Abstract
Las moléculas odoríferas se unen a sus receptores diana de una manera precisa y coordinada. Cada receptor reconoce una señal específica y transmite esta información al cerebro. Como tal, la determinación de cómo se transfiere la información olfativa en el cerebro, tanto la modificación de la percepción y comportamiento, investigación méritos. Curiosamente, hay más pruebas de que los factores de transducción celular y la transcripción están implicados en la diversificación de la neurona olfativa del receptor. Aquí les ofrecemos un conjunto robusto de montaje método de marcaje inmunológico para ensayar in vivo organización neurona olfativa del receptor. Usando este método, se identificaron todas las neuronas olfativas del receptor con el anticuerpo anti-ELAV, un marcador pan-neuronal conocido y Or49a-mCD8 :: GFP, una neurona olfativa del receptor expresa específicamente en Nba neurona utilizando anticuerpo anti-GFP.
Introduction
El sistema olfativo se utiliza para distinguir entre una inmensa variedad de moléculas de olor y posteriormente enviar la información resultante a los centros superiores del cerebro. Esta entrada se utiliza para controlar con precisión los comportamientos animales fundamentales, como la alimentación y el apareamiento 1-6. Como cada tipo de neurona olfativa está asociado a un conjunto específico de los olores, la diversificación de las neuronas receptoras olfativas (ORN) s es esencial para la función del sistema olfativo adecuada 7.
Genética de Drosophila, nos permite llevar a cabo la investigación solo nivel celular que implica mecanismos moleculares asociados al desarrollo de ORN y la función fisiológica 8-16. Whole inmunotinción monte de Drosophila antenas nos ha permitido comprender con mayor detalle los mecanismos moleculares implicados en la diversificación de las neuronas olfativas del receptor (ORN) s 7. Aquí le ofrecemos una amplia descripción de un método sencillo para achieve esto.
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Protocol
1. Preparar plato Manzana
- Mezclar 12,5 g de agar, 125 ml de jugo 100% disponible en el mercado de la manzana, 12,5 g de glucosa, y 375 ml de H 2 O. Microondas la mezcla durante 1 a 2 minutos y se vierte a la placa de cultivo de 3 cm de células. Almacenar a 4 ° C.
2. Cruzamiento genético
- Utiliza el siguiente cruce genético representativo:
Or49a-mCD8 :: GFP / CyO x w 1118
3. Protocolo de disección y la tinción
- Se anestesia la marcha y luego se corta la cabeza mosca vertical sujetándolo mediante un fórceps.
- Coloque con cuidado la parte que contiene las antenas en una placa de manzana.
- Cortar el tercer segmento de la antena con tijeras de disección finas.
- Coloque 90 l de la solución de fijación (4% de paraformaldehído en 0,1% de PBST (PBS con 0,1% de Triton X-100)) a la mitad de una placa de cultivo con fondo de vidrio.
- Transferir suavemente la antenn diseccionadoae con una aguja directamente a la solución de fijación. Si es necesario, sumergir físicamente las antenas en la solución usando la aguja.
- Incubar durante 40 minutos a temperatura ambiente (RT). Lavar las antenas en 0,4% de PBST (PBS con 0,4% de Triton X-100), 3x 10 minutos en cada uno, mantenerlos en el mismo plato. Utilice puntas amarillas de quitar y añadir solución PBST. Utilice 90 l de la solución de lavado en cada ocasión.
NOTA: No coloque el plato en una coctelera durante inmunohistoquímica. Antes de la eliminación o la adición de la solución en el plato, llevar a todos las antenas en el centro de la cápsula, utilizando la aguja y agregar o quitar cuidadosamente la solución desde el borde del plato. - Bloquear las antenas con 90 l de 5% de suero de caballo normal en 0,1% de PBST durante 20 minutos a TA.
- Después de retirar la solución de bloqueo, incubar las antenas con 90μl de anticuerpos primarios en 0,1% PBST que contenía 5% de suero de caballo durante 48 horas a 4 ° C en un recipiente húmedo como se describe anteriormente
- Lávese las antenas 6x 10 minutos en el 0,4% PBST.
- Incubar las antenas con 90 l de anticuerpos secundarios en 0,1% PBST que contiene 5% de suero de caballo durante 48 horas a 4 ° C. Lave 6x 10 minutos usando 0,4% PBST.
- Para montar la antena, eliminar PBST de la placa de cultivo tanto como sea posible e introducir gradualmente dos concentraciones diferentes de glicerol a las antenas. En primer lugar añadir 40% de glicerol a la placa durante 1 a 2 minutos; luego quite esto y agregar 80% de glicerol.
- Extraer con cuidado la antena (incluyendo el 80% de glicerol) de la placa de cultivo utilizando la punta amarilla y colocarlos en un portaobjetos. Con suavidad, coloque un cubreobjetos encima y sellar los bordes cubreobjetos con esmalte de uñas. Las antenas están ahora listos para ser fotografiado por microscopía de fluorescencia.
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Representative Results
Garantizar que tanto la disección y fijación se realizan con rapidez es un factor clave para lograr el éxito con este protocolo. El uso de finas tijeras y pinzas también es crucial. Después de la inmunotinción, las antenas fluorescentes marcadas se examinaron bajo un microscopio confocal. Normalmente nos tomamos secciones 1μm usando una lente de 20x. Hemos marcado Nba 7 ORNs utilizando Or49a-mCD8 :: GFP y contamos el número de Nba ORNs de tipo salvaje antena. El reportero mCD8-GFP se localiza membrana celular y lo que la expresión se ve en la Figura 2 exhibe la membrana celular de OR49a ORNs que expresan GFP. En la figura 2 muestra la expresión NBA ORNs usando GFP de anticuerpos contra y anti ELAV se utilizó como un marcador pan-neuronal. El número promedio de NBA ORNs por antena es 20 (n = 8).
Figura 1: Visión general de la dissectioprocedimiento n.
Figura 2: Proyección de la serie Z confocal de una antena diseccionado con éxito. Para detectar las neuronas anticuerpo anti-ELAV se utilizó como un marcador pan-neuronal (A) y anticuerpo anti-GFP para detectar la expresión específica de receptor de odorizantes de (B) y la imagen fusionado como se muestra en (C).
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Discussion
La disección de la antena de Drosophila se describe es simple y fácil de realizar en un entorno de laboratorio. Para garantizar una disección éxito, es esencial utilizar las tijeras bien afiladas. Mientras que la inmunotinción la antena diseccionado, es importante incubar en un recipiente lleno de humedad para evitar la evaporación de la solución de anticuerpo. La antena diseccionado tiene una tendencia a flotar en la solución. Uso de 0,1% de Triton en PBS durante la fijación y el bloqueo de pasos facilitará la sumersión de la antena en la solución y para garantizar una mejor tinción. El uso de "placa de cultivo con fondo de cristal" podría reducir la pérdida de antenas durante inmunotinción y garantizar las cantidades pequeñas (90 mu l) de solución de anticuerpos utilizados en cada experimento.
Diversificación de clase Neuronal es una característica central de la neurogénesis. Este proceso fisiológico se ejemplifica en el sistema olfativo, que utiliza una gran variedad de neurona receptor olfativo (ORN)clases. Generación de una amplia variedad de ORNs con la expresión del receptor odorante y orientación axonal es crucial para la generación de la diversidad neuronal requerido para transmitir la información a partir de moléculas de olor a los centros superiores del cerebro. Nuestras antenas de montaje auxiliares de protocolo de inmunotinción enteros en la promoción de nuestra comprensión de los mecanismos moleculares de la diversificación ORN subyacente.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este estudio fue apoyado por el programa apoyado por el MEXT para la Fundación para la Investigación Estratégica en las Universidades Privadas y JSP Young Scientist B subvención para HT Nos gustaría dar las gracias a Ohtake Norihito para editar los clips de vídeo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stemi DV4 dissection microscope | Zeiss | Stemi DV4 | |
| Glass bottom culture dishes | MatTek corporation | P35G-0-10-C | |
| Dissection scissor | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Rat anti-ELAV | Developmental Studies Hybridoma Bank | 7E8A10 | Dilution 1:200 |
| Mouse anti-GFP | Invitrogen | A11122 | Dilution 1:400 |
| Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 711-225-152 | Dilution 1:200 |
| Donkey Anti-Rat IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 712-165-150 | Dilution 1:200 |
References
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