضة على الطريقة الموصوفة هنا حقيقة أن لا يتم ذلك آليا وأنه فشل أيضا في تضخيم تعميم المؤتلف شكل CRF02_AG من لجنة التحقق من صحة العينات، على الرغم من أنه تضخيم فرعية A و B من لوحة نفسها.

Introduction

وقد وباء فيروس نقص المناعة البشرية في جنوب أفريقيا تتطور بسرعة 1 مع زيادة مصاحبة في الأسي الأفراد على العلاج المضاد للفيروسات الرجعية (ART)، وخاصة في جنوب أفريقيا 2، 3. كدليل على تأثير الوبائية من برامج العلاج على نطاق واسع في الحد من حدوث 4 وزيادة متوسط ​​العمر المتوقع في المناطق ذات الموارد المحدودة (ريال) 5 لا تزال تتراكم، وسيتم تكثيف الجهود لزيادة التغطية ART. تطور مبادئ توجيهية نحو استخدام العلاج كأداة الوقاية 6 و 7 في إطار برامج اختبار وعلاج يعني أن العدد المطلق للأفراد على العلاج وزيادة. وأعداد كبيرة من الأفراد يكون على ART لفترات أطول من الوقت حيث بلغ متوسط ​​العمر المتوقع للأفراد على ART تقترب من أن السكان غير مصاب بفيروس نقص المناعة البشرية 8. تطوير وانتقال المقاومة للأدوية فيروس نقص المناعة البشرية لديها علوةيس اعتبرت تهديدا للإنجازات ART 9-12. وبالتالي، هناك حاجة لمراقبة أكثر صرامة ومراقبة مقاومة الدواء كما تم تهيئتها المزيد من الأفراد على ART.

مقاومة العقاقير الوراثي اختبار (GRT) وقد استخدم بنجاح في البلدان المتقدمة، سواء لمراقبة وكذلك رصد HIV-1 المقاومة للعقاقير في الأفراد الذين يحصلون على ART. في هذه الأماكن، وقد تم دمج GRT في الرعاية المتواصلة لHIV-1 الأفراد المصابة. يوصي معظم المبادئ التوجيهية الدولية GRT للبالغين أو الأطفال المرضى بالفشل ART (الخط الأول والخط الثاني) 13-15، طب الأطفال المرضى المعرضين لمنع انتقال الفيروس من الأم إلى طفلها في وقت لاحق نظم لكن إصابة 16، وضبط مع مستويات عالية من المقاومة للأدوية التي تنتقل بين الأفراد المصابين بشكل حاد 13-15. ومع ذلك، فإن المتطلبات التكلفة، والتكنولوجيا، والبنية التحتية حدت تطبيق خطة العمل الأطريةtation نهج مماثل لمراقبة مقاومة الدواء في ريال.

علاج فيروس نقص المناعة البشرية في جنوب أفريقيا والمبادئ التوجيهية الرصد لا ننصح حاليا استخدام حمولتها في اختيار التوجيهية لART للأفراد فشلها تطوير علاجات الخط الأول 17. يتم تبديل الأفراد تستند في المقام الأول على الفيروسي (HIV-1 الحمض النووي الريبي الحمل الفيروسي) معلمات. ولكن في عام 2012، نشرت جمعية أطباء فيروس نقص المناعة البشرية للجنوب الأفريقي أول المبادئ التوجيهية المضادة للفيروسات القهقرية الأفريقية اختبار مقاومة العقاقير الجنوبية 18. ننصح هذه المبادئ التوجيهية اختبار GRT لجميع الكبار فشلها الخط الأول والخط الثاني ART وللرضع المصابين والأطفال المعرضين للالأم إلى الطفل 18. ومع ذلك، لا ينصح GRT 18 للأفراد المصابين بشكل حاد بسبب عدم وجود الأدلة الحالية لمستويات عالية من المقاومة للأدوية التي تنتقل في أفريقيا الجنوبية 19-29. ومن المتوقع أن بعض هذه التوصيات سوف تكون متكاملة مع مرور الوقت إلى عطر الوطنيةatment ورصد المبادئ التوجيهية من مختلف البلدان في المنطقة. بالفعل، في المبادئ التوجيهية للعلاج في جنوب أفريقيا عام 2013 والآن هناك توصية GRT في وقت فشل الخط الثاني للكبار وفي وقت الأولى أو الخط الثاني فشل نظام يستند PI-30 للأطفال.

فقد تبين أن إدراج GRT في المبادئ التوجيهية للعلاج في جنوب أفريقيا سيكون يحتمل محايدة التكلفة. والنظر في تكلفة أدوية الخط الثاني والتي هي نظام نسبيا أكثر تكلفة من أدوية الخط الأول، وذلك باستخدام GRT لتحديد المرضى الذين يحتاجون حقا إلى أن تنتقل إلى العلاج السطر الثاني لا ينتج أي تكلفة إضافية للبرنامج. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أيضا تحديد GRT أسباب أخرى للفشل، والحفاظ على خيارات العلاج وتوليد المعلومات حول أنماط المقاومة الناشئة 31. وبالتالي، فمن الضروري خفض تكلفة أساليب مراقبة مقاومة الدواء إلى أبعد من ذلك من أجل تحسين الوصول، وجودة من الرعايةد النتائج.

هنا، نقدم طريقة GRT مصممة لاستخدام عامة (مفتوحة المصدر) لالاشعال النسخ العكسي، وسلسلة تفاعل البلمرة (PCR) والتسلسل (الجدول 1)، وكذلك البرمجيات مفتوحة المصدر في الغالب لتفسير مقاومة المخدرات. لإدارة السريرية، وأثنى على البروتوكول من خلال استعراض التقارير وطريقة تفسير شامل مع أخصائي المختبر التقرير مقاومة الأدوية مع الالتزام بالقرب من المبادئ التوجيهية المعاملة الوطنية. وينقسم البروتوكول إلى أربعة عناصر مختلفة؛ 1) حمض النووي الريبي فيروس نقص المناعة البشرية (RNA) استخراج، 2) عكس النسخ والبلمرة المتسلسل (PCR) والتضخيم من الأهداف الفيروسية، 3) وضع تسلسل و4) أساليب المعلوماتية الحيوية لتحليل المخططات الاستشرابية، والمحاذاة، كرأيشن وتفسير البيانات التسلسل.

Protocol

1. حمض Ethylenediaminetetraacetic (EDTA) تجهيز كامل الدم

ملاحظة: يمكن معالجة الدم مباشرة بعد ويمكن تخزين مجموعة من عند 4 درجة مئوية لمدة لا تزيد عن 24 ساعة.

  1. العمل في مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية، والسماح للEDTA عينة دم كامل لتصل إلى درجة حرارة الغرفة.
  2. لكل عينة، وتسمية ما يكفي cryovials مع تحديد عينة (ID)، تخزين المواد (البلازما)، والتاريخ.
  3. الطرد المركزي العينات لمدة 10 دقيقة في 1،000 ز س. لا تستخدم المكابح لإيقاف الطرد المركزي. وسوف تسفر هذه ثلاث طبقات (من الأعلى إلى الأسفل): البلازما، كريات الدم البيضاء (معطف الشهباء) - طبقة رقيقة جدا - والكريات الحمراء، بما في ذلك الصفائح الدموية.
  4. نضح بعناية طاف (البلازما) وقسامة 500 مل في كل cryovial. الحرص على عدم تعطيل طبقة الخلايا (معطف الشهباء) أو نقل أي الخلايا.
  5. تخزين في -80 درجة مئوية لحين الحاجة إليها لاستخراج الحمض النووي الريبي أو الشروع في استخراج الحمض النووي الريبي على الفور.
ve_title "> 2. استخراج الحمض النووي الريبي

  1. إعداد ورقة عمل مع استخراج معرفات من العينات ليكون استخراجه بما في ذلك الضوابط البلازما الإيجابية والسلبية.
  2. لكل عينة ليكون استخراجه، تسمية 1.5 مل العقيمة أنبوب microcentrifuge مع معرف عينة، وتاريخ استخراج و"RNA". تسمية أيضا تجميع عمود وجمع أنبوب فضلا عن 2 مل أنبوب microcentrifuge تحتوي على العمل مع حل تحلل الأرقام المقابلة من ورقة العمل الاستخراج.
  3. العمل في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية، إضافة إلى 200 عينة ميكرولتر المقابلة 2 مل أنبوب microcentrifuge من حل تحلل العمل.
  4. دوامة جيدا واحتضان لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  5. بعد 10 دقيقة، الطرد المركزي أنبوب لفترة وجيزة.
  6. إضافة 800 مل من الايثانول المطلق إلى كل من الأنابيب.
  7. مزيج من قبل vortexing النبض لفترة وجيزة الطرد المركزي.
  8. نقل 600 ميكرولتر من هذا الحل إلى الجمعية أنبوب العمود / جمع المقابلة. أجهزة الطرد المركزي في 6000 سز لمدة 1 دقيقة.
  9. نقل عمود إلى أنبوب جمع جديدة وتجاهل أنبوب جمع القديمة التي تحتوي على الترشيح. كرر الخطوة أعلاه 2.8 (أعلاه) مرتين أكثر من ذلك.
  10. إضافة 500 ميكرولتر غسل العازلة AW1 إلى كل عمود وأجهزة الطرد المركزي في 6000 x ج لمدة 1 دقيقة.
  11. تجاهل الترشيح وجمع أنبوب ونقل العمود إلى أنبوب المجموعة الجديدة.
  12. إضافة 500 ميكرولتر كان AW2 العازلة وأجهزة الطرد المركزي في 20،000 x ج لمدة 3 دقائق. كرر الخطوة 2.11.
  13. أجهزة الطرد المركزي في أنبوب جمع جديدة في 20،000 x ج لمدة 2 دقيقة إضافية.
  14. تجاهل العمود الترشيح ومكان في 1.5 مل أنبوب microcentrifuge.
  15. إضافة 60 ميكرولتر العازلة AVE (ريبونوكلياز المياه مجانا) إلى منتصف العمود ضمان أن كنت لا تستغني السائل على جانب من العمود.
  16. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 دقيقة.
  17. أجهزة الطرد المركزي في 6000 x ج لمدة 2 دقيقة.
  18. تجاهل العمود وغطاء 1.5 مل أنابيب microcentrifuge.
  19. العينات هي الآن جاهزة للreverحد ذاته النسخ.
  20. إذا الاختبار هو المراد تنفيذها على الفور، وتخزين عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 ساعة. ومع ذلك، إذا الاختبار هو يتأخر ثم ضع في -80 درجة مئوية على الفور. ملحوظة: لا تجميد / الذوبان العينات أكثر من 3X.

3. تحضير كاشف عن النسخ العكسي

  1. قبل البدء، وحساب حجم كل من الكواشف اللازمة لعدد من العينات التي يتم معالجتها بما في ذلك، والضوابط البلازما الإيجابية والسلبية. أيضا إضافة عنصر تحكم كاشف.
  2. باستخدام كميات محسوبة من الخطوة 3.1 (أعلاه)، وإعداد ثلاثي الفوسفات ديوكسي ريبونوكليوتيد مزيج (dNTP) التمهيدي في بيئة نظيفة، معقمة 200 ميكرولتر PCR أنبوب تليها فترة وجيزة نبض vortexing ل. يجب أن يكون كل عينة 0.5 ميكرولتر من عكس التمهيدي RT21 و 0.5 ميكرولتر من dNTP، انظر الجدول 2.
  3. قسامة 1.0 ميكرولتر من مزيج dNTP التمهيدي إلى 200 ميكرولتر أنابيب PCR.
  4. إعداد الناسخ العكسي (RT) مزيج الانزيم بإضافة 1 μ، ل المخزن المؤقت النسخ العكسي 10X، 1 ميكرولتر من 0.1M DTT و 2 ميكرولتر من 25MM MgCl 2 إلى أنبوب العقيمة المتبعة من قبل vortexing لفترة وجيزة الطرد المركزي، انظر الجدول 3.
  5. إضافة 0.5 ميكرولتر كل من الانزيمات RNAseOUT ومرتفع الثالث عكس الناسخ إلى أنبوب مزيج انزيم ثم اضغط على أنبوب برفق لمزج.
  6. الحفاظ على أنابيب مع يمزج dNTP التمهيدي ومزيج الانزيم على كتلة الباردة والانتقال إلى محطة الحمض النووي الريبي.

4. النسخ العكسي

  1. إضافة 6 ميكرولتر من عينة الحمض النووي الريبي إلى المزيج أنبوب dNTP التمهيدي تليها vortexing لفترة وجيزة إلى المزيج.
  2. بعد إضافة الحمض النووي الريبي، والانتقال إلى غرفة PCR مع كل dNTP / التمهيدي / مزيج الحمض النووي الريبي وRT أنزيم خلط أنابيب على كتلة أو الجليد الباردة.
  3. لفترة وجيزة الطرد المركزي أنابيب dNTP / مزيج التمهيدي / الحمض النووي الريبي (من الخطوة 4.2) ووضعها في thermocycler.
  4. الحرارة عند 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لتفسد الحمض النووي الريبي.
  5. بارد بسرعة إلى 4 درجات مئوية، وعقد ل2دقيقة.
  6. وقفة thermocycler في حين لا يزال في 4 درجات مئوية؛ إخراج الأنابيب.
  7. بسرعة إضافة 5 ميكرولتر من مزيج الانزيم مع الحفاظ على أنابيب على كتلة الباردة.
  8. المزيج بلطف من خلال الاستفادة من أنبوب الطرد المركزي لفترة وجيزة ثم الأنابيب والعودة إلى thermocycler.
  9. عقد الأنابيب عند 50 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة على عكس نسخ الحمض النووي الريبي تليها تمسخ انزيم في 85 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لوقف النسخ العكسي.
  10. بارد إلى 37 درجة مئوية. في أقرب درجة الحرارة يحصل على 37 درجة مئوية، وقفة واتخاذ أنبوب من thermocycler.
  11. بسرعة إضافة 0.5 ميكرولتر من ريبونوكلياز H للأنابيب والعودة إلى thermocycler.
  12. عقد عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة ثم تبرد إلى 4 درجة مئوية.
  13. الحمض النووي التكميلية ([كدنا]) يمكن استخدامها على الفور أو يمكن تخزينها في -20 درجة مئوية أو أكثر برودة لحين الحاجة إليها. ومع ذلك، يجب أن يكون التخزين على المدى الطويل من [كدنا] في -80 درجة مئوية.

5. تحضير كاشف للPCR

  1. Befoإعادة بدء، وحساب حجم كل من الكواشف اللازمة لعدد من العينات التي يتم معالجتها والضوابط. بالإضافة إلى الضوابط الثلاثة (ايجابي، سلبي، والكاشف)، يمكنك أيضا إضافة عنصر تحكم PCR (الحمض النووي فيروس نقص المناعة البشرية). يمكن تحضير أول وثاني يمزج PCR الجولة في وقت واحد ومزيج الرئيسي الثاني تخزينها في -20 درجة مئوية لحين الحاجة إليها. ويمكن تخزين يمزج لحوالي 8 ساعة.
  2. إضافة 18.4 ميكرولتر المياه، و 2.5 ميكرولتر 10X العازلة، 1.0 ميكرولتر MgCl 2، 0.5 ميكرولتر dNTPs، و 0.25 ميكرولتر من كل من الاشعال كما هو مبين في الجدول رقم 4 ودوامة.
  3. إضافة 0.1 ميكرولتر من البلاتين طق البلمرة (5U/μl) وتخلط بلطف أنبوب عن طريق التنصت عليه.
  4. قسامة 23 ميكرولتر من مزيج الرئيسي إلى 200 ميكرولتر أنابيب PCR.
  5. مع أنابيب مزيج الرئيسي على كتلة الجليد الباردة أو الانتقال إلى غرفة PCR.

6. PCR المتداخلة

  1. إضافة 2 ميكرولتر من [كدنا] إلى 23 ميكرولتر من 1 الجولة PCR masteص المزيج.
  2. إغلاق الأنابيب، ووضع العينات في thermocycler واستخدام الدراجات PCR الظروف التالية: 94 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة و 30 دورات من 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية و 58 درجة مئوية لمدة 20 ثانية، و 72 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة، تليها ارشادية النهائي في 72 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة كما هو مبين في الشكل 1.

الشكل 1
الشكل 1. ظروف الدراجات PCR المتداخلة. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.

  1. انتقل إلى المرحلة 2 PCR مستديرة أو تخزين 1 المنتجات PCR جولة في -20 درجة مئوية أو أكثر برودة حتى المطلوبة في مرحلة لاحقة.
  2. ل2nd جولة PCR، إضافة 2 ميكرولتر من المنتج PCR الجولة 1 إلى 23 ميكرولتر من 2 PCR الجولة مزيج الرئيسي لد استخدام البرنامج PCR نفسه على الشكل 1.

7. هلام الكهربائي

  1. إعداد هلام
    1. إضافة 0.5 غرام من قرص الاغاروز إلى قارورة زجاجية 250 مل وإضافة 50 مل من العازلة 1X TBE إلى القارورة.
    2. الحرارة في الميكروويف لدرجة الغليان؛ دوامة متكرر (تقريبا كل 30 ثانية) حتى solubilized تماما. استخدام قبضة السيليكون أو السيليكون قفاز الفرن لفهم قارورة ساخنة. الحل الاغاروز يمكن غلي من القارورة بسهولة جدا حتى عن كثب مراقبة هذه العملية.
    3. يبرد في درجة حرارة الغرفة لحوالي 10 دقيقة.
    4. صب الاغاروز في علبة تحتوي على هلام الصب مشط الحجم المناسب؛ هلام جاهزة للاستخدام في حوالي 20-30 دقيقة.
    5. وضع الجل في غرفة الكهربائي وتشغيل على النحو الموصى به من قبل الشركة المصنعة.
  2. هلام الكهربائي والتصور.
    1. دوامة عصير رواية لمدة 10 ثانية قبل استخدامها.
    2. تمييع 1 ميكرولتر من عصير الرواية مع 5 ميكرولتر من Dعينة NA والمزيج.
    3. تمييع 3 ميكرولتر من عصير الرواية مع 3 ميكرولتر من الوزن الجزيئي علامة والمزيج.
    4. تحميل يمزج من أقسام و7.2.2 7.2.3 (أعلاه) وتشغيل هلام في 100 فولت و 400 أمبير لمدة 40 دقيقة لتقييم التضخيم PCR.
    5. يمكن تصور التضخيم إيجابية تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية كما غليان 1،315 شظية، الشكل 2.

    الرقم 2
    الشكل 2. تأكيد هلام من PCR التضخيم باستخدام 1٪ الاغاروز الكهربائي للهلام و200 غليان سلم. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.

    1. يجب أن يكون هناك تضخيم في الضوابط السلبية وكاشف، مما يدل على عدم وجود تلوث.

    8. PCR تنظيف المنتج

    1. استعدادا للتفاعل التسلسل، يتم تنظيف المنتجات PCR الجولة الثانية إيجابية حتى باستخدام طقم تنقية PureLink PCR.
    2. إضافة 80 ميكرولتر من العازلة ملزمة عالية تعمل القطع (B3) إلى 20 ميكرولتر من الناتج PCR ومزيج ماصة.
    3. إضافة عينة مختلطة مع العازلة ملزمة لعمود الدوران في أنبوب جمع.
    4. أجهزة الطرد المركزي في العمود 10،000 x ج لمدة 1 دقيقة. نقل العمود في أنبوب المجموعة الجديدة.
    5. غسل العمود مع 650 ميكرولتر من الاحتياطي اغسل مع الايثانول.
    6. أجهزة الطرد المركزي في العمود 10،000 x ج لمدة 1 دقيقة. نقل العمود في أنبوب المجموعة الجديدة.
    7. أجهزة الطرد المركزي العمود في أقصى سرعة لمدة 2-3 دقيقة لإزالة أي غسل العازلة المتبقية.
    8. وضع عمود الدوران في أنبوب 1.7 مل نظيفة شطف المرفق مع عدة.
    9. إضافة 40 ميكرولتر من شطف العازلة لمركز العمود واحتضان العمود في درجة حرارة الغرفةه لمدة 1 دقيقة.
    10. أجهزة الطرد المركزي العمود في أقصى سرعة لمدة 2 دقيقة (> 10،000 x ج).
    11. أنبوب يحتوي على شطف المنتج PCR المنقى على استعداد للالتسلسل. تجاهل العمود.
    12. تحديد تركيز ونوعية الحمض النووي باستخدام معمل NanoDrop.
    13. إذا توجد مرافق التسلسل في المنزل المتاحة، يمكن أن ترسل المنتجات PCR المنقى إلى مختبر التسلسل التجارية في هذه المرحلة.

    9. ردود الفعل التسلسل

    1. والتسلسل منتجات PCR باستخدام كبيرة عدة صبغ فاصل الإصدار 3.1 و 4 الاشعال لكل عينة (اثنان إلى الأمام واثنين العكسي). يتم عرض تسلسل التمهيدي في الجدول 2. لذلك، بعد تشغيل التسلسل، وسوف يكون كل عينة أربعة سلاسل ليتم تجميعها في contig.
    2. إعداد ردود الفعل التسلسل كما هو مبين في الجدول رقم (5) لكل من الاشعال الأربعة.
    3. مزيج المخزن المؤقت التسلسل والاشعال من قبل vortexing قبل الاستخدام.
    4. مزجالمياه، العازلة والتمهيدي قبل إضافة تسلسل صبغ كبيرة. مزيج من قبل vortexing.
    5. المزيج بلطف مزيج الرئيسي بعد إضافة كبيرة صبغ مزيج التسلسل بواسطة قلب الأنبوب أو التنصت عليه برفق.
    6. قسامة 9 ميكرولتر من مزيج الرئيسي في لوحة البصرية 96 جيدا.
    7. من أجل تشغيل 24 عينة / لوحة، وإعداد لوحة على النحو المبين أدناه الشكل 3.

    الرقم 3
    الرقم 3. تمثيل مخطط لوحة 96 جيدا مع 12 عينات من المرضى يجري التسلسل مع كل 4 الاشعال (RTC1F، RTC2R، RTC3F، وRTC4R). اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.

    1. إضافة 1.0 ميكرولتر من عينة الحمض النووي (~ 20-40 نانوغرام)، وتغطي لوحة معن لاصق وغطاء من الألمنيوم ومن ثم مزجها بلطف.
    2. أجهزة الطرد المركزي في 3000 x ج لمدة 1 دقيقة. إزالة الغطاء الألومنيوم وإضافة حصيرة الختم المطاطي.
    3. وضع لوحة على thermocycler وتشغيل البرنامج الدراجات التالية هو مبين في الشكل (4).

    الرقم 4
    الشكل 4. ظروف الدراجات PCR لتسلسل. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.

    1. عندما ينتهي PCR، وتنظيف المنتج التسلسل فورا.

    10. التسلسل تنظيف

    1. لكل رد فعل التسلسل، مزيج 50 ميكرولتر الإيثانول المطلق و 5 ميكرولتر 3 M خلات الصوديوم.
    2. باستخدام ماصة الأقنية، إضافة 55 و# 956؛ لتر من محلول خلات الصوديوم / ETOH إلى كل بئر.
    3. ختم الآبار مع غطاء الألومنيوم لاصقة، وضمان أن كل بئر مختومة بشكل صحيح.
    4. أجهزة الطرد المركزي في 3000 x ج لمدة 20 دقيقة.
    5. بعد 20 دقيقة، وإزالة الغطاء وقلب لوحة، في الحركة السلسة واحد، على الأنسجة مختبر مطوية (لا فرقعة للتخلص من طاف حيث سيؤدي ذلك إلى طرد بيليه!)
    6. أجهزة الطرد المركزي لوحة مقلوب على النسيج نفسه في 150 x ج لمدة 2 دقيقة.
    7. على الفور إضافة 150 ميكرولتر الباردة ETOH 70٪. لا تأخير إضافة الإيثانول في هذه الخطوة.
    8. ختم بنفس غطاء الألومنيوم لاصقة ودوامة.
    9. أجهزة الطرد المركزي في 3000 x ج لمدة 5 دقائق.
    10. عكس لوحة الصعود إلى الأنسجة مطوية جديدة وأجهزة الطرد المركزي في 150 x ج مقلوب لمدة 1 دقيقة.
    11. بعد الطرد المركزي، ووضع كشف في thermocycler وجففها في 50 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة.
    12. مرة واحدة لوحات جافة، وختم ذلك مع أغطية رقائق لاصقة، والتفاف في احباط وتخزينها في -20 ˚ مئوية لتصبح جاهزة للمضي قدما وايال الكهربي التسلسل.
    13. عندما تصبح جاهزة للتسلسل، ويحل منتجات تنظيف التسلسل في 10 مل مرحبا-دي الفورماميد، وتفسد الحمل الكهربائي ل.

    11. المعلوماتية الحيوية

    1. الجمعية تسلسل
      1. اطلاق برنامج Geneious.
      2. إنشاء مجلد العمل لتخزين متواليات.
      3. استيراد الملفات ABI التي تم إنشاؤها بواسطة آلة التسلسل إلى مجلد العمل باستخدام أداة الاستيراد. سوف Geneious تخصيص نسبة نقاط الجودة لكل تسلسل المستوردة.
      4. متواليات مفتوحة مع نقاط جودة> 70٪ عن طريق النقر المزدوج عليها.
      5. يجب فتح كل ملف في نافذة جديدة. يقوم البرنامج يدل على جودة في كل موقف النوكليوتيدات للاللوني للجودة تسلسل باستخدام أشرطة زرقاء خفيفة. وارتفاع شريط، وأفضل جودة المكالمة القاعدة.
      6. باستخدام المؤشر، حدد القسم منتصف تسلسل تاركة الغايات، التي عادة ما تكون ذات نوعية رديئة. انقر على زر استخراج لاستخراج المنطقة مع تسلسل نوعية جيدة.
      7. تحديد كافة تسلسل أربعة المستخرجة لكل عينة وتجميعها ضد تسلسل المرجعية.
      8. تفقد تسلسل تجميعها لضمان أن كنت في إطار القراءة الصحيحة. إذا كنت في إطار القراءة الصحيحة، ينبغي بداية البروتياز تبدأ مع الأحماض الأمينية التالية: PQITLW. وبداية RT تبدأ مع PISPIE.
      9. استخراج المنطقة contig تغطي بداية PR إلى 300 RT كودون. أثناء هذه العملية، وأيضا تحقق من الإدراج أو الحذف.
      10. تذهب من خلال تسلسل إجماع contig المستخرجة، وتحديد أي غموض والتحقق من المواقف مع قواعد مختلطة عن طريق فحص جودة (التماثل، ارتفاع، خلفية والكتفين من المناطق المحيطة) من دعوات القاعدة.
      11. تحديد تسلسل إجماع وانقر على زر استخراج لإنشاء ملف منفصل من تسلسل إجماع من الاشعال أربعة وابيل بشكل مناسب.
      12. تصدير تسلسل إلى مجلد التخزين الاحتياطي على الكمبيوتر أو مجلد شبكة.
    2. تقييم جودة التسلسل (HIVDB)
      1. تحليل تسلسل باستخدام برنامج HIVDB في http://hivdb.stanford.edu .
      2. التحقق من وجود الحذف والإدراج في ملخص البيانات والتأكد من أن تسلسل يغطي جميع 99 البروتيني (PR) الكودونات و1 300 الكودونات RT.
      3. تحقق من وجود أي أبرزت ضمان الجودة (QA) قضايا في كل من المناطق العلاقات العامة وRT، مثل الكودونات توقف، والتحولات الإطار، مواقف غامضة والمخلفات غير عادية.
    3. مراقبة الجودة التسلسل
      1. الانفجار تسلسل جديدة ضد قاعدة بيانات تسلسل المحلية من شوط السابقة.
      2. إذا كان التسلسل الجديد هو> 97٪ على غرار أي تسلسل في قاعدة البيانات، ينبغي إعادة النظر في جميع مراحل البروتوكول، بدءا من تحليل تسلسل والعودة الى استخراج الحمض النووي الريبي الذي يكفل له أنه لم تكن هناك شكا مزيج (عينة التبديل، mislabeling) أو التلوث.
      3. إذا تم تحديد أي مشاكل، كرر تحليل كل من عينات القديمة والجديدة من مرحلة استخراج الحمض النووي الريبي.
      4. إذا كان تسلسل لا تزال> 97٪ مماثلة، مراجعة تاريخ المريض لتقييم أية صلة وبائية بين الأفراد.
    4. تحليل النشوء والتطور
      1. محاذاة كل تسلسل من قاعدة البيانات باستخدام برنامج ClustalW في Geneious.
      2. التحقق يدويا محاذاة تسلسل المنحرفة والحذف والإدراج وتعديل وفقا لذلك.
      3. بناء شجرة النشوء والتطور باستخدام PHYML، Geneious شجرة باني أو بناة شجرة أخرى في Geneious.
      4. دراسة لعينات شجرة مع أطوال فرع قصيرة.
      5. مراجعة عينات مع أطوال قصيرة لفرع تلوث محتمل.

    12. REGA DB المعلوماتية

    1. تسلسل تحميل
      1. تسجيل الدخول إلى RegaDB باستخدام اسم مستخدم وكلمة مرور فريدة.
      2. في القائمة المنسدلة، تحت رقم المريض، حدد "يبدأ ب".
      3. إضافة معرف المريض وتحديد الفرد الذي هو التركيب الوراثي وسيتم تحميلها.
      4. في القائمة إلى اليسار، وحدد "عزل الفيروسي".
      5. من بين الخيارات التي تجري عزل الفيروسية حدد "إضافة".
      6. أدخل التاريخ عينة، عينة ID، ID تسلسل وتاريخ تسلسل.
      7. حدد "اختيار ملف" ثم انتقل إلى الملف FASTA تسلسل وسيتم تحميلها.
      8. بعد تحديد ملف FASTA وسيتم تحميلها، انقر على التحميل.
      9. مرة واحدة يظهر تسلسل تحميلها في مربع النوكليوتيدات تحت يحدد تسلسل وتواريخ، انقر فوق الزر موافق في أسفل اليمين من النافذة.
      10. التحقق من وجود العلاقات العامة وRT المحاذاة البروتين بالنقر على زر البروتين واختيار إما PR أو RT.
      11. التحقق من وجود الطفرة المقاومة للأدوية من خلال النقر على زر المقاومة. وهذا يعطيلك ملامح المقاومة من ثلاث خوارزميات: الأيدز وستانفورد وHIVDB RegaDB.
    2. الجيل التقرير باستخدام REGA
      1. تسجيل الدخول إلى RegaDB باستخدام اسم المستخدم وكلمة المرور الخاصة بك فريدة من نوعها.
      2. في القائمة المنسدلة، تحت رقم المريض، حدد "يبدأ ب".
      3. إضافة معرف المريض وتحديد الفرد الذي التقرير هو أن تتولد.
      4. في القائمة إلى اليمين، حدد عزل الفيروسية.
      5. من بين الخيارات التي تجري عزل الفيروسية انقر على "عرض".
      6. انقر مرتين على عزل الفيروسية التي تريد لإنشاء تقرير.
      7. على نافذة عزل الفيروسية، انقر فوق علامة التبويب الفيروسية على تقرير عزل.
      8. حدد خوارزميات لتفسير النمط الجيني من القائمة المنسدلة ثم حدد قالب التقرير للاستخدام.
      9. مرة واحدة ويتم اختيار خوارزمية والقالب، انقر على زر "إنشاء".
      10. تحميل وثيقة RTF ولدت.
      11. فتح الخانات تفعلcument بوصفها وثيقة كلمة.
      12. تغيير حجم التخطيط تاريخ العلاج.
      13. بعد التخطيط، إضافة المقطع "الرسم البياني السريرية وتفسير المقاومة".
      14. باستخدام البيانات على الطاولة والمقاومة على الرسم البياني السريرية، إضافة وصف المقاومة الشخصي المريض بدءا من تاريخ معاملة المريض، والأدوية التي عزل الفيروسي هو مقاومة. أيضا إضافة وصف لتحميل المريض الفيروسية وCD4 + لمحات من عدد خلايا التخطيط.
      15. إرسال التقرير إلى أمراض المعدية (ID) المتخصص للمراجعة وتوصيات بشأن التعامل مع المرضى في المستقبل. هذه العملية هي أيضا مرحلة هامة جدا لضمان الجودة. ، يمكن تحديد أي أخطاء في التركيب الوراثي أو inconsistences في تاريخ المعاملة لمحات الفيروسية والمناعية ومراجعتها قبل إرسال التقرير النهائي، مع جميع التوصيات، إلى الطبيب إدارة المريض.

Representative Results

كان أسلوب التحقق من صحة تعديل طريقة ذكرت سابقا 20. طريقة التنميط الجيني Viroseq، التي تمت الموافقة عليها من قبل ادارة الاغذية والعقاقير، وكان يستخدم كأسلوب المرجعية في التحقق من الصحة. واستخدم فريق من عينات اختبار الكفاءة التي تم الحصول عليها من وكالات الوطني الفرنسي للأبحاث حول الإيدز والتهاب الكبد الفيروسي (الأيدز) في المقارنة الأولية بين الطريقتين. كانت أساليب التنميط الجيني اثنين 100٪ متطابقة في تحديد جميع الطفرات الهامة سريريا المرتبطة مقاومة المخدرات كما تفسرها برنامج HIVDB للعينات التي تم تضخيمها بنجاح من قبل كل من الأساليب. كما هو مبين في الجدول رقم 6، كانت متواليات النوكليوتيدات من ثلاثة ازواج 99.5٪ متطابقة. كان تسلسل الأحماض الأمينية وتوقع متطابقة 100٪. لا يمكن تضخيم عينة واحدة من كل خمسة بنجاح من قبل Viroseq. بالإضافة إلى عينة لا تضخيمها من قبل Viroseq، فشل الأسلوب في المنزل لتضخيم العينة الثانية التي تم إنذارأن يكون الفيروس المؤتلف المتداولة (CRF02_AG) من خلال Viroseq. وكانت العينات الثلاث التي تتضخم مع كل من منهجيات النوع الفرعي B (عينتين) والنوع الفرعي A (عينة واحدة).

الرقم 5
الرقم 5. استخدام الجار الالتحاق بالعمل شجرة HKY القيام به كجزء من ضمان الجودة التسلسل. هناك أربعة أزواج / مجموعات من التسلسل مع المسافات الوراثية قصيرة جدا. المسافة الجينية بين RES655 وRES655_1 (عينات نفس التسلسل في أيام مختلفة) هو 0.003. لهو الخطأ المحتملة مع الزوج RES637_1/RES638 والمسافة الجينية قصيرة جدا (0.075) لعينات من مختلف الأفراد غير المرتبطة وبائيا. هناك RES637 آخر على الشجرة مع مسافة 0.075 بالمقارنة مع RES638_1. تشير الكتلة CQ01/CQ02 أن العينتينمن لوحة مكررة من نفس العينة. أنها الكتلة جنبا إلى جنب مع النوع الفرعي B تسلسل إشارة تؤكد النوع الفرعي المعين من قبل أداة REGA تصنيف الفرعي. CQ05 CQ04 وتتجمع مع الأنواع الفرعية A و G على التوالي، في حين أن الأداة REGA التصنيف الفرعي صنفها كما ألف وCRF02_AG على التوالي. آخر أداة مفيدة للتصنيف الفرعي فيروس نقص المناعة البشرية وإعادة التركيب هو SCUEL، والذي يتوفر في http://www.datamonkey.org. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.

واستخدم فريق من خمس عينات لتقييم دقة الأسلوب في المنزل. تم إنشاء عشرة المورثات تكرار لكل من العينات الخمس. باستخدام محلل الوراثية 16 شعرية 3130xl، تم إنشاؤها 48 من 50 المورثات من 24 أشواط، أعدت في نفس اليوم. لجميع العينات الخمس، كان تسلسل الأحماض الأمينية توقع 100٪ متطابقة بين مكررات. لتسلسل الحمض النووي، الكان يحرث> 99٪ تشابه البشرى.

خلال العامين الأولين من استخدام هذا الأسلوب، تكررت ستين العينات عشوائيا من استخراج الحمض النووي الريبي إلى التسلسل. لم تكن هناك فروق ذات دلالة إحصائية بين درجة جودة التسلسل وعدد القواعد مختلطة بين مكررات. وكانت كل من النوكليوتيدات والأحماض الأمينية مقارنات البشرى لستين زوجا أكبر من 99٪ متطابقة. وبالتالي كانت الطفرات المقاومة للأدوية لجميع أزواج متطابقة 100٪.

خفض التكاليف

تم تخفيض حجم رد الفعل لRT، PCR وتسلسلها من قبل ما لا يقل عن النصف، نسبة إلى طريقة الأصلي 20، 32، من دون المساومة على جودة تسلسل ولدت. هذا تمكين انخفاض في تكلفة 50٪ للمراحل RT PCR و.

والطريقة الجديدة مصممة أصلا للعمل مع ستة تسلسل التمهيدي لتسلسل جميع الكودونات 99 من الجين البروتيني والكودونات 300 الأولى من الناسخ العكسي الجين 20 و 32. أساليب مماثلة أيضا استخدام ستة إلى ثمانية الاشعال 33، 34. وقد استخدمت بعض الأساليب التي نشرت مؤخرا تقل عن ستة الاشعال، على الرغم من أن في بعض الأحيان تسلسل البروتيني والجينات RT seprately 35، 36. سعينا للحد من عدد من الاشعال التسلسل من ست إلى أربع، (الشكل 6)

الرقم 6
الرقم 6. المقارنة بين متواليات متجاورة من ستة مقابل أربعة الاشعال التسلسل لتوليد تسلسل بول 1197 سنة مضت تغطي جميع 99 HIV-1 الكودونات البروتيني والكودونات 300 الأولى من الجين الناسخ العكسي.242/51242fig6highres.jpg "الهدف =" _blank "> اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.

وتمت مقارنة متواليات من مجموعة من 17 عينات ولدت من ستة الاشعال لتسلسل ولدت بعد استبعاد اثنين الاشعال (MAW46 وRTY). كانت سلالة فرعية 14 C، وهما النوع الفرعي B، وسلالة واحدة A. لم تكن هناك فروق ذات دلالة إحصائية في درجات الجودة التسلسل. مرة أخرى، كان متوسط ​​الهوية البشرى بين 17 زوجا من الحمض النووي 99٪ و 100٪ على مستوى الأحماض الأمينية. وبالتالي، والحد من الاشعال التسلسل من ست إلى أربع أدى إلى انخفاض في تكلفة تسلسل بمقدار الثلث تقريبا.

كان فقط أداة البرمجيات الاحتكارية المستخدمة في هذا البروتوكول Geneious لتجميع تسلسل. أدوات تفسير مقاومة المخدرات، وكذلك التقرير أدوات توليد كلها، وأدوات الوصول المفتوح مجانا. وهذا يقلل من تكلفة إضافية من خلال القضاء على التكاليف المرتبطة باستخدام البرمجيات المملوكة. علاوة على ذلك، collectivيسمح التفاوض البريد الكواشف لهذا البروتوكول ليتم تعبئتها في عدة لسهولة الوصول من تقنيات الحياة، وتتوفر مثل تقنيات زحل / الحياة التنميط الجيني طريقة 37. وعلاوة على ذلك، يمكن لأعضاء زحل وصول إلى الكواشف بسعر مخفض.

إعداد السريرية

وقد تم تنفيذ البروتوكول هو موضح في رصد ومراقبة مقاومة الدواء في مجتمع ريفي في كوازولو ناتال. وقد تم توليد ما مجموعه 604 المورثات من العينات السريرية بين ديسمبر 2010 و مايو 2013 بمعدل 95٪ من التضخيم للعينات مع الأحمال الفيروسية> 1،000 RNA نسخة / مل. تمت الموافقة على هذه الدراسة المقاومة للأدوية فيروس نقص المناعة البشرية السريرية من قبل لجنة أخلاقيات البحوث الطبية الحيوية في جامعة كوازولو ناتال (المرجع BF052/10) ولجنة البحوث الصحية من وزارة كوازولو ناتال الصحة (المرجع HRKM 176/10). وقد تم توليد تقارير المريض وإرسالها إلى العياداتلإدارة المريض.

تم إنشاء اثنتين وسبعين (72) المورثات أيضا كجزء من مراقبة المنقولة دراسة مقاومة الجراثيم للأدوية، متداخلة ضمن دراسة ترصد كبيرة المحتملين على أساس السكان فيروس نقص المناعة البشرية. وكانت العينات الأولية وخز إبرة الدم الكامل التي تم جمعها في microtubes EDTA. في التنميط الجيني كان هناك معدل التضخيم من 79٪ 19. تم الحصول على موافقة الأخلاق لالتنميط الجيني لعينات من دراسة ترصد من جامعة كوازولو ناتال جنة أخلاقيات البحوث الطبية الحيوية (المرجع BE066107).

اسم التمهيدي تسلسل طول اتجاه المركز HXB2
MAW-26 TTGGAAATGTGGAAA GGAAGGAC 23 إلى الأمام 2028-2050 الجولة 1 PCR
RT-21 CTGTATTTCAGCTATC AAGTCCTTTGATGGG 31 عكس 3539-3509 الجولة 1 PCR
الموالية لل1 TAGAGCCAACAGCCC الاول 20 إلى الأمام 2147-2166 2nd جولة PCR
RT-20 CTGCCAATTCTAATTC TGCTTC 22 عكس 3462-3441 2nd جولة PCR
RTC1F ACCTACACCTGTCAA CATAATTG 23 إلى الأمام 2486-2508 التسلسل
RTC2R TGTCAATGGCCATTG TTTAACCTTTGG 27 عكس 2630-2604 التسلسل
RTC3F CACCAGGGATTAGAT ATCAATATAATGTGC 30 إلى الأمام 2956-2994 التسلسل
RTC4R CTAAATCAGATCCTAC ATACAAGTCATCC 29 عكس 3129-3101 التسلسل
RT-Y GTGTCTCATTGTTTAT ACTAGG 22 عكس 2967-2946 التسلسل
MAW-46 TCCCTCAGATCACTC TTTGGCAACGAC 27 إلى الأمام 2251-2277 التسلسل

الجدول 1. عكس النسخ، PCR، وتسلسل الاشعال مخصص المستخدمة في توليد جزء 1197 سنة مضت بول تغطي كل 99 HIV-1 البروتياز الكودونات والكودونات 300 الأولى من الجين trascriptase عكسي.

RT21 (5pmol/ml) 0.5 0.2
dNTP (10 ملي) 0.5 0.4
مجموع 1

الجدول 2. dNTP / مزيج التمهيدي للتفاعل النسخ العكسي.

= "0" بطانة الخلايا = "0" هوامش الخلية = "0">
كاشف حجم (مل) / رد فعل تركيز / رد فعل
أول الاحتياطي ستراند (10X) 1 1
MgCl 2 (25 ملم) 2 4
التلفزيون الرقمي الأرضي (0.1 M) 1 0.008
RNaseOUT (40 U / مل) 0.5 16
مرتفع الثالث عكس الناسخ (200U/ml) 0.5 8
مجموع 5

الجدول 3. انزيم خلط للتفاعل النسخ العكسي.

كاشف حجم (مل) / رد فعل تركيز النهائي / رد الفعل
DEPC المياه المعالجة 18.4 - </ الدفتيريا>
PCR العازلة (10X) 2.5 1
زجاج مجان 2 (50 ملي) 1 2
مزيج dNTP (10 ملي) 0.5 0.2
التمهيدي مارد (5 بمول / مل) 0.25 0.05
التمهيدي العكسي (5 بمول / مل) 0.25 0.05
البلاتين طق البلمرة (5 U / مل) 0.1 0.02
المجموع الفرعي 23 -

الجدول 4. مزيج الرئيسي لPCR المتداخلة.

كاشف حجم (مل) / رد فعل تركيز / رد فعل
DEPC المياه المعالجة 6.1
التسلسل العازلة (5X) 2 1
التمهيدي (3.2 بمول / مل) 0.5 0.16
صبغ فاصل كبير مزيج تسلسل 0.4 -
مجموع 9

الجدول 5. مزيج الرئيسي لردود الفعل التسلسل.

Viroseq محاسبين ٪ NA التشابه
ID عينة النوع الفرعي نقاط الجودة PR الطفرات الطفرات RT النوع الفرعي نقاط الجودة الطفرات PR RT الطفرات
CQ01 B 99.9 M46L، I54L، V82A، L90M D67N، T69D، K70R، M184V، T215V، K219Q B 99.2 M46L، I54L، V82A، L90M D67N، T69D، K70R، M184V، T215V، K219Q 100
CQ02 B 99.5 M46L، I54L، V82A، L90M D67N، T69D، K70R، M184V، T215V، K219Q B 99.5 M46L، I54L، V82A، L90M D67N، T69D، K70R، M184V، T215V، K219Q 100
CQ03 NA NA NA NA NA NA
CQ04 CRF02_AG 98.4 I54V، V82F، I84V M41L، L74I، L210W، T215Y، V108I، Y181C NA NA NA NA NA
CQ05 A 99.7 K103N A 93 K103N 100

الجدول 6. بالنتيجه المقارنةTS من تحليل موازية بين طريقة التنميط الجيني Viroseq وطريقة في المنزل باستخدام لوحة العينات المقدمة من الأيدز.

Discussion

وقد وصفت عدة طرق منخفضة التكلفة في المنزل في الجهود الرامية إلى محاولة لجعل فيروس نقص المناعة البشرية مقاومة المخدرات التنميط الجيني أكثر بأسعار معقولة 33، 34، 36. ليس هناك شك في الحاجة إلى إدماج اختبار مقاومة المخدرات في استمرارية الرعاية للأفراد على العلاج المضاد للفيروسات الرجعية في المناطق ذات الموارد المحدودة. ومع ذلك، فإن معظم الطرق ذكرت التركيز على تطبيق المقاومة للأدوية التنميط الجيني في مراقبة مقاومة الدواء على مستوى السكان. طريقة التنميط الجيني زحل / الحياة تكنولوجيز هو بروتوكول متكامل لمراقبة ورصد مقاومة المخدرات. وقد تم تصميم هذا الأسلوب ليكون في متناول تنفيذ بروتوكول معظمها مفتوحة المصدر وفتح الموارد المعلوماتية الحيوية الوصول لتفسير مقاومة المخدرات وتوليد تقارير للإدارة السريرية.

وقد تبين من خلال المقارنة مع ادارة الاغذية والعقاقير المعتمدة Viroseq طريقة التنميط الجيني لتكوندقيقة في تحديد الطفرات المقاومة للأدوية من لجنة من الأيدز عينات اختبار الكفاءة، في 100٪ من عينات المختبر التي تم وحة تضخيم بنجاح. تم تقييم دقة أيضا على عينات سريرية من الفيروسات C سلالة، وسلالة الأبرز في جنوب أفريقيا. كان الأسلوب كما دقيقة على عينات سلالة C كما كان على سلالة A و B. ومع ذلك، إذا كان الأسلوب سوف تستخدم في أجزاء أخرى من العالم حيث CRF02_AG هو السائد، هناك حاجة لتعديل الاشعال منذ الأسلوب فشل في تضخيم واحدة من العينات التي تم وحة تبين أن لها CRF02_AG. بدلا من ذلك، مجموعة المنحطة الاشعال حساسة لجميع الفئات M الفيروسات 33، 36 يمكن استخدامها في المناطق التي تكون فيها توزيع فرعي هو أكثر غير متجانسة 38.

ويمكن زيادة حساسية النسخ العكسي وPCR عن طريق استخراج الحمض النووي الريبي من كميات أعلى من البلازما، مثل 500 مل. يمكن الطرد المركزي البلازماuged في 21،000 x ج لمدة 90 دقيقة لتركيز الجسيمات الفيروسية قبل الشروع في البروتوكول كما هو موضح من قبل QIAamp الفيروسية استخراج الحمض النووي الريبي عدة صغيرة.

كما هو مبين، وطريقة جديدة لديه ميزة إضافية أنه ينتج تقارير شاملة لإدارة الفرد المريض. هذه التقارير هي توحيد النمط الجيني، والمناعية وبيانات الرصد فيروسية وكذلك التاريخ الطبي والعلاج من RegaDB. ويرافق هذا من قبل المختبر تفسير مفصل للوضع المقاومة يعقبه استعراض مفصل على قدم المساواة من التاريخ الطبي للمريض وكذلك توصيات العلاج. استخدام الأطباء المتخصصين لاستعراض التقارير وتقديم توصيات لعلاج المرضى يوفر الإرشاد التي تشتد الحاجة إليها للممارسين ممرضة وكذلك الأطباء عديمي الخبرة، الذين يوفرون بشكل متزايد ART في جنوب أفريقيا كجزء من توصيات منظمة الصحة العالمية لتحويل المهمة. هذه السريريةوقد أظهرت تقارير أن تكون الوسائل التعليمية الفعالة بالنسبة للأطباء مع خبرة قليلة أو معدومة في إدارة المقاومة للأدوية. من وجهة نظر المريض، ويقلل من أسلوبنا الحاجة إلى السفر إلى مواقع مركزية للوصول إلى خدمات فيروس نقص المناعة البشرية المتخصصة.

وبالتالي، فإن بروتوكول صفها ككل توفر منصة جيدة من خلالها فيروس نقص المناعة البشرية وإدارة المقاومة للأدوية يمكن أن تكون متكاملة، بتكلفة معقولة، إلى استمرارية الرعاية للأفراد المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية فشلها ART. البيانات التي تم إنشاؤها يمكن استخدامها لأغراض الوبائية لتقييم تطور وانتقال المقاومة للأدوية في المجتمع. حجم جزء بول ولدت جيدة بما يكفي لمزيد من التحليل النشوء والتطور المعقدة والتي سوف تنتج فهم أفضل لهذا الوباء على مستوى السكان.

Disclosures

وأيد هذا العمل من قبل ويلكوم ترست (082384/Z/07/Z)، الاتحاد الأوروبي (2007 SANTE 147-790)، والمركز الأمريكي لمكافحة الأمراض عن طريق CAPRISA (عنوان المشروع: تعزيز الأنظمة الصحية وعدم معالجة فيروس نقص المناعة البشرية (HIV- TFC))، وبرنامج البحوث المشتركة الأفريقية السويسري الجنوبية (SSJRP) منحة بحثية بعنوان "السويسري بروت / جنوب أفريقيا: البروتين تنمية الموارد المعلوماتية الحيوية لمسببات الأمراض ذات الصلة بالصحة هام". يتم اعتماد RL من قبل ويلكوم ترست (رقم المنحة 090999 / Z / 09 / Z). وكان الممولين أي دور في تصميم الدراسة وجمع البيانات وتحليلها، قرار نشر أو إعداد المخطوطة. الكتاب تعلن أي المصالح المالية المتنافسة.

Acknowledgments

فإن الكتاب أود أن أنوه جميع الزملاء الذين جعلوا هذا العمل ممكنا، وخصوصا مايا Balamane، اليزابيث جونستون الأبيض، شارون Sjoblom، جريج أوردنج Zakhona غوميد، Xolile Kineri، Phindile ماباسو، Lungisa Ndwandwe، جيمس غارفي، جافين كوب، سينزو Maphanga، Terusha شيتي ، Kevi نايدو، أندرو Skingsley، كاثرين ستوت، وLungani Ndwandwe. فإن الكتاب أود أيضا أن أشكر جميع العاملين في وزارة الصحة والعاملين في مركز أفريقيا الذين يعملون معاملة فيروس نقص المناعة البشرية هالابيسا وبرنامج الرعاية.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Superscript III 1st strand Synthesis kit Life Technologies 18080051 Reverse Transcription
SATURN/LiFE Technologies Custom Primers Life Technologies 4473517 PCR
Platinum Taq Life Technologies 10966026 PCR
PureLink QUICK PCR Purification Kit Life Technologies K310002 PCR
Viroseq ABBOTT 4J94-20 Reverse Transcription and PCR
Agarose Tablets (Dnase/Rnase free) BIOLINE BIO-41027 PCR
TBE Buffer MERCK 1.06177.2500 PCR
O'Range Ruler 200 bp DNA Ladder Fermentas FE SM0633 PCR
Novel Juice GeneDireX LD001-1000 PCR
MiniBis Bioimaging System DNR Bioimaging Systems Ltd Gel Documentation
Power Pac 300  BIORAD Gel Electrophoresis
Big Dye Terminator Kit version 3.1 Life Technologies 4337456 Sequencing
Arrays Life Technolgies 4319899 Sequencing
PoP Life Technologies 4363785 Sequencing
10x EDTA Buffer Life Technologies 402824 Sequencing
Formamide Life Technologies 4311320 Sequencing
5x Sequencing Buffer Life Tecgnologies 4336697 Sequencing
3130 xl Genetic Analyzer Life Technologies Sequencing
GeneAmp PCR System 9700 Life Technologies RT/PCR/Sequencing
Centrifuge 5804 EPPENDORF Sample Processing
Centrifuge 5415R EPPENDORF RNA Extraction
Centrifuge 5415R EPPENDORF RT and PCR
Centrifuge 5415D EPPENDORF PCR Product Clean up
Centrifuge 5810 EPPENDORF Sequencing Clean up
Picofuge BIORAD C1301-230V RT and PCR
Vortex Genius 3 IKA RNA extraction and reagent preparation
Vortex mixer IKA Sequencing Cleanup
NanoDrop 2000 UV/VIS spectrophotometer ThermoScientific DNA quantification 
3 M Sodium Acetate MERCK 567422 Sequencing Clean up
Absolute Ethanol MERCK SAAR2233540LP Sequencing Cleanup
1.5 ml SARSTEDT Tubes BIODEX 72.692.005 RNA Extraction
2 ml SARSTEDT  Tubes BIODEX 72.693.005 RNA Extraction
2 ml Collection tubes SCIENTIFIC GROUP MCT-200-NC/S RNA Extraction
Optical MicroAmp 96-well reaction plates Life Technologies N8010560 Sequencing
200 µl 8 Strip StarPCR Tubes with attached flat caps STAR Lab - supplied by CELTIC A1402-3700 RT and PCR
200 µl PCR individual tubes Scientific Group CR/3745 RT and PCR
Geneious  Biomatters Sequence analysis
Internet Access Preferrably high speed
Web resources
hivdb.stanford.edu Stanford University Drug reistance analysis
http://bioafrica.mrc.ac.za:8080/regadb-ui/RegaDB SATuRN database
http://bioafrica.mrc.ac.za/tools/pppweb.html SATuRN Sequence quality tool

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shao, Y., Williamson, C. The HIV-1 epidemic: low- to middle-income countries. Cold Spring Harbor Persp. Med. 2, (2012).
  2. Mutevedzi, P. C., et al. Scale-up of a decentralized HIV treatment programme in rural KwaZulu-Natal, South Africa: does rapid expansion affect patient outcomes. Bull. World Health Organ. 88, 593-600 (2010).
  3. Houlihan, C. F., et al. Cohort profile: Hlabisa HIV treatment and care programme. Int. J. Epidemiol. 40, 318-326 (2011).
  4. Tanser, F., Barnighausen, T., Grapsa, E., Zaidi, J., Newell, M. L. High coverage of ART associated with decline in risk of HIV acquisition in rural KwaZulu-Natal. South Africa. Science. 339, 966-971 (2013).
  5. Bor, J., Herbst, A. J., Newell, M. L., Barnighausen, T. Increases in adult life expectancy in rural South Africa: valuing the scale-up of HIV treatment. Science. 339, 961-965 (2013).
  6. Montaner, J. S., et al. The case for expanding access to highly active antiretroviral therapy to curb the growth of the HIV epidemic. Lancet. 368, 531-536 (2006).
  7. Granich, R. M., Gilks, C. F., Dye, C., De Cock, K. M., Williams, B. G. Universal voluntary HIV testing with immediate antiretroviral therapy as a strategy for elimination of HIV transmission: a mathematical model. Lancet. 373, 48-57 (2009).
  8. Johnson, L. F., et al. Life expectancies of South african adults starting antiretroviral treatment: collaborative analysis of cohort studies. PLoS Med. 10, (2013).
  9. Blower, S., Ma, L., Farmer, P., Koenig, S. Predicting the impact of antiretrovirals in resource-poor settings: preventing HIV infections whilst controlling drug resistance. Curr. Drug Targets. 3, 345-353 (2003).
  10. Geretti, A. M. Epidemiology of antiretroviral drug resistance in drug-naive persons. Curr. Opin. Infect. Dis. 20, 22-32 (2007).
  11. Larder, B. A., Darby, G., Richman, D. D. HIV with reduced sensitivity to zidovudine (AZT) isolated during prolonged therapy. Science. 243, 1731-1734 (1989).
  12. Erice, A., et al. Brief report: primary infection with zidovudine-resistant human immunodeficiency virus type 1. N. Engl. J. Med. 328, 1163-1165 (1993).
  13. Williams, I., et al. British HIV Association guidelines for the treatment of HIV-1-positive adults with antiretroviral therapy. HIV Med. 13 Suppl 2, 1-85 (2012).
  14. DHHS, US Panel on Antiretroviral Guidelines for Adults and Adolescents. Guidelines for the use of antiretroviral agents in HIV-1-infected adults and adolescents. , (2012).
  15. Vandamme, A. M., et al. European recommendations for the clinical use of HIV drug resistance testing: 2011 update. AIDS Rev. 13, 77-108 (2011).
  16. DHHS, US Panel on Antiretroviral Therapy and Medical Management of HIV-Infected Children. Guidelines for the Use of Antiretroviral Agents in Pediatric HIV Infection. , (2012).
  17. Department of Health. Clinical guidelines for the management of HIV & AIDS in adults and adolescents. , Department of Health. (2010).
  18. Conradie, F., et al. The 2012 southern African ARV drug resistance testing guidelines. S. Afr. J.HIV Med. 13, 162-167 (2012).
  19. Manasa, J., et al. Primary Drug Resistance in South Africa: Data from 10 Years of Surveys. AIDS Res. Hum. Retroviruses. 28, 558-565 (2012).
  20. Tshabalala, M., et al. Surveillance of transmitted antiretroviral drug resistance among HIV-1 infected women attending antenatal clinics in Chitungwiza, Zimbabwe. PLoS ONE. 6, (2011).
  21. Bartolo, I., et al. Antiretroviral drug resistance surveillance among treatment-naive human immunodeficiency virus type 1-infected individuals in Angola: evidence for low level of transmitted drug resistance. Antimicrob. Agents Chemother. 53, 3156-3158 (2009).
  22. Bartolo, I., et al. HIV-1 genetic diversity and transmitted drug resistance in health care settings in Maputo, Mozambique. J. Acquir. Immune Defic. Syndr. 51, 323-331 (2009).
  23. Hamers, R. L., et al. HIV-1 drug resistance in antiretroviral-naive individuals in sub-Saharan Africa after rollout of antiretroviral therapy: a multicentre observational study. Lancet Infect. Dis. 11, 750-759 (2011).
  24. Hamers, R. L., et al. HIV-1 Drug Resistance Mutations Are Present in Six Percent of Persons Initiating Antiretroviral Therapy in Lusaka, Zambia. J. Acquir. Immune Defic. Syndr. , (2010).
  25. Nwobegahay, J., Selabe, G., Ndjeka, N. O., Manhaeve, C., Bessong, P. O. Low prevalence of transmitted genetic drug resistance in a cohort of HIV infected naive patients entering antiretroviral treatment programs at two sites in northern South Africa. J. Med. Virol. 84, 1839-1843 (2012).
  26. Iweriebor, B. C., et al. Molecular epidemiology of HIV in two highly endemic areas of northeastern South Africa. Arch. Virol. 157, 455-465 (2012).
  27. Parboosing, R., Naidoo, A., Gordon, M., Taylor, M., Vella, V. Resistance to antiretroviral drugs in newly diagnosed, young treatment-naive HIV-positive pregnant women in the province of KwaZulu-Natal South Africa. J. Med. Virol. 83, 1508-1513 (2011).
  28. Nwobegahay, J. M., et al. Prevalence of antiretroviral drug resistance mutations and HIV-I subtypes among newly-diagnosed drug-naive persons visiting a voluntary testing and counselling centre in northeastern South Africa. J. Health Popul. Nutr. 29, 303-309 (2011).
  29. Nwobegahay, J., et al. Prevalence of drug-resistant mutations in newly diagnosed drug-naive HIV-1-infected individuals in a treatment site in the waterberg district, limpopo province). S. Afr. Med. J. 101 (2011), 335-337 (2011).
  30. Rosen, S., Long, L., Sanne, I., Stevens, W. S., Fox, M. P. The net cost of incorporating resistance testing into HIV/AIDS treatment in South Africa: a Markov model with primary data. J. Int. AIDS Soc. 14, 24 (2011).
  31. Dalai, S. C., et al. Evolution and molecular epidemiology of subtype C HIV-1 in Zimbabwe. AIDS. 23, 2523-2532 (2009).
  32. Chen, J. H., et al. In-house human immunodeficiency virus-1 genotype resistance testing to determine highly active antiretroviral therapy resistance mutations in Hong Kong. Hong Kong Med. 18, 20-24 (2012).
  33. Lee, C. K., et al. An in-house HIV genotyping assay for the detection of drug resistance mutations in Southeast Asian patients infected with HIV-1. J. Med. Virol. 84, 394-401 (2012).
  34. Aitken, S. C., et al. A Pragmatic Approach to HIV-1 Drug Resistance Determination in Resource-Limited Settings by Use of a Novel Genotyping Assay Targeting the Reverse Transcriptase-Encoding Region Only. J. Clin. Microbiol. 51, 1757-1761 (2013).
  35. Zhou, Z., et al. Optimization of a low cost and broadly sensitive genotyping assay for HIV-1 drug resistance surveillance and monitoring in resource-limited settings. PLoS One. 6, (2011).
  36. , Life Technologies. Life Technologies and SATuRN Collaborate to Increase Access to HIV Testing in Africa. , Available from: https://ir.lifetechnologies.com/releasedetail.cfm?releaseid=694585 (2012).
  37. Lihana, R. W., Ssemwanga, D., Abimiku, A., Ndembi, N. Update on HIV-1 diversity in Africa: a decade in review. AIDS Rev. 14, 83-100 (2012).

Tags

الطب، العدد 85، التكنولوجيا الطبية الحيوية، HIV-1، التهابات فيروس نقص المناعة البشرية، افيروس، الأحماض النووية، وعلم الوراثة، والعلاج المضاد للفيروسات الرجعية، ومقاومة المخدرات، والتنميط الجيني، وبأسعار معقولة
على طريقة الرصد بأسعار معقولة HIV-1 المقاومة للمخدرات المناطق ذات الموارد المحدودة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Manasa, J., Danaviah, S., Pillay,… More

Manasa, J., Danaviah, S., Pillay, S., Padayachee, P., Mthiyane, H., Mkhize, C., Lessells, R. J., Seebregts, C., de Wit, T. F. R., Viljoen, J., Katzenstein, D., De Oliveira, T. An Affordable HIV-1 Drug Resistance Monitoring Method for Resource Limited Settings. J. Vis. Exp. (85), e51242, doi:10.3791/51242 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter