Abstract
악취 물질 분자는 정확하고 조정 된 방법으로 자신의 목표 수용체에 결합한다. 각 수용체는 특정 신호를 인식하고 뇌에 정보를 중계한다. 이와 같이, 후각 정보 인식과 행동, 장점 조사를 모두 수정, 뇌에 전달하는 방법을 결정하는 단계를 포함한다. 흥미롭게도, 세포 전달 및 전사 인자는 후각 수용체 신경 세포의 다양 화에 관여하는 것을 새로운 증거가있다. 여기에서 우리는 강력한 전체가 생체 내 후각 수용체 신경 세포 조직을 분석 실험하는 면역 표시 방법을 마운트 제공합니다. 이 방법을 사용하여, 우리는 안티 ELAV 항체 알려져 팬 신경 마커 Or49a-mCD8 :: GFP, 특히 안티 GFP 항체를 사용하여 NBA의 신경 세포에서 발현 후각 수용체 신경 세포의 모든 후각 수용체 뉴런을 확인했다.
Introduction
후각 시스템은 악취 분자의 거대한 다양한 구분할이어서 높은 뇌 센터에 생성 된 정보를 전송하기 위해 사용된다. 이 입력은 정확히 같은 먹이와 짝짓기 1-6로 기본적인 동물의 동작을 제어하는 데 사용됩니다. 각각의 후각 신경 세포의 종류가 냄새의 특정 세트, 후각 수용체 뉴런의 다양 화와 연관 될 때 (ORN)의 적절한 후각 시스템 기능 7 필수적이다.
초파리 유전학 ORN 개발 및 생리 기능 8-16과 관련된 분자 메커니즘을 포함하는 단일 세포 수준의 연구를 수행하는 가능하게한다. 초파리 안테나의 전체 마운트 면역 염색은 더 자세히 후각 수용체 뉴런의 다양 화에 관련된 분자 메커니즘 (ORN)의 7을 이해할 수있게되었습니다. 여기에서 우리는 교류에 간단한 방법의 포괄적 인 설명을 제공이 hieve.
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Protocol
1. 사과 접시를 준비합니다
- 12.5 g 한천을 혼합, 125 ㎖의 100 % 시판 사과 주스, 12.5 g 포도당, 375 ML의 H 2 O 1-2분의 혼합물을 전자 레인지와 3cm 세포 배양 접시에 붓는다. 4 ℃에서 보관
2. 유전 크로스
- 다음과 같은 대표적인 유전 십자가를 사용
Or49a-mCD8 :: GFP / CYO X 1,118 (W)
3. 해부 및 염색 프로토콜
- 파리를 마취 한 다음 집게를 사용하여 개최하여 수직으로 비행 머리를 잘라.
- 조심스럽게 사과 접시에 안테나를 포함하는 부분을 놓습니다.
- 미세 해부 가위를 사용하여 안테나의 세 번째 세그먼트를 잘라.
- 유리 바닥 배양 접시의 중간에 () 0.1 % 트리톤 X-100 0.1 % PBST (PBS에 4 % 파라 포름 알데히드)의 고정 솔루션의 90 μl를 놓습니다.
- 조심스럽게 해부 antenn 전송직접 고정 솔루션에 날카로운 바늘 AE. 필요한 경우, 물리적으로 바늘을 사용하여 용액에 안테나를 물속.
- 실온 (RT)에서 40 분 알을 품다. 같은 접시에 그들을 유지 (0.4 % 트리톤 X-100과 PBS) 0.4 % PBST에 각각 3 배 10 분 안테나를 씻으십시오. PBST 솔루션을 제거하고 추가하는 노란색 팁을 사용합니다. 때마다 세척 용액 90 μl를 사용합니다.
참고 : 면역 조직 화학 염색 동안 진탕에 접시를 올려 놓지 마십시오. 접시에 솔루션을 제거하거나 추가하기 전에 바늘을 사용하여 요리의 중심으로 모든 안테나를 가지고 조심스럽게 접시의 가장자리에서 솔루션을 추가하거나 제거 할 수 있습니다. - 실온에서 20 분 동안 0.1 % PBST 5 % 정상 말 혈청 90 μL와 안테나를 차단합니다.
- 차단 솔루션을 제거한 후, 전술 한 바와 같이 축축한 용기에 4 ° C에서 48 시간 동안 5 % 말 혈청을 포함하는 0.1 % PBST에 차 항체의 90μl와 안테나를 품다
- 0.4 % PBST -10 분 6 배 안테나를 씻으십시오.
- 4 ℃에서 48 시간 동안 5 % 말 혈청을 포함하는 0.1 % PBST 이차 항체의 90 μL와 안테나를 품어 0.4 % PBST를 사용하여 6 배 10 분 씻으십시오.
- , 안테나를 탑재 가능한 한 배양 접시에서 PBST를 제거하고 점차적으로 안테나에 글리세롤의 두 개의 서로 다른 농도를 소개합니다. 처음 1 2 분 동안 요리에 40 % 글리세롤을 추가; 다음이를 제거하고 80 % 글리세롤을 추가합니다.
- 조심스럽게 노란색 팁을 사용하여 배양 접시에서 (80 % 글리세롤을 포함한다) 안테나를 추출하고 슬라이드에 배치합니다. 조심스럽게 상단에 커버 슬립을 배치하고 매니큐어로 커버 슬립의 가장자리를 밀봉. 안테나는 지금 형광 현미경으로 몇 군데 준비가 된 것입니다.
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Representative Results
해부 및 고정 모두가 신속하게 수행하는 것을 보장하는 것은이 프로토콜을 사용하여 성공을 달성하는 핵심 요소입니다. 미세 가위와 집게를 사용하면 매우 중요합니다. 면역 염색 한 후, 형광 표지 된 안테나는 공 초점 현미경으로 관찰 하였다. 우리는 일반적으로 20 배 렌즈를 사용하여 1 ㎛ 섹션을. 우리는 NBA에게 Or49a-mCD8 :: GFP를 사용하여 7 ORNs을 표시하고 야생 형 안테나의 NBA ORNs의 수를 세었다. mCD8-GFP 기자 세포막 지역화 등 표현은 그림 GFP를 표현 OR49a ORNs 2 전시 세포막에서 볼. 그림 2에서 안티 GFP 항체 및 항 ELAV가 팬 신경 마커로 사용을 사용하여 NBA ORNs 표정을 보여줍니다. 안테나 당 농구 (NBA) ORNs의 평균 수는 20 (N = 8).
그림 1 : dissectio의 일반 개요N 절차.
그림 2 : 성공적으로 해부 안테나의 공 촛점 Z-시리즈의 투사. 신경 세포를 검출하기 위해 항-ELAV 항체 (C)에 도시 된 바와 같이 특정 후각 수용체 발현 (B)와 병합 된 영상을 검출하기 위해 팬 - 신경 마커 (A) 및 항-GFP 항체로 사용 하였다.
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Discussion
우리가 설명하는 초파리 안테나의 해부는 단순하고 실험실 환경에서 수행하기 쉽습니다. 성공적인 절개를 보장하기 위해, 그것을 잘 양날 가위를 사용하는 것이 필수적입니다. 해부 안테나를 면역 염색 동안, 항체 용액의 증발을 방지하기 위해 습기가 채워진 용기들을 배양하는 것이 중요하다. 해부 안테나 솔루션에 떠있는 경향이있다. 고정 동안 PBS에서 0.1 % 트리톤을 사용하고 단계를 차단하는 솔루션에 안테나의 침수를 용이하게하고 더 나은 염색을 보장합니다. "유리 바닥 배양 접시"를 사용하여 면역 염색 중에 안테나의 손실을 줄이고, 각 실험에 사용 된 항체 용액의 소량 (90 μL)를 지킬 수 있었다.
신경 세포 수준의 다양 화는 신경의 핵심 기능입니다. 이 생리적 과정은 후각 수용체 신경 세포의 큰 배열을 이용하여 후각 시스템 (ORN)에 예시되어클래스. 후각 수용체 발현 및 축삭 타겟팅 ORNs의 다양한 세대 높은 뇌 센터에 악취 분자로부터 정보를 전송하는데 필요한 신경 다이버 생성에 중요하다. 분자 기전 ORN의 다양 화에 대한 우리의 이해를 발전에서 우리의 전체 마운트 안테나 면역 염색 프로토콜 제품.
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Disclosures
저자가 공개하는 게 없다.
Acknowledgments
본 연구는 사립 대학의 전략적 연구 재단과 우리는 비디오 클립을 편집 할 수 오타케 Norihito에게 감사의 말씀을 전합니다 HT에 대한 JSPS 젊은 과학자 B 보조금에 대한 문부 과학성 - 지원 프로그램에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stemi DV4 dissection microscope | Zeiss | Stemi DV4 | |
| Glass bottom culture dishes | MatTek corporation | P35G-0-10-C | |
| Dissection scissor | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Rat anti-ELAV | Developmental Studies Hybridoma Bank | 7E8A10 | Dilution 1:200 |
| Mouse anti-GFP | Invitrogen | A11122 | Dilution 1:400 |
| Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 711-225-152 | Dilution 1:200 |
| Donkey Anti-Rat IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 712-165-150 | Dilution 1:200 |
References
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