Abstract
Molécules odorantes se lient à leurs récepteurs cibles d'une manière précise et coordonnée. Chaque récepteur reconnaît un signal spécifique et transmet cette information au cerveau. En tant que tel, de déterminer comment l'information olfactive est transféré vers le cerveau, modifiant à la fois la perception et le comportement, l'enquête de fond. Fait intéressant, il est évident que des facteurs de transduction cellulaire et la transcription sont impliqués dans la diversification de neurone récepteur olfactif. Ici, nous fournissons un support de l'ensemble robuste méthode de marquage immunologique pour doser olfactif organisation in vivo des neurones récepteurs. En utilisant cette méthode, nous avons identifié tous les neurones récepteurs olfactifs avec l'anticorps anti-ELAV, un marqueur pan-neuronal connu et Or49a-mCD8 :: GFP, un neurone récepteur olfactif spécifiquement exprimée dans Nba neurone en utilisant un anticorps anti-GFP.
Introduction
Le système olfactif est utilisé pour faire la distinction entre une immense variété de molécules odorantes et ensuite envoyer les informations résultant des centres supérieurs du cerveau. Cette entrée est utilisée pour contrôler avec précision les comportements animaux fondamentales, telles que l'alimentation et l'accouplement 1-6. Comme chaque type de neurone olfactif est associée à un ensemble spécifique d'odeurs, la diversification des neurones récepteurs olfactifs (ORN) s est essentiel pour le fonctionnement du système olfactif bon 7.
Génétique de la Drosophile nous permet d'effectuer des investigations au niveau de la cellule unique impliquant des mécanismes moléculaires associés au développement de ORN et la fonction physiologique 8-16. Tout le immunomarquage montage de la drosophile antennes nous a permis de comprendre plus en détail les mécanismes moléculaires impliqués dans la diversification des neurones récepteurs olfactifs (ORN) s 7. Ici, nous fournissons une description détaillée d'une méthode simple pour acHieve cela.
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Protocol
1. Préparer la plaque de pomme
- Mélanger 12,5 g de gélose, 125 ml 100% disponible dans le commerce du jus de pomme, 12,5 g de glucose et 375 ml de H 2 O. Micro-ondes le mélange pendant 1 à 2 minutes et verser dans le plat de la culture 3 cm de cellule. Stocker à 4 ° C.
2. Transversale Genetic
- Utilisez le croisement génétique représentant suivant:
Or49a-mCD8 :: GFP / CYO x w 1118
3. Dissection et coloration protocole
- Anesthésier la volée, puis couper la tête à la mouche à la verticale en le tenant à l'aide d'une pince.
- Placez délicatement la partie antennes contenant sur une plaque de pomme.
- Couper le troisième segment de l'antenne à l'aide des ciseaux fins de dissection.
- Placer 90 ul de la solution de fixation (4% de paraformaldehyde dans 0,1% de PBST (PBS avec 0,1% de Triton X-100)) au milieu d'une boîte de culture à fond en verre.
- Transférer délicatement le Antenn disséquéae avec une aiguille directement dans la solution de fixation. Si nécessaire, plonger physiquement les antennes dans la solution en utilisant l'aiguille.
- Incuber pendant 40 minutes à la température ambiante (RT). Laver les antennes à 0,4% du PBST (PBS avec 0,4% de Triton X-100), 3 x 10 minutes dans chaque, en les maintenant dans le même plat. Utilisez pointes jaunes à enlever et ajouter la solution PBST. Utiliser 90 pl de la solution de lavage à chaque fois.
REMARQUE: Ne pas placer le plat dans un shaker pendant immunohistochimie. Avant de retirer ou d'ajouter la solution dans le récipient métallique, faire toutes les antennes dans le centre de la boîte à l'aide de l'aiguille et avec précaution d'ajouter ou de supprimer la solution à partir du bord de la cuvette. - Bloquer les antennes avec 90 ul de 5% de sérum de cheval normal dans du PBST à 0,1% pendant 20 minutes à température ambiante.
- Après avoir retiré la solution de blocage, incuber les antennes avec 90 pi d'anticorps primaires dans du PBST à 0,1% contenant 5% de sérum de cheval pendant 48 h à 4 ° C dans un récipient tel que décrit précédemment humidifié
- Laver les antennes 6x 10 minutes dans 0,4% PBST.
- Incuber les antennes avec 90 ul d'anticorps secondaire dans du PBST à 0,1% contenant 5% de sérum de cheval pendant 48 heures à 4 ° C. Laver 6x 10 minutes en utilisant 0,4% PBST.
- Pour monter les antennes, retirez PBST de la boîte de culture autant que possible et d'introduire progressivement deux concentrations différentes de glycérol à l'antenne. Ajouter d'abord 40% de glycerol à l'antenne pendant 1 à 2 minutes; puis supprimer ce et ajouter 80% de glycérol.
- Retirez délicatement les antennes (dont 80% de glycérol) de la boîte de culture en utilisant la pointe jaune et placez-les sur une lame. Placez délicatement une lamelle sur le dessus et sceller les bords de lamelle avec du vernis à ongles. Les antennes sont maintenant prêtes à être imagée par microscopie à fluorescence.
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Representative Results
Veiller à ce que les deux la dissection et la fixation sont effectuées rapidement est un facteur clé dans la réussite de ce protocole. Avec des ciseaux et des pinces fines est également cruciale. Après immunomarquage, marqués par fluorescence antennes ont été examinées sous un microscope confocal. Nous prenons normalement sections de 1 um en utilisant une lentille 20x. Nous avons étiqueté Nba 7 ORNs utilisant la GFP de Or49a-mCD8 et compté le nombre de Nba ORNs antenne de type sauvage. Le reporter mCD8-GFP est la membrane cellulaire localisée et ainsi l'expression observé sur la figure 2 présente la membrane cellulaire de OR49a Orns exprimant la GFP. Sur la figure 2 montre l'expression de NBA en utilisant un anticorps contre la GFP et anti ELAV a été utilisé comme marqueur pan-neurale. Le nombre moyen de Nba ORNs par antenne est de 20 (n = 8).
Figure 1: Vue d'ensemble de la dissection procédure.
Figure 2: Projection de confocale Z-série d'une antenne disséqué avec succès. Pour détecter les anticorps anti-neurones ELAV a été utilisé comme marqueur pan-neuronal (A) et l'anticorps anti-GFP pour détecter l'expression spécifique de récepteur olfactif (B) et de l'image fusionnée, comme indiqué en (C).
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Discussion
La dissection de l'antenne Drosophila nous décrivons est simple et facile à réaliser dans un environnement de laboratoire. Pour assurer une dissection de succès, il est essentiel d'utiliser des ciseaux bien tranchants. Alors que la coloration immunologique antenne disséqué, il est important de les incuber dans un récipient rempli d'humidité pour éviter l'évaporation de la solution d'anticorps. L'antenne disséqué a tendance à flotter dans la solution. Utilisation de 0,1% de Triton dans du PBS pendant la fixation et le blocage étapes facilitera l'immersion de l'antenne dans la solution et d'assurer une meilleure coloration. L'utilisation de "boîte de culture à fond de verre" pourrait réduire la perte d'antennes pendant immunomarquage et s'assurer que les petites quantités (90 pi) de solution d'anticorps utilisés dans chaque expérience.
Diversification neuronale classe est un élément central de la neurogenèse. Ce processus physiologique est exemplifié dans le système olfactif, qui utilise une large gamme de neurone récepteur olfactif (ORN)classes. La génération d'une grande variété de Orns avec l'expression du récepteur olfactif et le ciblage axonal est crucial pour la génération de la diversité neuronale requis pour transmettre des informations à partir de molécules odorantes à des centres nerveux supérieurs. Tout notre antenne montage aides de protocole immunologique à approfondir notre compréhension des mécanismes moléculaires de la diversification ORN sous-jacent.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Cette étude a été financée par le Programme MEXT-prise en charge de la Fondation pour la recherche stratégique dans les universités privées et JSPS Young Scientist B subvention pour HT Nous tenons à remercier Ohtake Norihito pour éditer les clips vidéo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stemi DV4 dissection microscope | Zeiss | Stemi DV4 | |
| Glass bottom culture dishes | MatTek corporation | P35G-0-10-C | |
| Dissection scissor | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Rat anti-ELAV | Developmental Studies Hybridoma Bank | 7E8A10 | Dilution 1:200 |
| Mouse anti-GFP | Invitrogen | A11122 | Dilution 1:400 |
| Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 711-225-152 | Dilution 1:200 |
| Donkey Anti-Rat IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 712-165-150 | Dilution 1:200 |
References
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