Summary
इस प्रोटोकॉल में विवो सीएनएस नमूनों की translatome अध्ययन करने के क्रम में polyribosome विभाजन की आवश्यक संशोधनों को दिखाता है. यह अलगाव और बाध्य शाही सेना भिन्न राइबोसोम के लिए कुल शाही सेना की तुलना के माध्यम से अनुवाद और प्रतिलेखन विनियमन के वैश्विक मूल्यांकन की अनुमति देता है.
Abstract
कई प्रक्रियाओं mRNAs और प्रोटीन की ट्रांसक्रिप्शन, अनुवाद और स्थिरता सहित जीन अभिव्यक्ति में शामिल रहे हैं. इन कदमों से प्रत्येक कसकर प्रोटीन बहुतायत के अंतिम गतिशीलता को प्रभावित करने, विनियमित रहे हैं. विभिन्न नियामक तंत्र अकेले जीन की अभिव्यक्ति का एक अविश्वसनीय सूचक mRNA स्तर प्रतिपादन, अनुवाद कदम पर मौजूद हैं. इसके अलावा, mRNA अनुवाद के स्थानीय विनियमन विशेष रूप से तंत्रिका जीव विज्ञान में ध्यान का ध्यान केंद्रित करने के लिए 'translatomics' स्थानांतरण, neuronal कार्यों में फंसाया गया है. प्रस्तुत विधि पुल transcriptomics और प्रोटिओमिक्स के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
यहाँ हम कई राइबोसोम के लिए सक्रिय रूप से अनुवादित mRNAs का संघ और सुक्रोज ढ़ाल में उनके अंतर अवसादन पर आधारित translatome पूछताछ जो polyribosome विभाजन की तकनीक, के लिए आवश्यक संशोधनों का वर्णन है. परंपरागत रूप से, विशेष रूप से Centra के vivo नमूनों के साथ काम करनाएल तंत्रिका तंत्र (सीएनएस), कारण सामग्री के प्रतिबंधित मात्रा और वसा ऊतकों के घटकों की उपस्थिति के लिए चुनौतीपूर्ण साबित हो गया है. एक माउस रीढ़ की हड्डी और मस्तिष्क के उपयोग के द्वारा प्रदर्शन के रूप में यह पता करने के लिए, वर्णित प्रोटोकॉल विशेष रूप से, सीएनएस सामग्री के कम से कम राशि के साथ प्रयोग के लिए अनुकूलित है. संक्षेप में, सीएनएस ऊतकों निकाले जाते हैं और अनुवाद के राइबोसोम cycloheximide साथ mRNAs पर स्थिर रहे. माइलिन प्लवनशीलता तो लिपिड अमीर घटकों को दूर करने के लिए किया जाता है. Fractionation mRNAs उनके ribosomal लदान के अनुसार अलग हो रहे हैं, जहां एक sucrose ढाल पर किया जाता है. पृथक भिन्न नया जीनोम चौड़ा परख प्रौद्योगिकियों सहित डाउनस्ट्रीम assays, की एक श्रृंखला के लिए उपयुक्त हैं.
Introduction
जीन अभिव्यक्ति अनुवाद सबसे प्रमुख प्रभाव 1 असर के साथ, प्रतिलेखन, अनुवाद और mRNA और प्रोटीन की स्थिरता की संयुक्त कार्रवाई से निर्धारित होता है. यह इन चरणों में से प्रत्येक उच्च विनियमित है कि अब स्पष्ट है. माइक्रो RNAs, आरएनए कणिकाओं, विकल्प और cytoplasmic polyadenylation के गठन जीन अभिव्यक्ति 2,3 के बाद transcriptional विनियमन के कुछ उदाहरण हैं. इन तंत्रों में से प्रत्येक अनुवाद से प्रतिलेखन uncouples और ब्याज की जैविक प्रणाली में proteome को प्रभावित करती है. इस प्रकार, हैरानगी, अकेले mRNA स्तर प्रोटीन का स्तर 4 का एक अपूर्ण readout हैं. मात्रात्मक प्रोटिओमिक्स हालांकि हाल के अग्रिमों के बावजूद, संवेदनशीलता और प्रोटीन अनुक्रम के प्रस्ताव पर काफी सीमाओं वहाँ अब भी कर रहे हैं, जीन अभिव्यक्ति का सबसे सीधा मूल्यांकन प्रदान करता है. इसलिए translatome को संबोधित करते हुए का अनुवाद mRNAs का प्रदर्शनों की सूची, पढ़ाई के बीच एक उत्कृष्ट समझौता प्रदान करता हैtranscriptome और proteome. यह अंतिम जीन अभिव्यक्ति का आकलन करने में transcriptomics तुलना में ज्यादा सटीक है, और उच्च कवरेज और प्रोटिओमिक्स से अनुक्रम संकल्प दोनों प्रदान करता है.
स्तनधारी प्रणालियों में, अनुवाद की घटनाओं का बहुमत टोपी पर निर्भर दीक्षा के माध्यम से शुरू करते हैं. एक साथ 40 छोटे ribosomal सबयूनिट साथ यूकेरियोटिक दीक्षा कारकों के एक समूह ने एक mRNA की 5 'टोपी पर इकट्ठा. जटिल तो mRNA को स्कैन करता है और अगस्त कोडोन शुरू पहुंचने पर, एक पूरा 80S राइबोसोम के लिए फार्म 60 बड़े ribosomal सबयूनिट रंगरूटों. बढ़ाव चरण राइबोसोम बढ़ाव कारकों नवजात पेप्टाइड श्रृंखला के लिए भरी हुई tRNAs से अमीनो एसिड के समावेश की सहायता के साथ, mRNA के साथ आगे बढ़ के साथ आय. एकाधिक राइबोसोम एक साथ एक एकल mRNA साथ आगे बढ़ सकते हैं और एसोसिएटेड राइबोसोम की संख्या प्रोटीन संश्लेषण 5,6 की दर के साथ सहसंबंधी दिखाया गया है. इस ribosomal लोड हो रहा है ट्रॅन के लिए एक विश्वसनीय संकेत बनाता हैslation और सक्रिय रूप से अवसादन दर के आधार पर mRNAs अनुवाद की जुदाई की अनुमति देता है. MRNAs अनुवाद की मात्रा का ठहराव के अलावा, अनुक्रम जानकारी अनुवाद विनियमन में शामिल रूपांकनों की पहचान करने के लिए प्राप्त किया जा सकता है. इसके अलावा बंधनकारी प्रोटीन और अन्य अनुवाद कारकों संबंधित विनियामक प्रोटीन का अध्ययन और खोज की सुविधा, विभिन्न भागों से अलग किया जा सकता आरएनए.
तंत्रिका तंत्र में, translational नियंत्रण ऐसे mRNA भंडारण, परिवहन और स्थानीय प्रोटीन संश्लेषण के रूप में प्रक्रियाओं से जोड़ा गया है. विकास शंकु अक्षतंतु 7 के बाकी हिस्सों से अलग mRNAs का एक विशिष्ट स्थानीयकृत पूल बंदरगाह दिखाया गया है. इसके अलावा, axons स्थानीय रूप से प्रोटीन 8,9 synthesize करने की क्षमता होती है. नतीजतन, अनुवाद के स्थानीय नियंत्रण तंत्रिका जीव विज्ञान में अध्ययन का एक महत्वपूर्ण विषय बन गया है. यह पता करने के polyribosome विभाजन के संभावित तकनीक के लिए इस्तेमाल किया गया था, जिसमें कई अध्ययनों में सचित्र किया गया हैरीढ़ की हड्डी के विकास में अक्षतंतु मार्गदर्शन की जांच, और मस्तिष्क 10,11 में BDNF की गतिविधि पर निर्भर अनुवाद का प्रदर्शन किया.
Protocol
सभी पशु प्रयोगों DKFZ के संस्थागत दिशा निर्देशों के अनुसार में प्रदर्शन किया गया.
सावधानी:, नमूने के RNAse प्रदूषण को रोकने RNAse संदूषण से बचने के लिए बुनियादी सावधानी बरतने और DEPC इलाज पानी के साथ सभी बफ़र्स तैयार करने के लिए.
सुक्रोज ढ़ाल के 1. तैयारी
- (देखें तालिका 1) 17.5, 25.6, 33.8, 41.9 और 50% sucrose के समाधान तैयार करें. धीरे - धीरे एक polyallomer ultracentrifuge ट्यूब के नीचे करने के लिए 50% sucrose के समाधान के 2 मिलीलीटर जोड़कर ढ़ाल की तैयारी शुरू. -80 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए ट्यूब रखकर परत रुक
- 17.5% sucrose को समाप्त होने के बीच में ठंड कदम के साथ सुक्रोज प्रतिशत को कम करने के बाद में परतों जोड़ें. अंतर्निहित परतों के विगलन को रोकने के क्रम में सुक्रोज के समाधान के अलावा दौरान बर्फ पर ढ़ाल रखें.
- हौसले से एक दिन पहले प्रयोग के सुक्रोज ढ़ाल को तैयार है और 4 डिग्री सेल्सियस पर रखना Alternativelवाई, प्रयोग से पहले रात 4 डिग्री सेल्सियस -80 डिग्री सेल्सियस और पिघलना पर, अग्रिम में दुकान ढ़ाल तैयार करते हैं.
2. ऊतक तैयारी (रीढ़ की हड्डी और / या मस्तिष्क)
- NaCl में Xylazin और Ketamin की एक ज्यादा से माउस anesthetize और transcardially जुड़े टेप पर राइबोसोम immobilizes जो 200 माइक्रोग्राम / एमएल CHX युक्त हांक संतुलित लवण समाधान (HBSS) का 20 मिलीलीटर के साथ छिड़कना. पैर के अंगूठे चुटकी करने के लिए गैर जवाबदेही से उचित anesthetization की पुष्टि करें.
- तेजी से ऊतक निकालें. कपाल पीठ की तरफ खोलें और मस्तिष्क निकाल सकते हैं. पूरे वक्ष और काठ कशेरुका स्तंभ की laminectomy प्रदर्शन और रीढ़ की हड्डी निकाल सकते हैं. क्रमश: पूरे मस्तिष्क (~ 400 मिलीग्राम) या रीढ़ की हड्डी (~ 90 मिलीग्राम) की एक 4 सेमी टुकड़ा, का प्रयोग करें.
- बर्फ के ठंडे homogenization बफर में ऊतक स्थानांतरण (देखें तालिका 1) (1 मिलीलीटर, मस्तिष्क: रीढ़ की हड्डी 4 एमएल) और cycloheximide की वृद्धि हुई तेज अनुमति देने के लिए एक स्वच्छ स्केलपेल के साथ छोटे टुकड़ों में पासा. Perfoआरएम बर्फ पर सभी आगे कदम.
- 15 मिनट के लिए सेते हैं और यंत्रवत् एक Dounce homogenizer का उपयोग ऊतक homogenize. सावधानी से नियंत्रित homogenization के नाभिक बरकरार रहने को सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है. सभी नमूनों तुलनात्मकता सुनिश्चित करने के लिए ठीक उसी तरह व्यवहार करते हैं. नोट: मस्तिष्क के ऊतकों के लिए: एक कसकर ढाले मूसल के साथ 5 स्ट्रोक से ऊतक बाधित. रीढ़ की हड्डी के ऊतकों के लिए: एक कसकर ढाले मूसल के साथ 5 आगे स्ट्रोक के बाद शिथिल फिटिंग मूसल के साथ 5 स्ट्रोक, द्वारा बाधित.
- Aliquots (मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी के लिए 200 μl के लिए 400 μl), कुल शाही सेना अलगाव के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर फ्लैश फ्रीज और दुकान ले लो.
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 500 XG पर centrifugation द्वारा नाभिक और undisrupted सेल और ऊतक टुकड़े निकालें कम गति centrifugation राइबोसोम के नुकसान से बचाता है.
- एनपी 40 जोड़ने और सोडियम deoxycholate डिटर्जेंट (1% की एक अंतिम एकाग्रता के लिए प्रत्येक) से 30 मिनट के लिए नाभिक मुक्त सतह पर तैरनेवाला में lyse झिल्ली टुकड़े.
- यह कदम अन्यथा polyribosome प्रोफ़ाइल में संकेत मुखौटा होगा जो नमूना से फैटी घटकों को हटा. सबसे पहले, पूर्व ठंड ultracentrifuge बाल्टी और 4 डिग्री सेल्सियस पर रोटर और 2 मीटर, 1.1 एम तैयार है और 0.9 एम sucrose के समाधान (1 टेबल देखें).
- 2 एम sucrose के समाधान का एक 1.22 संस्करणों के साथ lysate मिलाएं और एक पॉलीथीन ultracentrifuge ट्यूब में हस्तांतरण. 1.1 एम sucrose के समाधान के साथ 10 मिलीलीटर के बराबर मात्रा के लिए सभी ट्यूबों भरें, उसके बाद 0.9 एम sucrose के समाधान के साथ सावधानी से यह उपरिशायी.
- पूर्व ठंडा ultracentrifuge बाल्टी में ultracentrifuge ट्यूबों रखें. 4 डिग्री सेल्सियस पर 100,000 XG पर 3 घंटे के लिए अपकेंद्रित्र फैटी घटक नाव और सतह पर तैरनेवाला में रहते हैं, जबकि इस प्रक्रिया के दौरान गोली में जमा हो जाते हैं राइबोसोम.
4. Sucrose के ढाल Fractionation
- सतह पर तैरनेवाला निकालें और homogenization बफर बी में गोली भंग (देखें तालिका 1
- पूर्व ठंडा ultracentrifuge बाल्टी में (तैयारी पिछले भाग में वर्णित है) सुक्रोज ढ़ाल रखें. ढाल के शीर्ष पर ध्यान से परत के नमूने. तकनीकी नियंत्रण के रूप में एक खाली sucrose ढाल जोड़ें.
- Homogenization बफर के साथ प्रत्येक बाल्टी का वजन को समायोजित करें. 4 डिग्री सेल्सियस पर 285,000 XG पर 1.5 घंटे के लिए नमूने अपकेंद्रित्र
- Centrifugation के अंत से पहले Isco fractionator 30 मिनट की तैयारी शुरू. Fractionator का एक और मॉडल का उपयोग किया जाता है, तो निर्माता प्रोटोकॉल का पालन करें.
- यूवी दीपक के लिए उपयुक्त संवेदनशीलता (मस्तिष्क या रीढ़ की हड्डी के लिए 0.05 AUFS के लिए 0.2 AUFS) सेट और ऊपर वार्मिंग के लिए उस पर स्विच. यह ट्यूब बेधनेवाला के माध्यम से 60% sucrose के समाधान के लिए रोलिंग पंप के माध्यम से कनेक्ट, ट्यूब बेधनेवाला इकट्ठे.
- सुक्रोज (प्रवाह चूहा पम्पिंग द्वारा सेटअप का परीक्षणई: 1 मिलीग्राम / मिनट), विशेष रूप से ढाल में बुलबुले को लागू करेगा जो tubings में कोई लीक सुनिश्चित करें कि वहाँ.
- मैन्युअल रूप से यूवी डिटेक्टर में ढाल बफर पम्पिंग और आधारभूत संशोधन द्वारा खाली पृष्ठभूमि अवशोषण.
- ध्यान से रोटर से sedimented नमूनों के साथ सुक्रोज ढ़ाल युक्त ultracentrifuge बाल्टी हटाने और बर्फ पर उन्हें जगह है. संकल्प के नुकसान को रोकने के लिए ढ़ाल के किसी भी bumping से बचें.
- Fractionator पर चलाने के लिए ढ़ाल. पहली पृष्ठभूमि अवशोषण का आकलन और उचित तकनीकी सेटअप सुनिश्चित करने के लिए खाली ढ़ाल चलाएँ.
- यूवी डिटेक्टर को ढाल देते हैं और ट्यूब बेधनेवाला के साथ ट्यूब के नीचे घुसाना. ऊपर की ओर यूवी डिटेक्टर के माध्यम से और ड्रॉप की मशीन में sedimented नमूनों के साथ ढाल विस्थापित होंगे जो 60% sucrose के पंप, शुरू करो.
- 260 एनएम पर absorbance sedimenta का संकेत चोटियों के साथ, नमूना के लिए अवशोषण प्रोफाइल उत्पन्न करने के लिए दस्तावेज हैribosomal सब यूनिटों, monosomes, और राइबोसोम के बाद बढ़ती हुई संख्या के साथ जुड़े mRNAs का tion.
- (2 मिलीलीटर ट्यूब में 600 μl प्रत्येक), ड्रॉप निकालने की मशीन के माध्यम से 20 भागों में नमूने ले लीजिए.
व्यक्तिगत भागों से 5. शाही सेना अलगाव
- व्यक्तिगत भिन्न करने के लिए 1% की एक अंतिम एकाग्रता के लिए 10% एसडीएस जोड़ने और प्रोटीन प्रकट करना और राइबोसोम अलग कर देना करने के क्रम में अच्छी तरह से मिश्रण. इस बिंदु पर नमूने -80 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए किया जा सकता है संबोधित करने की सवाल पर निर्भर करता है, भिन्न absorbance के प्रोफाइल के अनुसार जमा किया जा सकता है.
- यह भी डीएनए की contaminating निशान को हटा जो अम्लीय फिनोल / क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण, साथ शाही सेना को अलग.
- प्रत्येक नमूने के लिए (आर टी के लिए prewarmed) अम्लीय फिनोल / क्लोरोफॉर्म की एक मात्रा में जोड़ें, 10 65 डिग्री सेल्सियस न्यूनतम और बाद में धूआं हुड के तहत रिहाई के दबाव के लिए गर्मी.
- आरटी पर 17,000 XG पर 20 मिनट के लिए नमूने अपकेंद्रित्र. ध्यान से एक नया 1.5 मिलीलीटर जलीय चरण हस्तांतरणट्यूब. जलीय चरण Centrifugation के बाद नीचे हो सकता है, जहां सघन सुक्रोज भिन्न, में चरण उलटा से अवगत रहें.
- शाही सेना वेग के क्रम में एक isopropanol की मात्रा, 1/9 मात्रा सोडियम एसीटेट (5.2 पीएच) और प्रत्येक नमूने के 1 μl GlycoBlue जोड़ें. -80 डिग्री सेल्सियस पर नमूनों में कम से कम 1 घंटा रखें
- 17,000 XG और 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र GlycoBlue गोली के दृश्य प्रदान करता है. सतह पर तैरनेवाला निकालें, बर्फ के ठंडे 80% इथेनॉल और शुष्क हवा गोली के साथ एक बार गोली धोने. RNase मुफ्त पानी में गोली भंग.
- Nanodrop द्वारा शाही सेना की मात्रा और एक Bioanalyzer चिप से शाही सेना अखंडता का विश्लेषण. प्रस्तुत प्रोटोकॉल द्वारा प्राप्त की है जो शाही सेना माइक्रोएरे और गहरी अनुक्रमण सहित कला उच्च throughput assays के सभी राज्य के लिए उपयुक्त है.
Representative Results
चित्रा 2 विभाजन के बाद प्रतिनिधि polyribosome के प्रोफाइल से पता चलता है. सेल लाइनों के लिए पहले वर्णित के रूप में मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी की प्रोफाइल विशिष्ट अवशोषण घटता दिखा. छोटे ribosomal सब यूनिटों (40) लाइटर अंशों पर तलछट और करने के लिए बाध्य mRNAs बड़े ribosomal सबयूनिट (60) और monosome (80) बाध्य mRNAs द्वारा पीछा प्रोफाइल पर एक चोटी के रूप में पहली बार दिखाई देते हैं. कई राइबोसोम के लिए बाध्य mRNAs बाद चोटियों बाध्य राइबोसोम की बढ़ती संख्या का संकेत के साथ, भारी अंशों में तलछट. ग्लोबल अनुवाद प्रोफाइल से मूल्यांकन किया जा सकता. एक उदाहरण के रूप में, मस्तिष्क के ऊतकों और अधिक सक्रिय अनुवाद का संकेत है, रीढ़ की हड्डी के ऊतकों की तुलना अनुपात monosome के लिए एक उच्च polyribosome है.
व्यक्तिगत भागों से निकाले शाही सेना 18S और 28S rRNA का वितरण दिखा, Bioanalyzer द्वारा मूल्यांकन किया गया. 18S rRNA छोटे ribosomal सब यूनिटों हल्का sucr में sedimenting के अनुसार, प्रोफाइल में पहले दिखाई देता है OSE भिन्न. कुल शाही सेना की विशिष्ट पैदावार मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी के लिए 2-4 ग्राम के लिए 10-20 ग्राम हैं. व्यक्तिगत भागों से शाही सेना पैदावार अंश के आधार पर क्रमश: 4 ग्राम और मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी के लिए 0.8 ग्राम तक कर रहे हैं. एक खाली sucrose ढाल पहले से ही कारण डीटीटी की उपस्थिति के लिए, 260 एनएम पर कुछ पृष्ठभूमि अवशोषण से पता चलता है. इस पृष्ठभूमि नमूना मूल्यों को सामान्य करने के क्रम में डेटा विश्लेषण के दौरान घटाया जा सकता है. EDTA उपचार अवसादन प्रोफाइल अनुवाद की वजह से है, प्रदर्शन polyribosome चोटियों ढह गई.
चित्रा 1. कार्यप्रवाह और vivo में polyribosome विभाजन के संभावित अनुप्रयोगों.> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
साथ खाली ढाल और मस्तिष्क की और बिना चित्रा 2. (ए) मस्तिष्क और Bioanalyzer द्वारा निकाले शाही सेना के आकलन के साथ रीढ़ की हड्डी, की विशिष्ट polyribosome प्रोफाइल. (बी) QRT-पीसीआर से भिन्न अधिक GAPDH mRNA का वितरण. (सी) Polyribosome प्रोफाइल्स EDTA इलाज. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
| 1.1 | 2x ढाल बफर | 30 मिमी Tris-एचसीएल pH7.4, 30 मिमी 2 MgCl, 600 मिमी NaCl, 200 ग्राम / मिलीलीटर cycloheximide (CHX), 2mm dithiothreitol (डीटीटी) | |
| 1.1 | sucrose के समाधान 17.5% | 8.67 जी सुक्रोज, ढाल बफर 2x 25 एमएल, ऊपर से 50 मिलीलीटर DEPC एच 2 0 | |
| 1.1 | sucrose के समाधान 25.6% | 12.8 ग्राम सुक्रोज, ढाल बफर 2x 25 एमएल, ऊपर से 50 मिलीलीटर DEPC एच 2 0 | |
| 1.1 | sucrose के समाधान 33.8% | 16.9 ग्राम सुक्रोज, ढाल बफर 2x 25 एमएल, ऊपर से 50 मिलीलीटर DEPC एच 2 0 | |
| 1.1 | sucrose के समाधान 41.9% | 20.95 ग्राम सुक्रोज, ढाल बफर 2x 25 एमएल, ऊपर से 50 मिलीलीटर DEPC एच 2 0 | |
| 1.1 | sucrose के समाधान 50% | 25 ग्राम सुक्रोज, ढाल बफर 2x 25 एमएल, ऊपर से 50 मिलीलीटर DEPC एच 2 0 | |
| 2.3 | homogenizationबफर | 0.25 एम sucrose, 50 मिमी Tris / एचसीएल, pH7.4), 5 मिमी 2 MgCl, 25 मिमी KCl | 200 माइक्रोग्राम / एमएल CHX, 1x रॉश पूरा protease अवरोध, 1 मिमी डीटीटी, 1mm phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF), 100 यू / एमएल RNAsin |
| 3.1 | 2M sucrose के समाधान | 68.4% sucrose, 50 मिमी Tris-एचसीएल, pH7.4, 5 मिमी 2 MgCl, 25 मिमी KCl | 100 माइक्रोग्राम / एमएल CHX, 1x रॉश पूरा protease अवरोध, 1 मिमी डीटीटी, 1 मिमी PMSF |
| 3.1 | 1.1m sucrose के समाधान | 38.5% sucrose, 50 मिमी Tris-एचसीएल, pH7.4, 5 मिमी 2 MgCl, 25 मिमी KCl | 100 माइक्रोग्राम / एमएल CHX, 1x रॉश पूरा protease अवरोध, 1 मिमी डीटीटी, 1 मिमी PMSF |
| 3.1 | 0.9m sucrose के समाधान | 30.8% sucrose, 50 मिमी Tris-एचसीएल, pH7.4, 5 मिमी 2 MgCl, 25 मिमी KCl | 100 माइक्रोग्राम / एमएल CHX, 1x रॉश पूरा protease अवरोध, 1 मिमी डीटीटी, 1 मिमी PMSF |
| 4.1 | जomogenization बी बफर | 0.25 एम sucrose, 50 मिमी Tris / एचसीएल, pH7.4, 5 मिमी 2 MgCl, 25mm KCl, 1% एनपी 40, 1% सोडियम deoxycholate | 200 माइक्रोग्राम / एमएल CHX, 1x रॉश पूरा protease अवरोध, 1 मिमी डीटीटी, 1 मिमी PMSF, 100 यू / एमएल RNAsin |
Buffers और समाधान की तालिका 1. सूची.
Discussion
Polyribosome fractionation एक उपन्यास तकनीक नहीं है, यह एक विशेष रूप से चुनौतीपूर्ण बनी हुई है. इनपुट सामग्री के आधार पर पर्याप्त अनुकूलन आवश्यक हो सकता है. यह विशेष रूप से सामग्री की राशि अक्सर ऊतक घटकों का अनुवाद mRNAs का अलगाव बाधा एक सीमा और वसायुक्त है जहां vivo में सीएनएस के नमूने, के लिए मामला है. अधिकांश प्रकाशित fractionation प्रोटोकॉल खमीर या स्तनधारी सेल लाइनों के साथ सौदा है, और मस्तिष्क 12,13,14 के लिए स्थापित प्रोटोकॉल रहे हैं. इसके विपरीत, रीढ़ की हड्डी डोरियों के विभाजन का वर्णन किसी भी प्रकाशन मुश्किल से कर रहे हैं, और पिछले प्रोटोकॉल 15 जमा होने के लिए पशुओं की एक बड़ी संख्या से रीढ़ की हड्डी की आवश्यकता होती है. इन कारणों के लिए, कई आवश्यक संशोधनों के एकल माउस रीढ़ की हड्डी सहित सीएनएस ऊतकों, के लिए fractionation प्रोटोकॉल अनुकूलन करने के लिए किए गए थे. Cycloheximide साथ राइबोसोम स्थिरीकरण ड्यूरिन राइबोसोम की हदबंदी से बचने के लिए पशु छिड़काव के दौरान किया जाता हैऊतक निष्कर्षण के छ लंबी प्रक्रिया. बाद में, polysomal RNAs polyribosome उपज को अधिकतम करने के लिए एक विशेष तरीके से निकाले जाते हैं. सबसे पहले, douncing से ऊतक के homogenization नियंत्रित बरकरार नाभिक रहता है और डीएनए संक्रमण से बचाता है. नाभिक तो centrifugation द्वारा मज़बूती से निकाल दिया जाता है. डिटर्जेंट एनपी 40 और सोडियम deoxycholate के संयोजन जालिका और इसकी झिल्ली जुड़े राइबोसोम की रिहाई के lysis सुनिश्चित करता है. इसके अलावा, लिपिड अमीर माइलिन के भीतर यूवी अवशोषित घटकों polyribosome प्रोफाइल के अस्पष्ट. ऐसे polyribosomes के रूप में घने यौगिकों pelleted और ऐसे माइलिन नाव के रूप में हल्का यौगिकों और 16 को हटा रहे हैं, जहां माइलिन प्लवनशीलता, इसलिए आवश्यक है. Polyribosomes तो एक 17.5% से 50% sucrose ढाल से अधिक sedimented रहे हैं. इसके बजाय स्वयं प्रत्येक सुक्रोज परत लेयरिंग और ठंड की, ढ़ाल भी एक ढाल मिक्सर का उपयोग कर तैयार किया जा सकता है. अम्लीय फिनोल / क्लोरोफॉर्म का उपयोग भागों से शाही सेना की निकासी की अनुमति देता है विकासएनए न्यूनतम शाही सेना के नुकसान के साथ हटाया जा सके. हालांकि, चरण उलटा (अंश 16 से ऊपर) घने सुक्रोज अंशों पर हो सकता है.
इस प्रोटोकॉल अनुवाद का स्तर पता है कि अन्य पारंपरिक तरीकों से अधिक लाभ प्रदान करता है. उदाहरण के लिए, phosphorylated S6 (एक प्रमुख अनुवाद मार्कर) की माप के साथ ही radioisotopes के साथ नवजात चेन की लेबलिंग दोनों वैश्विक अनुवाद के स्तर के बारे में जानकारी दे, लेकिन विशेष रूप से अनुवाद किया जा रहा है पर थोड़ा पता चलता है. Polyribosome विभाजन, दूसरे हाथ पर, मूल्यांकन वैश्विक अनुवाद के लिए न केवल, लेकिन यह भी अनुवाद के mRNAs और संबंधित नियामक प्रोटीन की पहचान की अनुमति देता है. मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर चयनित mRNAs के बाहर एक त्वरित पढ़ने के लिए अलग RNAs पर प्रदर्शन किया जा सकता है, और प्रोटीन और अगली पीढ़ी शाही सेना अनुक्रमण जीनोम विस्तृत अध्ययन के लिए किया जा सकता है. यहाँ प्रस्तुत अनुकूलन इसलिए कम, तकनीक सीएनएस ऊतकों की न्यूनतम मात्रा के साथ इस्तेमाल किया जा करने की अनुमतिजरूरत जानवरों की संख्या आईएनजी और ऊतक प्रसंस्करण समय को कम करके समग्र प्रयोगात्मक गुणवत्ता में सुधार. दूसरी ओर, इस तकनीक का अनुवाद करने वाले से ठप राइबोसोम भेद नहीं कर सकते. ठप राइबोसोम ले जाने देखिए भारी अंशों में तलछट जाएगा, और डेटा की व्याख्या करते समय इस बात को ध्यान में रखा जाना चाहिए.
राइबोसोम एक सेल प्रकार विशिष्ट ढंग से क्रमश मिलान टैग या पत्रकारों के साथ लेबल और immunoprecipitation 17,18 से अलग mRNAs जुड़े रहे हैं, जिनमें हाल की सूचना तकनीक, अर्थात् RiboTaq और जाल, कर रहे हैं. इस तकनीक को विशेष सेल आबादी के लिए बाहर पढ़ने के उच्च संकल्प की पेशकश करने के लिए विभाजन polyribosome के लिए युग्मित किया जा सकता है. राइबोसोम फुट मुद्रण राइबोसोम द्वारा संरक्षित हैं कि mRNAs का एक और उपन्यास छोटे टुकड़े उत्पन्न करने के लिए nuclease पाचन शामिल है कि तकनीक, या "पैरों के निशान" है. पुस्तकालय तो इन पैरों के निशान से उत्पन्न और अनुक्रम रहे हैं. इस विधि Provअनुवाद पर एक कोडोन विशिष्ट पूरे जीनोम विश्लेषण इडस और ठप राइबोसोम की पहचान करने में सक्षम है, गैर-Aug codons और polyribosome fractionation 19 द्वारा प्राप्त नहीं किया जा सकता है, जो छोटी नदी के ऊपर खुला पढ़ने फ्रेम, शुरू करते हैं. हालांकि, polyribosome विभाजन इस प्रकार उच्च नमूना पवित्रता अक्सर आवश्यक है जिसमें पुस्तकालय तैयारी के लिए आवश्यक आणविक प्रजातियों के लिए समृद्ध, एकल राइबोसोम युक्त पचा टुकड़े के अलगाव के लिए राइबोसोम की रूपरेखा के लिए युग्मित किया जा सकता है. साथ में ले ली, polyribosome fractionation स्थायी महत्व के साथ एक लचीला तरीका है और अगली पीढ़ी के अनुक्रमण तरह जीनोम चौड़ा assays सहित विभिन्न बहाव के अनुप्रयोगों के लिए युग्मित किया जा सकता है.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
यह काम शिक्षा और अनुसंधान के जर्मन संघीय मंत्रालय (BMBF), (सिस्टम्स बायोलॉजी पर Helmholtz एलायंस) कैंसर में संकेत के सिस्टम्स बायोलॉजी और जर्मन कैंसर रिसर्च सेंटर (DKFZ) द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hank’s balanced salts solution | Gibco | 14170-138 | |
| Tube, Thinwall, Polyallomer, 14 ml, 14 x 95 mm | Beckman Coulter | 331374 | |
| Diethylpyrocarbonate | Sigma | D5758 | caution |
| Cycloheximide | Sigma | C7698 | danger |
| Dithiothreitol | Sigma | 43815 | warning |
| Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche | 11697498001 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride solution | Sigma | 93482 | danger |
| RNasin Plus RNase Inhibitor | Promega | N2611 | |
| Nonidet P-40 | Roche | 11332473001 | danger |
| Sodium deoxycholate | Sigma | D6750 | warning |
| Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) | Ambion | AM9722 | danger |
| GlycoBlue | Invitrogen | AM9516 | |
| Equipment | |||
| Dounce Tissue Grinder, 1 ml/7 ml | Wheaton | 357538/357542 | |
| Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | ||
| SW 40 Ti Rotor, Swinging Bucket, Titanium, 6 x 14 ml, 40,000 rpm, 285,000 x g | Beckman Coulter | 331302 | |
| Density Gradient Fractionator | Teledyne Isco | ||
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies |
References
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