Abstract
Molecole odoranti legano ai loro recettori bersaglio in modo preciso e coordinato. Ogni recettore riconosce un segnale specifico e trasmette queste informazioni al cervello. Come tale, determinando come informazioni olfattive viene trasferito al cervello, modificando sia percezione e comportamento, meriti indagine. È interessante notare, ci sono prove emergenti che i fattori di trasduzione e trascrizionali cellulari sono coinvolti nella diversificazione del neurone recettore olfattivo. Qui forniamo tutta una robusta montare metodo di etichettatura immunologico per eseguire il test in vivo olfattiva organizzazione neurone recettore. Utilizzando questo metodo, abbiamo identificato tutti i neuroni recettori olfattivi con l'anticorpo anti-ELAV, un noto marcatore pan-neurale e Or49a-mCD8 :: GFP, un neurone recettore olfattivo specificamente indicato nella Nba neurone utilizzando un anticorpo anti-GFP.
Introduction
Il sistema olfattivo viene utilizzato per distinguere tra una immensa varietà di molecole di odore e successivamente inviare le informazioni risultanti ai centri cerebrali superiori. Questo ingresso permette di controllare con precisione i comportamenti animali fondamentali, come l'alimentazione e l'accoppiamento 1-6. Poichè ogni neurone olfattivo è associato a un insieme specifico di odori, la diversificazione dei neuroni recettori olfattivi (ORN) s è essenziale per il corretto funzionamento del sistema olfattivo 7.
La genetica Drosophila ci permette di eseguire un'unica indagine a livello cellulare coinvolgendo meccanismi molecolari associati con lo sviluppo ORN e funzione fisiologica 8-16. Tutta monte immunoistochimica di Drosophila antenne ci ha permesso di capire più in dettaglio i meccanismi molecolari coinvolti nella diversificazione dei neuroni recettori olfattivi (ORN) s 7. Qui forniamo una descrizione completa di un metodo semplice per achieve questo.
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Protocol
1. Preparare piastra apple
- Miscelare 12,5 g di agar, 125 ml 100% disponibile in commercio succo di mela, 12,5 g di glucosio, e 375 ml di H 2 O. Microonde la miscela per 1 a 2 minuti e versare al piatto di coltura cellulare 3 cm. Conservare a 4 ° C.
2. Croce genetica
- Utilizzare la seguente incrocio genetico rappresentante:
Or49a-mCD8 :: GFP / cyo x w 1118
3. Dissection e colorazione protocollo
- Anestetizzare al volo e poi tagliare la testa fly verticale tenendolo con una pinza.
- Posizionare con cura la porzione di antenne che contiene su un piatto di mela.
- Tagliare il terzo segmento dell'antenna utilizzando sottili forbici dissezione.
- Porre 90 ml di soluzione di fissaggio (4% paraformaldeide in 0,1% PBST (PBS con 0,1% Triton X-100)) a mezzo di un piatto di coltura fondo di vetro.
- Trasferire delicatamente la antenn sezionatoae con un ago appuntito direttamente alla soluzione di fissaggio. Se necessario, immergere fisicamente le antenne nella soluzione con ago.
- Incubare per 40 minuti a temperatura ambiente (RT). Lavare le antenne a 0,4% PBST (PBS con 0,4% Triton X-100), 3x 10 minuti ciascuna, mantenendoli nello stesso piatto. Utilizzare punte gialle per rimuovere e aggiungere la soluzione PBST. Utilizzare 90 ml di soluzione di lavaggio ogni volta.
NOTA: Non mettere il piatto in uno shaker durante immunoistochimica. Prima di togliere o aggiungere la soluzione nella capsula, portare tutte le antenne al centro del piatto usando l'ago e aggiungere o rimuovere accuratamente la soluzione dal bordo del piatto. - Bloccare le antenne con 90 ml di siero di cavallo normale 5% a 0,1% PBST per 20 minuti a temperatura ambiente.
- Dopo aver rimosso la soluzione di saturazione, incubare le antenne con 90μl di anticorpi primari a 0,1% PBST contenente siero di cavallo 5% per 48 ore a 4 ° C in un contenitore umido come descritto in precedenza
- Lavare le antenne 6x 10 minuti a 0,4% PBST.
- Incubare le antenne con 90 ml di anticorpi secondari a 0,1% PBST contenente siero di cavallo 5% per 48 ore a 4 ° C. Lavare 6x 10 minuti con 0,4% PBST.
- Per montare le antenne, rimuovere PBST dal piatto di coltura, per quanto possibile e gradualmente introdurre due diverse concentrazioni di glicerolo al antenne. Aggiungere prima 40% glicerolo al piatto per 1 a 2 minuti; quindi rimuovere questo e aggiungere 80% di glicerolo.
- Estrarre con cautela le antenne (compresi 80% glicerolo) dal piatto di coltura con punta gialla e metterli su un vetrino. Posizionare delicatamente un coprioggetto sulla parte superiore e sigillare i bordi coprioggetto con smalto. Le antenne sono ora pronti per essere ripreso al microscopio a fluorescenza.
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Representative Results
Garantire che sia la dissezione e la fissazione vengono eseguite rapidamente è un fattore chiave per raggiungere il successo con questo protocollo. Utilizzando forbici sottili e pinze è fondamentale. Dopo immunostaining, antenne fluorescenti marcato sono state esaminate al microscopio confocale. Prendiamo normalmente sezioni 1μm usando una lente 20x. Abbiamo etichettato Nba 7 ORNs utilizzando Or49a-mCD8 :: GFP e contato il numero di Nba ORNs in wild-tipo di antenna. Il reporter mCD8-GFP è localizzato membrana cellulare e quindi l'espressione visibile nella figura 2 presenta la membrana cellulare di OR49a ORNs esprimere GFP. In figura 2 mostra l'espressione Nba ORNs utilizzando anticorpo anti GFP e anti ELAV stato usato come marcatore pan-neurale. Il numero medio di Nba ORNs per antenna è di 20 (n = 8).
Figura 1: panoramica generale del dissectioProcedura n.
Figura 2: Proiezione di confocale Z-serie di un'antenna sezionato con successo. Per rilevare neuroni anticorpo anti-ELAV è stato utilizzato come marcatore pan-neurale (A) e l'anticorpo anti-GFP per rilevare l'espressione specifica del recettore odorizzante (B) e l'immagine fusa come mostrato in (C).
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Discussion
La dissezione dell'antenna Drosophila descriviamo è semplice e facile da eseguire in un ambiente di laboratorio. Per garantire una dissezione successo, è indispensabile utilizzare forbici multa taglio. Mentre immunoistochimica l'antenna sezionato, è importante incubare in un contenitore pieno di umidità per evitare l'evaporazione della soluzione di anticorpi. L'antenna sezionato ha la tendenza a galleggiare nella soluzione. Uso 0.1% Triton in PBS durante la fissazione e blocco delle fasi faciliterà sommersione dell'antenna nella soluzione e di garantire una migliore colorazione. Uso di "piatto di coltura fondo di vetro" potrebbe ridurre la perdita di antenne durante immunoistochimica e garantire le piccole quantità (90 mL) di soluzione di anticorpo utilizzato in ogni esperimento.
Diversificazione neuronale-classe è un elemento centrale della neurogenesi. Questo processo fisiologico è esemplificato nel sistema olfattivo, che utilizza una vasta gamma di neurone recettore olfattivo (ORN)classi. Generazione di una grande varietà di ORNs con espressione recettore olfattivo e il targeting assonale è indispensabile per creare la diversità neuronale necessaria per la trasmissione di informazioni da molecole di odore ai centri cerebrali superiori. Tutta la nostra antenna mount aiuti protocollo immunostaining nel favorire la nostra comprensione dei meccanismi molecolari alla base della diversificazione ORN.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo studio è stato supportato da MEXT supportata Programma per la Fondazione per la ricerca strategica presso Università private e JSPS Young Scientist B sovvenzione per HT Vorremmo ringraziare Ohtake Norihito per modificare i video clip.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stemi DV4 dissection microscope | Zeiss | Stemi DV4 | |
| Glass bottom culture dishes | MatTek corporation | P35G-0-10-C | |
| Dissection scissor | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Rat anti-ELAV | Developmental Studies Hybridoma Bank | 7E8A10 | Dilution 1:200 |
| Mouse anti-GFP | Invitrogen | A11122 | Dilution 1:400 |
| Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 711-225-152 | Dilution 1:200 |
| Donkey Anti-Rat IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 712-165-150 | Dilution 1:200 |
References
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