Summary
Este protocolo ilustra modificações essenciais da polyribosome fraccionamento, a fim de estudar o translatome in vivo de amostras do SNC. Ele permite que a avaliação global de tradução e transcrição regulação através do isolamento e comparação de RNA total para ribossomo frações de RNA ligado.
Abstract
Vários processos estão envolvidas na expressão de genes, incluindo a transcrição, tradução e estabilidade de ARNm e proteínas. Cada uma dessas etapas são fortemente regulados, afetando a dinâmica finais da abundância de proteínas. Existem vários mecanismos de regulação na etapa de tradução, tornando os níveis de mRNA só um indicador fiável da expressão gênica. Além disso, a regulação local da tradução do mRNA tem sido particularmente implicado em funções neuronais, mudando 'translatomics' para o foco de atenção em neurobiologia. O método apresentado pode ser usado para transcriptomics ponte e proteômica.
Aqui nós descrevemos modificações essenciais para a técnica de fracionamento polyribosome, que interroga o translatome baseada na associação de mRNAs ativamente traduzido para vários ribossomos e sua sedimentação diferencial em gradientes de sacarose. Tradicionalmente, o trabalho com em amostras in vivo, particularmente do Central sistema nervoso central (SNC), tem se mostrado um desafio devido às quantidades limitadas de material ea presença de componentes de tecido adiposo. A fim de solucionar este problema, o protocolo descrito é especificamente optimizado para utilização com uma quantidade mínima de material de CNS, como demonstrado pela utilização de um único rato medula espinal e do cérebro. Resumidamente, os tecidos do SNC são extraídos e ribossomas traduzindo são imobilizados em mRNAs com ciclo-heximida. Mielina flutuação é então realizada para remover lipídeos componentes ricos. O fraccionamento é realizado em um gradiente de sacarose em que os mRNAs são separados de acordo com a sua carga ao ribossoma. As frações isoladas são adequados para uma série de ensaios a jusante, incluindo as novas tecnologias de análise do genoma de largura.
Introduction
A expressão de genes é determinado pela acção combinada de transcrição, tradução e estabilidade de ARNm e proteínas, com tradução tendo o efeito mais predominante 1. É agora evidente que cada um destes passos é altamente regulado. Micro-RNAs, a formação de grânulos de RNA, alternativa e poliadenilação citoplasmática são alguns exemplos de regulação pós-transcricional da expressão gênica 2,3. Cada um destes mecanismos de transcrição desacopla da tradução e influencia o proteoma do sistema biológico de interesse. Assim, sem surpresa, os níveis de mRNA por si só são uma leitura imperfeita dos níveis de proteína 4. Proteômica quantitativa fornece a avaliação mais direta da expressão do gene, no entanto, apesar dos avanços recentes, ainda há limitações consideráveis na sensibilidade e resolução seqüência da proteína. Portanto, a abordagem translatome, o repertório de mRNAs traduzindo, oferece um excelente compromisso entre o estudo datranscriptoma e proteoma. É mais preciso do que transcriptomics em avaliar a expressão gênica final, e fornece maior cobertura e resolução seqüência de proteômica.
Em sistemas de mamíferos, a maioria dos eventos de tradução começar via iniciação dependente do cap. Um grupo de factores de iniciação eucarióticas conjuntamente com a subunidade ribossomal 40S montar a tampa de extremidade 5 'de um mRNA. O complexo, em seguida, verifica o mRNA e ao chegar ao início códon agosto, recruta a subunidade ribossômica 60S para formar uma completa 80S dos ribossomas. O alongamento da fase prossegue com o ribossoma se deslocam ao longo do mRNA, com factores de alongamento auxiliar a incorporação de aminoácidos a partir de ARNt carregados para a cadeia de péptido nascente. Várias ribossomas pode prosseguir ao longo de um único mRNA, simultaneamente, e o número de ribossomas associados foi demonstrado haver uma correlação com a taxa de síntese de proteína de 5,6. Isso faz com que o carregamento ribossômica uma indicação fiável para translation e permite a separação de traduzir ARNm activamente com base na taxa de sedimentação. Além disso a quantificação de traduzir ARNm, a informação da sequência pode ser obtida para identificar motivos envolvidos na regulação de tradução. RNA também proteínas de ligação e outros factores de tradução podem ser isolados a partir de diferentes fracções, facilitando o estudo e descoberta de proteínas reguladoras associadas.
No sistema nervoso, o controlo da tradução foi ligada a processos, tais como a armazenagem de ARNm, o transporte e síntese de proteínas local. Cones de crescimento têm sido mostrados para abrigar uma piscina específica localizada do ARNm distintas do resto do axónio 7. Além disso, os axónios possuem a capacidade de sintetizar localmente proteínas 8,9. Como resultado, o controle local da tradução se tornou um tema crucial do estudo em neurobiologia. O potencial de polyribosome fraccionamento para resolver este tenha sido ilustrada em vários estudos, nos quais foi utilizada a técnica deinvestigar orientação axônio no desenvolvimento da medula espinhal, e demonstrou a tradução dependente de atividade de BDNF no cérebro 10,11.
Protocol
Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com as diretrizes institucionais do DKFZ.
Cuidado: A fim de evitar a contaminação de RNAse de amostras, tomar precauções básicas para evitar a contaminação de RNAse e preparar todos os tampões com água tratada com DEPC.
1. Preparação de gradientes de sacarose
- Prepare a 17,5, 25,6, 33,8, 41,9 e soluções de sacarose a 50% (ver Tabela 1). Comece a preparar gradientes adicionando lentamente 2 mL de solução de sacarose a 50% para o fundo de um tubo de polialómero ultracentrífuga. Congelar a camada pela colocação de tubos durante 20 minutos à temperatura de -80 ° C.
- Adicione as camadas subsequentes a diminuir porcentagens de sacarose com as etapas de congelamento entre eles, acabando com até 17,5% de sacarose. Manter gradientes de gelo durante a adição de soluções de sacarose a fim de evitar que a descongelação das camadas subjacentes.
- Preparar gradientes de sacarose recentemente um dia antes da utilização e manter a 4 ° C. Alternatively, preparar gradientes de antecedência, armazenar a -80 ° C e descongelamento, a 4 ° C a noite anterior à experiência.
2. Preparação de Tecidos (Cord e / ou cérebro espinhal)
- Anestesiar rato por uma overdose de cetamina e xilazina em NaCl e transcardialmente perfundir com 20 ml de solução de sais equilibrada de Hank (HBSS) contendo 200 ug / ml CHX que imobiliza ribossomas em transcritos associados. Confirme anesthetization adequada por não-resposta às pitadas dedo do pé.
- Extrair tecido rapidamente. Abra o dorsal crânio e extrair o cérebro. Realizar laminectomia de toda a coluna vertebral torácica e lombar, e extrair a medula espinhal. Use cérebro inteiro (~ 400 mg) ou um pedaço de 4 cm da medula espinhal (~ 90 mg), respectivamente.
- Transferir tecido em gelo frio homogeneização tampão A (ver Tabela 1) (medula espinal: 1 ml; cérebro: 4 ml) e dice em pedaços pequenos com um bisturi limpa para permitir o aumento da absorção de cicloheximida. Perform todos os outros passos no gelo.
- Incubar durante 15 min e homogeneizar o tecido mecanicamente utilizando um homogeneizador Dounce. Homogeneização cuidadosamente controlada é necessário para assegurar que os núcleos permanecem intactos. Trate todas as amostras exatamente da mesma maneira para assegurar a comparabilidade. Nota: para o tecido cerebral: Disrupt tecido por 5 golpes com um pilão bem justa. Para tecido da medula espinhal: interromper por cinco golpes com um pilão vagamente montagem, seguidos por 5 mais golpes com um pilão bem justa.
- Tome alíquotas (400 mL para o cérebro e 200 mL de medula espinhal), congelamento flash e armazenar a -80 ° C para o isolamento de RNA total.
- Retirar núcleos e células ininterrupto e fragmentos de tecido através de centrifugação a 500 xg durante 10 min a 4 ° C. Centrifugação a baixa velocidade evita a perda dos ribossomos.
- Fragmentos de membrana Lyse no sobrenadante livre de núcleos de 30 min por adição de NP-40 e desoxicolato de sódio detergentes (cada um a uma concentração final de 1%).
- Este passo remove componentes gordos da amostra que de outra forma mascarar o sinal no perfil polyribosome. Primeiro, baldes ultracentrífuga pré-frio e rotor a 4 ° C e preparar 2 M, 1,1 M e 0,9 M soluções de sacarose (ver Tabela 1).
- Misturar com um lisado 1,22 volumes de solução 2 M de sacarose e transferir para um tubo de ultracentrífuga polietileno. Encha-se todos os tubos para igual volume de 10 ml com 1,1 M solução de sacarose, depois cobri-la com cuidado e com 0,9 M solução de sacarose.
- Coloque os tubos ultracentrífuga em baldes ultracentrífuga pré-refrigerados. Centrifugar durante 3 horas a 100.000 x g a 4 ° C. Durante este processo os ribossomas se depositam no sedimento enquanto componentes gordos flutuam e permanecem no sobrenadante.
4. Sacarose Gradiente Fracionamento
- Remover o sobrenadante e dissolve-se o pellet em tampão de homogeneização B (ver Tabela 1
- Coloque gradientes de sacarose (a preparação é descrita numa secção anterior) para os baldes ultracentrífuga previamente arrefecidos. Amostras da camada cuidadosamente em cima do gradiente. Adicionar um gradiente de sacarose em branco como controle técnico.
- Ajustar o peso de cada balde com o tampão de homogeneização. Centrifugue as amostras de 1,5 h a 285.000 x g a 4 ° C.
- Começar a preparar a Isco fraccionador 30 minutos antes do final de centrifugação. Se um outro modelo de fraccionador é usado, seguir o protocolo do fabricante.
- Defina a sensibilidade adequada (0,2 AUFS para o cérebro ou 0,05 AUFS para medula espinhal) para a lâmpada UV e ligá-lo para aquecer. Monte o piercer tubo, conectá-lo através da bomba de rolamento para solução de sacarose 60% através do piercer tubo.
- Teste a instalação por bombeamento rato sacarose (fluxoe: 1 ml / min), em particular se certificar de que não há vazamentos nas tubulações que irá introduzir bolhas no gradiente.
- Absorção de fundo branco, bombeando manualmente tampão gradiente para o detector UV e correção de linha de base.
- Remova cuidadosamente os baldes ultracentrífuga contendo os gradientes de sacarose com amostras sedimentadas do rotor e colocá-los no gelo. Evite qualquer colisão de gradientes para evitar a perda de resolução.
- Gradientes executado no fraccionamento. Execute gradientes vazios primeiro a avaliar absorção de fundo e garantir a configuração técnica adequada.
- Anexar gradiente para o detector de UV e perfurar o fundo do tubo com o tubo de perfurador. Iniciar o bombeamento de 60% de sacarose, o qual irá desalojar o gradiente com amostras sedimentados para cima, através do detector de UV e para a conta-gotas.
- A absorvância a 260 nm está documentado para gerar o perfil de absorção da amostra, com picos que indicam a sedimentaçãoção de mRNAs associados subunidades ribossomais, monosomes e, posteriormente, aumento do número de ribossomos.
- Coletar amostras em 20 frações por meio do conta-gotas (600 mL cada, em tubos de 2 ml).
5. Isolamento de ARN a partir de fracções individuais
- Adicionar 10% de SDS para uma concentração final de 1% para as fracções individuais e misturar bem, a fim de se desdobrar proteínas e dissociar os ribossomas. Neste ponto, as amostras podem ser congeladas a -80 ° C. Dependendo da questão a ser abordada, frações podem ser agrupados de acordo com o perfil de absorção.
- Isolar o ARN com a extracção com fenol / clorofórmio, ácido, que também remove os traços de contaminantes de ADN.
- Adicionar um volume de ácido fenol / clorofórmio (pré-aquecido até à temperatura ambiente), para cada amostra, o calor durante 10 min a 65 ° C e pressão de libertação sob a coifa depois.
- Centrifugue as amostras durante 20 min a 17.000 x g à temperatura ambiente. Transferir cuidadosamente fase aquosa para um novo 1,5 mltubo. Esteja ciente de inversão de fase em frações de sacarose mais densas, onde a fase aquosa pode estar no fundo após a centrifugação.
- Adicionar um volume de isopropanol, 1/9 do volume de acetato de sódio (pH 5,2) e 1 pi GlycoBlue para cada amostra, a fim de precipitar o RNA. Manter as amostras, pelo menos, 1 hora a -80 ° C.
- Centrifugar durante 30 minutos a 17.000 xg e 4 ° C. GlycoBlue proporciona a visualização da pelota. Remover o sobrenadante, lavar pellet uma vez com o frio do gelo etanol 80% e ar pellet seco. Dissolver sedimento em RNAse livre água.
- Quantificar quantidade de RNA por Nanodrop e analisar a integridade do RNA por um chip Bioanalyzer. ARN, que é obtido pelo protocolo apresentado é adequado para todos os estado da arte, incluindo ensaios de elevado rendimento de microarray e sequenciação de profundidade.
Representative Results
A Figura 2 mostra os perfis representativos polyribosome após fraccionamento. Os perfis de cérebro e medula espinal mostram as curvas de absorção características tal como descrito antes para as linhas celulares. mRNAs ligados a pequenas subunidades ribossomais (40S) de sedimentos de fracções mais leves e aparece em primeiro lugar como um pico no perfil, seguido da grande subunidade ribossomal (60s) e (80S) monosome mRNAs ligados. mRNAs ligados a vários ribossomos sedimentos em fracções mais pesadas, com os picos mais tarde indicando aumento do número de ribossomos ligados. Tradução global pode ser avaliada a partir do perfil. Como um exemplo, o tecido cerebral tem um polyribosome superior a monosome proporção do que o tecido da medula espinal, indicando mais activa de tradução.
ARN extraído de fracções individuais foram avaliadas por Bioanalyzer, mostrando a distribuição de 18S e 28S rRNA. 18S rRNA aparece mais cedo no perfil, de acordo com as pequenas subunidades ribossomais sedimente em sucr isqueiro frações OSE. Os rendimentos típicos de ARN total são de 10-20 ug de cérebro e 2-4 ug de medula espinhal. Rendimentos de ARN a partir de fracções individuais são de até 4 mg e 0,8 mg de cérebro e medula espinal, respectivamente, em função da fracção. Um gradiente de sacarose em branco já mostra alguma absorção de fundo a 260 nm, devido à presença de DTT. Este fundo pode ser subtraída durante a análise de dados, a fim de normalizar os valores da amostra. Tratamento com EDTA colapso dos picos polyribosome, demonstrando o perfil de sedimentação é devido à tradução.
Figura 1. Workflow e aplicações potenciais in vivo polyribosome fracionamento.> Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Perfis Figura 2. (A) Perfis polyribosome típicas do cérebro e da medula espinhal, com a avaliação de RNA extraído por Bioanalyzer. (B) Distribuição do ARNm de GAPDH sobre fracções por qRT-PCR. (C) Polyribosome de gradiente vazio e cérebro com e sem tratamento EDTA. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| 1.1 | Tampão gradiente 2x | 30 mM Tris-HCl pH 7,4, 30 mM de MgCl 2, 600 mM de NaCl, 200 ug / ml de ciclo-heximida (CHX), 2 mM de ditiotreitol (DTT) | |
| 1.1 | a solução de sacarose de 17,5% | 8,67 g de sacarose, 25 ml de 2 x tampão de gradiente, de até 50 ml de H 2 0 DEPC | |
| 1.1 | a solução de sacarose de 25,6% | 12,8 g de sacarose, 25 ml de 2 x tampão de gradiente, de até 50 ml de H 2 0 DEPC | |
| 1.1 | a solução de sacarose de 33,8% | 16,9 g de sacarose, 25 ml de 2 x tampão de gradiente, de até 50 ml de H 2 0 DEPC | |
| 1.1 | solução de sacarose de 41,9% | 20,95 g de sacarose, 25 ml de 2 x tampão de gradiente, de até 50 ml de H 2 0 DEPC | |
| 1.1 | solução de sacarose a 50% | 25 g de sacarose, 25 ml de 2 x tampão de gradiente, de até 50 ml de H 2 0 DEPC | |
| 2.3 | homogeneizaçãotampão A | 0,25 M de sacarose, 50 mM Tris / HCl, pH 7,4), MgCl2 5 mM, KCl 25 mM | 200 ug / ml de CHX, 1x Roche inibidor de protease completo, DTT 1 mM, phenylmethanesulfonylfluoride 1 mM (PMSF), 100 U / ml de RNAsin |
| 3.1 | Solução de sacarose 2M | 68,4% de sacarose, 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, MgCl2 5 mM, KCl 25 mM | 100 ug / ml de CHX, 1x Roche inibidor de protease completo, DTT 1 mM, PMSF 1 mM |
| 3.1 | 1.1M solução de sacarose | 38,5% de sacarose, 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, MgCl2 5 mM, KCl 25 mM | 100 ug / ml de CHX, 1x Roche inibidor de protease completo, DTT 1 mM, PMSF 1 mM |
| 3.1 | 0.9M solução de sacarose | 30,8% de sacarose, 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, MgCl2 5 mM, KCl 25 mM | 100 ug / ml de CHX, 1x Roche inibidor de protease completo, DTT 1 mM, PMSF 1 mM |
| 4.1 | homogenization tampão B | 0,25 M de sacarose, 50 mM Tris / HCl, pH 7,4, 5 mM de MgCl 2, 25 mM de KCl, 1% de NP-40, desoxicolato de sódio a 1% | 200 ug / ml de CHX, 1x Roche inibidor de protease completo, DTT 1 mM, PMSF 1 mM, 100 U / ml de RNAsin |
Tabela 1. Lista de tampões e soluções.
Discussion
Embora polyribosome fracionamento não é uma técnica nova, continua a ser um particularmente desafiador. Com base no material de entrada, a otimização substancial pode ser necessário. Este é especialmente o caso para amostras in vivo do SNC, onde a quantidade de material é muitas vezes uma limitação e componentes do tecido adiposo dificultar o isolamento de mRNAs de tradução. Mais fraccionamento protocolos publicados lidam com a levedura ou as linhas de células de mamíferos, e existem protocolos estabelecidos para o cérebro 12,13,14. Em contraste, há quase todas as publicações que descrevem fracionamento das medulas espinhais e protocolos anteriores exigem medula espinhal de um grande número de animais a serem agrupados 15. Por estes motivos, várias modificações essenciais foram feitas para adaptar o protocolo de fraccionamento para os tecidos do SNC, incluindo o único rato medula espinhal. Imobilização ribossomo com cicloheximida é realizada durante a perfusão animal para evitar a dissociação dos ribossomos during o longo processo de extração do tecido. Subsequentemente, os ARN polissomal são extraídos de uma forma específica para maximizar o rendimento polyribosome. Em primeiro lugar, a homogeneização do tecido controlada pelo douncing, mantém o núcleo intacto e evita a contaminação do ADN. O núcleo é então removido de forma fiável por centrifugação. A combinação dos detergentes NP-40 e desoxicolato de sódio assegura lise do retículo endoplasmático e de libertação das suas membranas associadas ribossomas. Além disso, os componentes de absorção de UV na mielina lipídico rico obscurecer os perfis polyribosome. Mielina flotação é, portanto, necessário, em que os compostos densos, tais como polirribossomas são sedimentadas e compostos mais leves, tais como a mielina flutuador e são removidos 16. Polirribossomos são então sedimentadas sobre um gradiente de sacarose de 17,5% para 50%. Em vez de camadas manualmente e congelando cada camada de sacarose, gradientes também pode ser preparado utilizando um misturador de gradiente. A extracção de ARN a partir de fracções usando ácido fenol / clorofórmio permite DNA a ser removido com a perda mínima de ARN. No entanto, a inversão de fases pode ocorrer em fracções de sacarose e densas (acima fracção 16).
Este protocolo oferece vantagens sobre os outros métodos convencionais que se dirigem ao nível da tradução. Por exemplo, tanto a medida de fosforilada S6 (um marcador de tradução de destaque), bem como a rotulagem das cadeias nascentes com radioisótopos dão informações sobre os níveis de tradução global mas revelam pouco sobre o que está especificamente a ser traduzido. Polyribosome fraccionamento, por outro lado, permite não só a avaliação da tradução global, mas também da identidade do traduzindo ARNm e as proteínas reguladoras associadas. PCR quantitativa em tempo real pode ser realizada em ARN isolado de uma leitura rápida de ARNm seleccionados, e microarranjos e próxima geração de sequenciação de ARN pode ser realizada por estudos de genoma. As optimizações aqui apresentados permitem a técnica a ser usado com uma quantidade mínima de tecidos do SNC, por conseguinte, diminuirção do número de animais necessários e melhorar a qualidade global experimental, reduzindo o tempo de processamento do tecido. Por outro lado, esta técnica não pode distinguir ribossomos paralisadas desde as traduzindo. Transcrições transportando ribossomos paralisadas sedimenta nas frações pesadas, e isso deve ser mantido em mente ao interpretar os dados.
Existem técnicas relatadas, nomeadamente RiboTaq e armadilha, em que os ribossomos são marcadas com etiquetas de epitopos ou repórteres respectivamente de uma maneira específica tipo de célula e mRNAs isolados por imunoprecipitação 17,18 associados. Esta técnica pode ser acoplado a polyribosome fraccionamento para oferecer alta resolução lido para populações de células específicas. Ribossomo pé-impressão é uma outra nova técnica que envolve a digestão nuclease para gerar pequenos fragmentos, ou "pegadas", de mRNAs que são protegidos por ribossomos. Bibliotecas são então gerados a partir dessas pegadas e seqüenciados. Este método provides toda uma análise do genoma específico do códon de tradução e é capaz de identificar os ribossomos paralisadas, não-agosto começam códons e pequenos quadros de leitura aberta a montante, que não podem ser alcançados por polyribosome fracionamento 19. No entanto, polyribosome fraccionamento pode ser acoplado ao perfil de ribossoma para o isolamento dos fragmentos digeridos individuais contendo ribossomas, enriquecendo assim para as espécies moleculares necessários para a preparação da biblioteca em que a alta pureza da amostra é muitas vezes necessário. Tomados em conjunto, polyribosome fracionamento é um método flexível, com significado duradouro e pode ser acoplado a várias aplicações a jusante, incluindo amplos ensaios genoma como sequenciamento de última geração.
Disclosures
Não há conflito de interesse declarados.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo Ministério Federal Alemão de Educação e Pesquisa (BMBF), a Biologia de Sistemas de Sinalização em Câncer (Helmholtz Alliance em Biologia de Sistemas) e do Centro de Pesquisa do Câncer Alemão (DKFZ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hank’s balanced salts solution | Gibco | 14170-138 | |
| Tube, Thinwall, Polyallomer, 14 ml, 14 x 95 mm | Beckman Coulter | 331374 | |
| Diethylpyrocarbonate | Sigma | D5758 | caution |
| Cycloheximide | Sigma | C7698 | danger |
| Dithiothreitol | Sigma | 43815 | warning |
| Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche | 11697498001 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride solution | Sigma | 93482 | danger |
| RNasin Plus RNase Inhibitor | Promega | N2611 | |
| Nonidet P-40 | Roche | 11332473001 | danger |
| Sodium deoxycholate | Sigma | D6750 | warning |
| Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) | Ambion | AM9722 | danger |
| GlycoBlue | Invitrogen | AM9516 | |
| Equipment | |||
| Dounce Tissue Grinder, 1 ml/7 ml | Wheaton | 357538/357542 | |
| Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | ||
| SW 40 Ti Rotor, Swinging Bucket, Titanium, 6 x 14 ml, 40,000 rpm, 285,000 x g | Beckman Coulter | 331302 | |
| Density Gradient Fractionator | Teledyne Isco | ||
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies |
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