Abstract
Odorant molekyler binder seg til sine mål reseptorer på en presis og koordinert måte. Hver reseptor gjenkjenner et bestemt signal, og videresender denne informasjonen til hjernen. Som sådan, å bestemme hvor lukte informasjon overføres til hjernen, å modifisere både persepsjon og oppførsel, fordeler undersøkelse. Interessant, det er nye bevis på at mobilnettet transduksjon og transkripsjonsfaktorer er involvert i spredning av olfactory reseptor nervecellen. Her gir vi en robust hel montere immunologisk merking metoden til analysen in vivo olfactory reseptor nervecellen organisasjon. Ved hjelp av denne metoden, identifiserte vi alle olfactory reseptor nerveceller med anti-ELAV antistoff, et kjent pan-nevrale markør og Or49a-mCD8 :: GFP, en olfactory reseptor nervecellen spesifikt uttrykt i NBA nevron bruker anti-GFP antistoff.
Introduction
Den olfaktoriske system blir brukt til å skille mellom et mangfold av luktmolekyler og deretter sende den resulterende informasjon til de høyere hjerne sentre. Denne inngangen brukes til nøyaktig kontroll grunnleggende dyreatferd, for eksempel fôring og parring 1-6. Som hver lukte nevron type er forbundet med et bestemt sett av lukt, spredning av olfactory reseptor nevroner (ORN) s er avgjørende for riktig luktsystemet funksjon 7.
Drosophila genetikk gjør oss i stand til å utføre enkelt celle nivå etterforskningen involverer molekylære mekanismene forbundet med ORN utvikling og fysiologiske funksjon 8-16. Hele fjellet farging av Drosophila antenner har gjort oss i stand til å forstå i større detalj de molekylære mekanismene som er involvert i spredning av olfactory reseptor nevroner (ORN) s 7. Heri vi gi en omfattende beskrivelse av en enkel metode for å achieve dette.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Forbered eple plate
- Bland 12,5 g agar, 125 ml 100% kommersielt tilgjengelig eplejuice, 12,5 g glukose og 375 ml H2O Micro blandingen i 1 til 2 minutter, og helles til 3 cm celledyrkningsskål. Oppbevar ved 4 ° C.
2. Genetisk kryss
- Bruk følgende representant genetisk kryss:
Or49a-mCD8 :: GFP / CYO x w 1118
Tre. Dissection og farging protokollen
- Anesthetize fly og deretter klippe flua hodet vertikalt ved å holde den ved hjelp av en pinsett.
- Plassere antennene som inneholder delen forsiktig på et eple plate.
- Skjær den tredje delen av antennen hjelp av gode disseksjon saks.
- Plasser 90 pl av fikseringsløsning (4% paraformaldehyd i 0,1% PBST (PBS med 0,1% Triton X-100)) til midten av en glassbunn dyrkningsskål.
- Forsiktig overføre dissekert antennae med en skarp nål direkte til fikseringsløsning. Om nødvendig fysisk senk antennene i løsningen ved hjelp av nålen.
- Inkuber i 40 minutter ved romtemperatur (RT). Vask antennene i 0,4% PBST (PBS med 0,4% Triton X-100), 3x 10 minutter i hver, holde dem i samme fatet. Bruk gule tips til å fjerne og legge til PBST løsning. Bruk 90 mL av vaskeløsning hver gang.
MERK: Ikke sett formen inn i en shaker i løpet av immunhistokjemi. Før du fjerner eller legger løsningen i formen, ta med alle antennene inn i midten av parabolen ved hjelp av nål og forsiktig legge til eller fjerne løsning fra kanten av fatet. - Blokker antenner med 90 ul av 5% normal hesteserum i 0,1% PBST i 20 minutter ved RT.
- Etter fjernelse av den blokkerende løsning, inkuber antennene med 90 ul av primære antistoffer i 0,1% PBST inneholdende 5% hesteserum i 48 timer ved 4 ° C i en fuktig beholder som beskrevet tidligere
- Vask antennene 6x 10 minutter i 0,4% PBST.
- Inkuber antenner med 90 pl av sekundære antistoffer i 0,1% PBST inneholdende 5% hesteserum i 48 timer ved 4 ° C. Vask 6x 10 minutter ved hjelp av 0,4% PBST.
- For å montere antenner, fjerner PBST fra dyrkningsskål så mye som mulig, og gradvis å innføre to forskjellige konsentrasjoner av glycerol til antennene. Først legge 40% glyserol til parabolen i 1 til 2 minutter; deretter fjerne dette og legge til 80% glyserol.
- Trekke forsiktig antenner (inkludert 80% glyserol) fra kultur fatet ved hjelp av gul tips og plassere dem på et lysbilde. Forsiktig plassere et dekkglass på toppen og forsegle dekkglass kantene med neglelakk. Antennene er nå klar til å bli fotografert ved fluorescens mikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sikre at både disseksjon og fiksering utføres raskt er en nøkkelfaktor for å oppnå suksess med denne protokollen. Ved hjelp av gode saks og pinsett er også avgjørende. Etter farging, ble fluorescerende merket antenner undersøkt under et konfokalmikroskop. Vi normalt ta 1/iM seksjoner ved hjelp av et 20x objektiv. Vi merket Nba 7 Orns bruker Or49a-mCD8 :: GFP og telte antall NBA Orns i vill-type antenne. Den mCD8-GFP reporter er cellemembranen lokalisert og slik uttrykket ses på figur 2 utstillinger cellemembranen i OR49a Orns uttrykker GFP. I figur 2 viser Nba Orns uttrykk ved hjelp av anti GFP antistoff og anti ELAV ble brukt som en pan-neural markør. Gjennomsnittlig antall NBA Orns per antenne er 20 (n = 8).
Figur 1: Samlet oversikt over de dissection prosedyre.
Figur 2: projeksjon av konfokal Z-serie av en vellykket dissekert antenne. For å detektere neuroner anti-ELAV antistoff ble brukt som et pan-neural markør (A), og anti-GFP-antistoff for å påvise spesifikke odorant reseptorekspresjon (B), og slått sammen bilde som vist i (C).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den disseksjon av Drosophila antennen beskriver vi er enkel og lett å utføre i et laboratorium setting. For å sikre en vellykket disseksjon, er det viktig å utnytte fin-edged saks. Mens farging av den dissekerte antenne, er det viktig å inkubere dem i en fuktighetsfylt beholder for å unngå fordamping av antistoffløsningen. Den dissekert antennen har en tendens til å flyte i løsningen. Ved hjelp av 0,1% Triton i PBS under fiksering og blokkeringstrinn som vil lette nedsenking av antennen i løsningen, og for å sikre en bedre farging. Med "glassbunn dyrkningsskål" kunne redusere tapet av antennene under farging og sikre små mengder (90 ul) av antistoff-løsning som brukes i hvert forsøk.
Nevronale-klassen diversifisering er en sentral funksjon i neurogenesis. Dette fysiologisk prosess er eksemplifisert i luktesystemet, som benytter et stort utvalg av lukte reseptor nervecellen (ORN)klasser. Generering av et bredt utvalg av Orns med odorant-reseptor ekspresjon og aksonal målretting er avgjørende for å generere den nevronale mangfold kreves for overføring av informasjon fra luktmolekyler i høyere hjerne sentre. Våre hele mount antenne farging protokoll hjelpemidler i å fremme vår forståelse av den molekylære mekanismene bak ORN diversifisering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Denne studien ble støttet av mext-støttede Program for Strategic Research Foundation på private universiteter og JSPene Young Scientist B stipend for HT Vi ønsker å takke Ohtake Norihito å redigere videoklippene.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stemi DV4 dissection microscope | Zeiss | Stemi DV4 | |
| Glass bottom culture dishes | MatTek corporation | P35G-0-10-C | |
| Dissection scissor | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Rat anti-ELAV | Developmental Studies Hybridoma Bank | 7E8A10 | Dilution 1:200 |
| Mouse anti-GFP | Invitrogen | A11122 | Dilution 1:400 |
| Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 711-225-152 | Dilution 1:200 |
| Donkey Anti-Rat IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 712-165-150 | Dilution 1:200 |
References
- Christensen, T. A., White, J. Representation of olfactory information in the brain In The Neurobiology of Taste and Smell. , New York. 201-232 (2000).
- Ache, B. W. Towards a common strategy for transducing olfactory information. Sem. Cell Biol. 5, 55-63 (1994).
- Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction. C. elegans. Cell. 13, 515-527 (1993).
- Barth, A. L., Justice, N. J., Ngai, J. Asynchronous onset of odorant receptor expression in the developing zebrafish olfactory system. Neuron. 16, 23-34 (1996).
- Firestein, S. How the olfactory system makes sense of scents. Nature. 413, 211-218 (2001).
- Stockinger, P., et al. Neural circuitry that governs Drosophila male courtship behavior. Cell. 121, 795-807 (2005).
- Endo, K., et al. Chromatin modification of Notch targets in olfactory receptor neuron diversification. Nat Neurosci. 15, 224-233 (2011).
- Karim, M. R., Moore, A. W. Morphological analysis of Drosophila larval peripheral sensory neuron dendrites and axons using genetic mosaics. J Vis Exp. , (2011).
- Suh, G. S., et al. A single population of olfactory sensory neurons mediates an innate avoidance behaviour in Drosophila. Nature. 431, 854-859 (2004).
- Sachse, S., Galizia, C. G. Role of inhibition for temporal and spatial odor representation in olfactory output neurons: A calcium imaging study. J Neurophysiol. 87, 1106-1117 (2002).
- Hallem, E. A., Ho, M. G., Carlson, J. R. The molecular basis of odor coding in the Drosophila antenna. Cell. 117, 965-979 (2004).
- Vosshall, L. B., Wong, A. M., Axel, R. An olfactory sensory map in the fly brain. Cell. 102, 147-159 (2000).
- Couto, A., Alenius, M., Dickson, B. J. Molecular, anatomical and functional organization of the Drosophila olfactory system. Curr Biol. 15, 1535-1547 (2005).
- Clyne, P., et al. Odorant response of individual sensilla on the Drosophila antenna. Invert Neurosci. 3, 127-135 (1997).
- Vosshall, L. B., et al. A spatial map of olfactory receptor expression in the Drosophila antenna. Cell. 96, 725-736 (1999).
- Wang, J. W., et al. Two-photon calcium imaging reveals an odor-evoked map of activity in the fly brain. Cell. 112, 271-282 (2003).
