Abstract
Odorant अणुओं एक सटीक और समन्वित तरीके से अपने लक्ष्य रिसेप्टर्स करने के लिए बाध्य. प्रत्येक रिसेप्टर एक विशिष्ट संकेत पहचानता है और मस्तिष्क के लिए इस जानकारी रिले. जैसे, घ्राण जानकारी धारणा और व्यवहार, गुण जांच दोनों को संशोधित करने, मस्तिष्क को सौंप दिया है निर्धारण कैसे. दिलचस्प है, सेलुलर पारगमन और transcriptional कारकों घ्राण रिसेप्टर न्यूरॉन के विविधीकरण में शामिल कर रहे हैं कि उभरते सबूत नहीं है. यहाँ हम एक मजबूत पूरे vivo में घ्राण रिसेप्टर न्यूरॉन संगठन परख प्रतिरक्षाविज्ञानी लेबलिंग विधि माउंट प्रदान करते हैं. इस पद्धति का उपयोग करके, हम विरोधी ELAV एंटीबॉडी, एक ज्ञात अखिल तंत्रिका मार्कर और Or49a-mCD8 :: GFP, विशेष रूप से विरोधी GFP एंटीबॉडी का उपयोग एनबीए न्यूरॉन में व्यक्त एक घ्राण रिसेप्टर न्यूरॉन के साथ सभी घ्राण रिसेप्टर न्यूरॉन्स की पहचान की.
Introduction
घ्राण प्रणाली गंध अणुओं की एक विशाल विविधता के बीच भेद करने के लिए और बाद में उच्च मस्तिष्क केन्द्रों के लिए जिसके परिणामस्वरूप जानकारी भेजने के लिए प्रयोग किया जाता है. इस इनपुट ठीक ऐसी खिलाने और संभोग 1-6 के रूप में मौलिक पशु व्यवहार को नियंत्रित करने के लिए प्रयोग किया जाता है. प्रत्येक घ्राण न्यूरॉन प्रकार odors की एक विशिष्ट सेट, घ्राण रिसेप्टर न्यूरॉन्स के विविधीकरण के साथ जुड़ा हुआ है के रूप में (ORN) एस उचित घ्राण प्रणाली समारोह 7 के लिए आवश्यक है.
ड्रोसोफिला आनुवंशिकी ORN विकास और शारीरिक समारोह 8-16 के साथ जुड़े आणविक तंत्र से जुड़े एकल कोशिका के स्तर जांच करने के लिए सक्षम बनाता है. ड्रोसोफिला एंटीना के पूरे माउंट immunostaining के अधिक से अधिक विस्तार में घ्राण रिसेप्टर न्यूरॉन्स के विविधीकरण में शामिल आणविक तंत्र (ORN) एस 7 को समझने के लिए हमें सक्षम है. इस के साथ साथ हम एसी के लिए एक सरल विधि के लिए एक व्यापक वर्णन प्रदानइस hieve.
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Protocol
1. सेब थाली तैयार
- 12.5 ग्राम अगर मिक्स, 125 एमएल 100% व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सेब का रस, 12.5 ग्राम ग्लूकोज, और 375 मिलीलीटर एच 2 ओ 1 से 2 मिनट के लिए मिश्रण माइक्रोवेव और 3 सेमी सेल संस्कृति डिश के लिए डालना. 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर
2. आनुवंशिक पार
- निम्नलिखित प्रतिनिधि आनुवंशिक पार का प्रयोग करें:
Or49a-mCD8 :: GFP / CYO एक्स 1118 डब्ल्यू
3. विच्छेदन और धुंधला प्रोटोकॉल
- मक्खी anesthetize और फिर एक संदंश का उपयोग कर इसे धारण करके खड़ी मक्खी सिर काट दिया.
- ध्यान से एक सेब प्लेट पर एंटीना युक्त हिस्से जगह है.
- ठीक विच्छेदन कैंची का उपयोग एंटीना के तीसरे खंड कट.
- एक गिलास नीचे संस्कृति पकवान के बीच करने के लिए () 0.1% ट्राइटन X-100 के साथ 0.1% PBST (पीबीएस में 4% paraformaldehyde) निर्धारण समाधान के 90 μl रखें.
- धीरे विच्छेदित antenn हस्तांतरणसीधे निर्धारण समाधान के लिए एक तेज सुई के साथ एई. यदि आवश्यक हो, शारीरिक रूप से सुई का उपयोग कर समाधान में एंटीना डूब.
- कमरे के तापमान (आर टी) पर 40 मिनट के लिए सेते हैं. एक ही थाली में रखते हुए उन्हें, (0.4% ट्राइटन X-100 के साथ पीबीएस) 0.4% PBST में से प्रत्येक में 3x 10 मिनट एंटीना धो लें. PBST समाधान निकालने और जोड़ने के लिए पीले रंग की युक्तियों का उपयोग करें. हर बार धोने समाधान के 90 μl का प्रयोग करें.
नोट: immunohistochemistry के दौरान एक प्रकार के बरतन में पकवान जगह नहीं है. डिश में समाधान को हटाने या जोड़ने से पहले, सुई का उपयोग डिश के केंद्र में सभी एंटीना लाने के लिए और ध्यान से पकवान के किनारे से समाधान जोड़ने या हटाने. - आरटी पर 20 मिनट के लिए 0.1% PBST में 5% सामान्य घोड़े सीरम के 90 μl के साथ एंटीना ब्लॉक.
- अवरुद्ध समाधान को हटाने के बाद, पहले से वर्णित के रूप में एक सिक्त कंटेनर में 4 डिग्री सेल्सियस पर 48 घंटे के लिए 5% घोड़े सीरम युक्त 0.1% PBST में प्राथमिक एंटीबॉडी के 90μl साथ एंटीना सेते
- 0.4% PBST में 10 मिनट 6x एंटीना धो लें.
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 48 घंटे के लिए 5% घोड़े सीरम युक्त 0.1% PBST में माध्यमिक एंटीबॉडी के 90 μl के साथ एंटीना सेते 0.4% PBST का उपयोग 6x 10 मिनट धो लें.
- , एंटीना माउंट जितना संभव हो उतना संस्कृति पकवान से PBST हटाने और धीरे - धीरे एंटीना को ग्लिसरॉल के दो अलग सांद्रता परिचय करने के लिए. सबसे पहले 1 से 2 मिनट के लिए पकवान करने के लिए 40% ग्लिसरॉल जोड़ने; तो इस को हटाने और 80% ग्लिसरॉल जोड़ें.
- ध्यान से पीला टिप का उपयोग संस्कृति पकवान से (80% ग्लिसरॉल सहित) एंटीना निकालने और एक स्लाइड पर उन्हें जगह है. धीरे शीर्ष पर एक coverslip जगह और नेल पॉलिश के साथ coverslip किनारों को सील. एंटीना अब प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा imaged होने के लिए तैयार हैं.
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Representative Results
विच्छेदन और निर्धारण दोनों जल्दी प्रदर्शन कर रहे हैं सुनिश्चित करना है कि इस प्रोटोकॉल के साथ सफलता प्राप्त करने में एक महत्वपूर्ण कारक है. ठीक कैंची और संदंश का प्रयोग भी महत्वपूर्ण है. Immunostaining के बाद, फ्लोरोसेंट लेबल एंटीना एक confocal खुर्दबीन के नीचे की जांच की गई. हम आम तौर पर एक 20x लेंस का उपयोग 1μm वर्गों ले. हम एनबीए Or49a-mCD8 :: GFP का उपयोग 7 ORNs लेबल और जंगली प्रकार एंटीना में एनबीए ORNs की संख्या गिनी. mCD8-GFP संवाददाता कोशिका झिल्ली ही सीमित नहीं है और इसलिए अभिव्यक्ति चित्रा GFP व्यक्त OR49a ORNs के 2 दर्शाती कोशिका झिल्ली में देखा. चित्रा 2 में विरोधी GFP एंटीबॉडी और विरोधी ELAV एक अखिल तंत्रिका मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया गया था का उपयोग कर एनबीए ORNs अभिव्यक्ति से पता चलता है. एंटीना प्रति एनबीए ORNs की औसत संख्या 20 है (एन = 8).
चित्रा 1: dissectio का सिंहावलोकनn प्रक्रिया.
चित्रा 2: एक सफलतापूर्वक विच्छेदित एंटीना के confocal जेड श्रृंखला के प्रोजेक्शन. न्यूरॉन्स का पता लगाने के लिए विरोधी ELAV एंटीबॉडी (सी) के रूप में दिखाया विशिष्ट odorant रिसेप्टर अभिव्यक्ति (बी) और विलय तस्वीर का पता लगाने के लिए एक अखिल तंत्रिका मार्कर (ए) और विरोधी GFP एंटीबॉडी के रूप में इस्तेमाल किया गया था.
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Discussion
हम वर्णन ड्रोसोफिला एंटीना के विच्छेदन सरल और एक प्रयोगशाला की स्थापना में प्रदर्शन करने के लिए आसान है. एक सफल विच्छेदन सुनिश्चित करने के लिए, यह ठीक धार कैंची का उपयोग करने के लिए आवश्यक है. विच्छेदित एंटीना immunostaining है, यह एंटीबॉडी समाधान के वाष्पीकरण से बचने के लिए एक नमी से भरे कंटेनर में उन्हें सेते के लिए महत्वपूर्ण है. विच्छेदित एंटीना समाधान में फ्लोट करने की प्रवृत्ति है. निर्धारण के दौरान पीबीएस में 0.1% ट्राइटन का प्रयोग और कदम अवरुद्ध समाधान में एंटीना की डुबकी सुविधा होगी और बेहतर धुंधला हो जाना सुनिश्चित करने के लिए. "गिलास नीचे संस्कृति पकवान" का प्रयोग immunostaining दौरान एंटीना के नुकसान को कम करने और प्रत्येक प्रयोग में इस्तेमाल किया एंटीबॉडी समाधान की छोटी मात्रा में (90 μl) सुनिश्चित कर सके.
Neuronal श्रेणी के विविधीकरण neurogenesis के एक केंद्रीय सुविधा है. इस शारीरिक प्रक्रिया घ्राण रिसेप्टर न्यूरॉन के एक बड़े सरणी जो इस्तेमाल घ्राण प्रणाली, (ORN) में उदाहरण हैकक्षाओं. Odorant रिसेप्टर अभिव्यक्ति और axonal लक्ष्यीकरण के साथ ORNs की एक विस्तृत विविधता की पीढ़ी को उच्च मस्तिष्क केन्द्रों के लिए गंध अणुओं से सूचना प्रसारण के लिए आवश्यक neuronal विविधता पैदा करने के लिए महत्वपूर्ण है. आणविक तंत्र अंतर्निहित ORN विविधीकरण के बारे में हमारी समझ को आगे बढ़ाने में हमारी पूरी माउंट एंटीना immunostaining प्रोटोकॉल एड्स.
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
इस अध्ययन से निजी विश्वविद्यालयों पर सामरिक अनुसंधान फाउंडेशन और हम वीडियो क्लिप को संपादित करने के लिए Ohtake Norihito धन्यवाद देना चाहूंगा हिंदुस्तान टाइम्स के लिए JSPS युवा वैज्ञानिक बी अनुदान के लिए MEXT समर्थित प्रोग्राम द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stemi DV4 dissection microscope | Zeiss | Stemi DV4 | |
| Glass bottom culture dishes | MatTek corporation | P35G-0-10-C | |
| Dissection scissor | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Rat anti-ELAV | Developmental Studies Hybridoma Bank | 7E8A10 | Dilution 1:200 |
| Mouse anti-GFP | Invitrogen | A11122 | Dilution 1:400 |
| Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 711-225-152 | Dilution 1:200 |
| Donkey Anti-Rat IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 712-165-150 | Dilution 1:200 |
References
- Christensen, T. A., White, J. Representation of olfactory information in the brain In The Neurobiology of Taste and Smell. , New York. 201-232 (2000).
- Ache, B. W. Towards a common strategy for transducing olfactory information. Sem. Cell Biol. 5, 55-63 (1994).
- Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction. C. elegans. Cell. 13, 515-527 (1993).
- Barth, A. L., Justice, N. J., Ngai, J. Asynchronous onset of odorant receptor expression in the developing zebrafish olfactory system. Neuron. 16, 23-34 (1996).
- Firestein, S. How the olfactory system makes sense of scents. Nature. 413, 211-218 (2001).
- Stockinger, P., et al. Neural circuitry that governs Drosophila male courtship behavior. Cell. 121, 795-807 (2005).
- Endo, K., et al. Chromatin modification of Notch targets in olfactory receptor neuron diversification. Nat Neurosci. 15, 224-233 (2011).
- Karim, M. R., Moore, A. W. Morphological analysis of Drosophila larval peripheral sensory neuron dendrites and axons using genetic mosaics. J Vis Exp. , (2011).
- Suh, G. S., et al. A single population of olfactory sensory neurons mediates an innate avoidance behaviour in Drosophila. Nature. 431, 854-859 (2004).
- Sachse, S., Galizia, C. G. Role of inhibition for temporal and spatial odor representation in olfactory output neurons: A calcium imaging study. J Neurophysiol. 87, 1106-1117 (2002).
- Hallem, E. A., Ho, M. G., Carlson, J. R. The molecular basis of odor coding in the Drosophila antenna. Cell. 117, 965-979 (2004).
- Vosshall, L. B., Wong, A. M., Axel, R. An olfactory sensory map in the fly brain. Cell. 102, 147-159 (2000).
- Couto, A., Alenius, M., Dickson, B. J. Molecular, anatomical and functional organization of the Drosophila olfactory system. Curr Biol. 15, 1535-1547 (2005).
- Clyne, P., et al. Odorant response of individual sensilla on the Drosophila antenna. Invert Neurosci. 3, 127-135 (1997).
- Vosshall, L. B., et al. A spatial map of olfactory receptor expression in the Drosophila antenna. Cell. 96, 725-736 (1999).
- Wang, J. W., et al. Two-photon calcium imaging reveals an odor-evoked map of activity in the fly brain. Cell. 112, 271-282 (2003).
