Abstract
Lugtstof molekyler binder til deres mål-receptorer på en præcis og koordineret måde. Hver receptor genkender et bestemt signal og relæer disse oplysninger til hjernen. Som sådan at bestemme, hvor olfaktoriske information overføres til hjernen, ændre både perception og adfærd, fortjener undersøgelse. Interessant, er der spirende tegn på, at celletransduktion og transkriptionsfaktorer er involveret i diversificeringen af olfaktoriske receptor neuron. Her giver vi en robust helhed mount immunologisk mærkning metode til at analysere in vivo olfaktoriske receptor neuron organisation. Ved hjælp af denne metode, vi identificeret alle olfaktoriske receptor neuroner med anti-ELAV antistof, en kendt pan-neurale markør og Or49a-mCD8 :: GFP, et olfaktoriske receptor neuron specifikt udtrykt i NBA neuron hjælp af anti-GFP antistof.
Introduction
Bruges det olfaktoriske system til at skelne mellem en enorm vifte af lugtmolekyler og efterfølgende at sende resulterende oplysninger til de højere centre i hjernen. Denne indgang anvendes til præcist at kontrollere grundlæggende dyreadfærd, såsom fodring og parring 1-6. Da hver olfaktoriske neuron type er forbundet med en bestemt sæt af lugte, diversificering af olfaktoriske receptor neuroner (ORN) s er afgørende for en ordentlig olfaktoriske system fungerer 7.
Drosophila genetik giver os mulighed for at udføre enkelt celle niveau efterforskning, der omfatter molekylære mekanismer, der er forbundet med ORN udvikling og fysiologiske funktion 8-16. Hele mount immunfarvning af Drosophila antenner har gjort det muligt for os at forstå nærmere de molekylære mekanismer involveret i diversificeringen af olfaktoriske receptor neuroner (ORN) s 7. Heri giver vi en omfattende beskrivelse af en simpel metode til at achieve dette.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Forbered æble plade
- Bland 12,5 g agar, 125 ml 100% kommercielt tilgængelige æblejuice, 12,5 g glucose og 375 ml H2O Mikroovn blandingen i 1 til 2 minutter og hæld til 3 cm celledyrkningsskål. Opbevares ved 4 ° C.
2.. Genetisk cross
- Brug følgende repræsentative genetiske indlæg:
Or49a-mCD8 :: GFP / CYO x w 1118
3.. Dissektion og farvningsprotokol
- Bedøver fluen og derefter skære fluen hovedet lodret ved at holde det ved hjælp af en pincet.
- Placer forsigtigt antenner indeholder del på et æble plade.
- Skær det tredje segment af antennen ved hjælp af fine dissektion saks.
- Placer 90 ul af fiksering opløsning (4% paraformaldehyd i 0,1% PBST (PBS med 0,1% Triton X-100)) til midten af en glasbund dyrkningsskål.
- Overføre forsigtigt dissekeret Antennae med en skarp kanyle direkte til fiksering løsning. Hvis det er nødvendigt, fysisk nedsænkes antenner i opløsningen ved hjælp af nål.
- Inkuber i 40 minutter ved stuetemperatur (RT). Vask antenner i 0,4% PBST (PBS med 0,4% Triton X-100), 3x 10 minutter i hver, holde dem i samme fad. Brug gule spidser til at fjerne og tilføje PBST løsning. Brug 90 ul af vaskeopløsningen hver gang.
BEMÆRK: Anbring ikke fadet i en shaker under immunhistokemi. Før opløsningen fjerne eller tilføje i skålen bringe alle antennerne i midten af skålen ved hjælp af nål og forsigtigt tilføje eller fjerne opløsningen fra kanten af skålen. - Bloker antenner med 90 pi 5% normalt hesteserum i 0,1% PBST i 20 minutter ved RT.
- Efter fjernelse af blokerende opløsning inkuberes antenner med 90μl af primære antistoffer i 0,1% PBST indeholdende 5% hesteserum i 48 timer ved 4 ° C i en fugtig beholder som beskrevet tidligere
- Vask antenner 6x 10 minutter i 0,4% PBST.
- Inkubér antenner med 90 pi af sekundære antistoffer i 0,1% PBST indeholdende 5% hesteserum i 48 timer ved 4 ° C. Vask 6x 10 minutter med 0,4% PBST.
- For at montere antenner, fjerne PBST fra dyrkningsskålen så meget som muligt og gradvis indføre to forskellige koncentrationer af glycerol til antenner. Først tilsættes 40% glycerol til fadet i 1 til 2 minutter; derefter fjerne dette og tilføje 80% glycerol.
- Træk forsigtigt antennerne (inklusive 80% glycerol) fra dyrkningsskålen hjælp gul spids og placere dem på et dias. Forsigtigt placere et dækglas på toppen og forsegle dækglasset kanterne med neglelak. Antennerne er nu klar til at blive afbildet ved fluorescensmikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sikring af, at både dissektion og fiksering udføres hurtigt, er en afgørende faktor for at opnå succes med denne protokol. Brug fine saks og pincet er også afgørende. Efter immunfarvning blev fluorescerende mærkede antenner undersøges under en konfokal mikroskop. Vi normalt tage 1 um sektioner ved hjælp af en 20x objektiv. Vi mærkede NBA 7 ORNs hjælp Or49a-mCD8 :: GFP og talte antallet af NBA ORNs i vildtype-antenne. Den mCD8-GFP reporter cellemembranen lokaliseret og så udtrykket ses i figur 2 udviser cellemembran OR49a ORNs udtrykker GFP. I figur 2 viser NBA ORNs ekspression under anvendelse af anti-GFP-antistof og anti ELAV blev anvendt som et pan-neural markør. Det gennemsnitlige antal NBA ORNs pr antenne er 20 (n = 8).
Figur 1: Overblik over dissection procedure.
Figur 2: Fremskrivning af konfokal Z-serie af et succesfuldt dissekeret antenne. For at detektere neuroner anti-ELAV antistof blev anvendt som et pan-neural markør (A) og anti-GFP-antistof til påvisning af specifikke odorantreceptor ekspression (B) og fusioneret billede som vist i (C).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dissektion af Drosophila antenne beskriver vi er enkel og let at udføre i laboratoriet. For at sikre en vellykket dissektion, er det vigtigt at anvende fine kanter saks. Mens immunfarvning det dissekerede antenne, er det vigtigt at inkubere dem i en fugt-fyldte beholder for at undgå fordampning af antistoffet løsning. Det dissekerede antenne har en tendens til at flyde i opløsningen. Brug 0,1% Triton i PBS under fiksering og blokering skridt vil lette nedsænkning af antennen i opløsningen, og at sikre en bedre farvning. Brug af "glasbund kultur fad" kunne reducere tabet af antenner under immunfarvning og sikre de små mængder (90 ul) antistof-løsning, der anvendes i hvert forsøg.
Neuronal klasse diversificering er et centralt element i neurogenese. Denne fysiologisk proces er eksemplificeret i det olfaktoriske system, der udnytter en bred vifte af olfaktoriske receptor neuron (ORN)klasser. Generering af en bred vifte af ORNs med odorantreceptor udtryk og aksonal målretning er afgørende for at skabe den neuronale mangfoldighed er nødvendig for overførsel af information fra lugtmolekyler til højere centre i hjernen. Vores hele mount antenne immunfarvning protokol hjælpemidler i at fremme vores forståelse for de molekylære mekanismer underliggende ORN diversificering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev støttet af MEXT-støttet program for Strategiske Research Foundation på private universiteter og JSP'er Young Scientist B tilskud til HT Vi vil gerne takke Ohtake Norihito at redigere videoklip.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stemi DV4 dissection microscope | Zeiss | Stemi DV4 | |
| Glass bottom culture dishes | MatTek corporation | P35G-0-10-C | |
| Dissection scissor | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Rat anti-ELAV | Developmental Studies Hybridoma Bank | 7E8A10 | Dilution 1:200 |
| Mouse anti-GFP | Invitrogen | A11122 | Dilution 1:400 |
| Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 711-225-152 | Dilution 1:200 |
| Donkey Anti-Rat IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 712-165-150 | Dilution 1:200 |
References
- Christensen, T. A., White, J. Representation of olfactory information in the brain In The Neurobiology of Taste and Smell. , New York. 201-232 (2000).
- Ache, B. W. Towards a common strategy for transducing olfactory information. Sem. Cell Biol. 5, 55-63 (1994).
- Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction. C. elegans. Cell. 13, 515-527 (1993).
- Barth, A. L., Justice, N. J., Ngai, J. Asynchronous onset of odorant receptor expression in the developing zebrafish olfactory system. Neuron. 16, 23-34 (1996).
- Firestein, S. How the olfactory system makes sense of scents. Nature. 413, 211-218 (2001).
- Stockinger, P., et al. Neural circuitry that governs Drosophila male courtship behavior. Cell. 121, 795-807 (2005).
- Endo, K., et al. Chromatin modification of Notch targets in olfactory receptor neuron diversification. Nat Neurosci. 15, 224-233 (2011).
- Karim, M. R., Moore, A. W. Morphological analysis of Drosophila larval peripheral sensory neuron dendrites and axons using genetic mosaics. J Vis Exp. , (2011).
- Suh, G. S., et al. A single population of olfactory sensory neurons mediates an innate avoidance behaviour in Drosophila. Nature. 431, 854-859 (2004).
- Sachse, S., Galizia, C. G. Role of inhibition for temporal and spatial odor representation in olfactory output neurons: A calcium imaging study. J Neurophysiol. 87, 1106-1117 (2002).
- Hallem, E. A., Ho, M. G., Carlson, J. R. The molecular basis of odor coding in the Drosophila antenna. Cell. 117, 965-979 (2004).
- Vosshall, L. B., Wong, A. M., Axel, R. An olfactory sensory map in the fly brain. Cell. 102, 147-159 (2000).
- Couto, A., Alenius, M., Dickson, B. J. Molecular, anatomical and functional organization of the Drosophila olfactory system. Curr Biol. 15, 1535-1547 (2005).
- Clyne, P., et al. Odorant response of individual sensilla on the Drosophila antenna. Invert Neurosci. 3, 127-135 (1997).
- Vosshall, L. B., et al. A spatial map of olfactory receptor expression in the Drosophila antenna. Cell. 96, 725-736 (1999).
- Wang, J. W., et al. Two-photon calcium imaging reveals an odor-evoked map of activity in the fly brain. Cell. 112, 271-282 (2003).
