Summary
Un microarray de la amplificación de PCR asimétrica combina la amplificación y la hibridación de microarrays en una sola cámara, lo que simplifica significativamente microarrays de flujo de trabajo para el usuario final. La simplificación de los microarrays de flujo de trabajo es un primer paso necesario para la creación de diagnósticos basados en microarrays que se pueden utilizar de forma rutinaria en los entornos más bajos recursos.
Abstract
La simplificación de los microarrays de flujo de trabajo es un primer paso necesario para la creación de la MDR-TB diagnósticos basados en microarrays que se pueden utilizar de forma rutinaria en los entornos de bajo recursos. Un microarray amplificación combina la amplificación asimétrica PCR, la selección de tamaño de destino, objetivo de etiquetado y la hibridación de microarrays en una única solución y en una sola cámara de microfluidos. Un método de procesamiento por lotes se demuestra con una mezcla maestra asimétrica 9 compleja y de baja densidad elemento gel microarray para el genotipado de múltiples fármacos de Mycobacterium tuberculosis (MDR-TB). El protocolo descrito aquí se puede completar en 6 horas y proporcionar genotipado correcto con al menos 1000 equivalentes celulares de ADN genómico. La incorporación en el chip pasos de lavado es viable, lo que resultará en un método de amplificación totalmente cerrado y el sistema. La medida de multiplexación con una micromatriz de amplificación se ve limitada en última instancia por el número de pares de cebadores que se pueden combinar en un único maestro mIX y aún así lograr la sensibilidad deseada y métricas de rendimiento especificidad, en lugar del número de sondas que están inmovilizados en la matriz. Del mismo modo, el tiempo total de análisis se puede acortar o alargar dependiendo del uso específico previsto, pregunta de investigación, y los límites de detección deseado. Sin embargo, el enfoque general simplifica significativamente microarrays de flujo de trabajo para el usuario final, reduciendo el número de pasos manualmente intensivos y que consumen mucho tiempo de procesamiento, y proporciona un camino bioquímico y de microfluidos simplificado para la traducción de diagnósticos basados en microarrays en la práctica clínica de rutina.
Introduction
La detección temprana de los casos y el tratamiento rápido se consideran las estrategias de control más eficaces de reducir el Mycobacterium tuberculosis (MTB) de transmisión de 1, y existe un amplio consenso en la comunidad TB que un punto de atención (PDA) o cerca de la prueba POC para diagnosticar simultáneamente TB y se necesita resistencia a los medicamentos (DR). Tecnologías tales como GeneXpert de Cepheid y otras pruebas de amplificación de ácidos nucleicos reducen el tiempo de diagnóstico para muchos pacientes de TB, y proporcionan una rápida lectura de salida que indica la resistencia a la rifampicina o mutaciones seleccionadas que confieren resistencia a otros fármacos de línea primero o segundo 2. Aunque las pruebas de amplificación en tiempo real y de ácidos nucleicos isotérmica están diseñadas para identificar las mutaciones de resistencia a las drogas que llevan a la MDR-TB, el espectro de mutaciones se detectan es a menudo insuficiente para diseñar un régimen individualizado de drogas correspondiente al perfil de resistencia a los medicamentos del paciente, y las limitaciones técnicas relacionadasa la diafonía óptica o la complejidad de la amplificación y de información química 3 a 7 may limitar el número de loci o mutaciones que se detectan. Por lo tanto, se requieren tecnologías de detección con mayor capacidad de multiplexación para subsanar las deficiencias conocidas en el diagnóstico POC MDR-TB.
Microarrays y los ensayos con sondas de línea Hain avaladas por la OMS pueden hacer frente a la "múltiples genes, mutaciones múltiples" reto de diagnosticar la TB-MR 8-29. Por desgracia, estas plataformas de detección de multiplexado basado en la hibridación utilizan múltiples pasos, complicado y protocolos de amplificación de voces que exigen la formación y la competencia significativa en las técnicas moleculares. El microarray de amplificación 30 fue diseñado para hacer frente a algunos de estos microarrays de flujo de trabajo y las preocupaciones operacionales. Los principios de fluidos simplificadoras son para amplificar, hibridar, y detectar dianas de ácido nucleico dentro de una cámara única de microfluidos. El usuario introduce los mas ácidos nucleicos y amplificaciónter la mezcla en una cámara de fluido con una pipeta y se inicia el protocolo de ciclado térmico. Para el método de procesamiento por lotes que se muestra aquí, los microarrays se lavan posteriormente en solución en masa, se secaron, y la imagen. Este estudio demuestra la funcionalidad de un microarray de amplificación utilizando una prueba de MDR-TB de microarrays para rpoB (30 mutaciones), katG (2 mutaciones), inh (4 mutaciones), rpsL (2 mutaciones), embB (1 mutación), IS1245, IS6110 , y una amplificación interna y el control de hibridación. Al menos un par emparejado de microarrays sondas (de tipo salvaje (WT) y mutantes de un solo nucleótido (MU)) se incluye para cada mutación de interés. Ácidos nucleicos purificados a partir de M. resistente a múltiples fármacos tuberculosis son de la cepa TDR Tuberculosis Banco 31. Microarrays de elemento en gel se fabrican sobre substratos de vidrio por copolimerización esencialmente como se describe en otra parte 32, excepto que se utiliza 4% de monómero y 0,05 mM de cada sonda en el polimerizablesmezcla ación. Las matrices están rodeados con una junta de 50 ml antes de su uso. Después de ciclos térmicos, de hibridación y de lavado de pasos, microarrays de amplificación se crean imágenes en un analizador portátil Akonni. , La intensidad de señal integrados antecedentes corregido se obtienen de la prima. Imágenes tif utilizando un algoritmo círculo fijo. De ruido para cada elemento de gel se calcula como tres veces la desviación estándar de los fondos contado locales. Objetivos de genes típicamente se consideran detectables durante la relación señal-ruido (SNR) valores ≥ 3. Con el fin de determinar la presencia o ausencia de una mutación específica en cada gen o codón, una relación discriminante se calcula a partir de los valores de SNR como (WT-MU) / (wt + MU). Ratios de discriminantes <0 son indicativos de una mutación de resistencia a fármacos en el locus, mientras que las relaciones> 0 son indicativos de la secuencia de tipo salvaje.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Para los laboratorios que siguen las precauciones universales de PCR, es operacionalmente más eficiente para incluir varios microarrays de amplificación y juntas por sustrato y lavar todos los microarrays de amplificación simultánea en un recipiente a granel, tal como se describe aquí. Formatos consumibles están disponibles para la realización de post-amplificación pasos de microarrays se lavan en una, prueba amplicón cerrado completamente sellada, según ha informado en otras partes 30,33.
1. Configuración
- Extraer y purificar ácidos nucleicos a partir de la muestra bajo condiciones de bioseguridad apropiadas con un método de elección. El requisito es que los ácidos nucleicos sean de pureza suficiente para la amplificación asimétrica, PCR multiplex.
- Preparar espacio de trabajo limpiando las superficies y equipos con las soluciones descontaminantes.
- Coloca los reactivos de amplificación en hielo o bloque frío.
- Etiquete un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml estéril para la mezcla maestra de amplificación, y la etiqueta de un estéril de 0,2 ml de microcentrífuga maser para cada muestra.
- Después de reactivos se descongelan, vórtice brevemente y recogen los contenidos de la parte inferior del tubo con un pulso de espín en un mini-centrífuga. No agite Taq polimerasa. Golpee suavemente el tubo para mezclar y siga con un pulso-spin en mini-centrífuga.
- Preparar una mezcla maestra de amplificación utilizando los volúmenes de reacción por-ejemplo que se muestra en la Tabla 1. Para tener en cuenta posibles inexactitudes de pipeteado, preparar al menos un volumen de reacción más que el número total de muestras que se están procesando. Tenga en cuenta que la mezcla maestra contiene Taq polimerasa adicional, más allá de lo que se proporciona con el tampón de PCR muliplex. Sólo agregar el control de amplificación / inhibición de la mezcla maestra después se combinan todos los demás reactivos, y los tubos de reactivo stock devueltos al almacenamiento.
| Reactivo | Volumen por muestra (l) | <strong> final [] |
| Multicine PCR Buffer con HotStar Taq Plus | 25 | 1x |
| Albúmina de suero bovino (BSA) | 0.55 | 0,6 mg / ml |
| Formamida | 3.8 | 7,6% |
| Taq polimerasa adicional | 0.8 | unidades / l (4 unidades en total) |
| Mezcla de cebadores MDR-TB | 15.75 | - |
| RNasa libre de H 2 O | 2.1 | - |
| La amplificación / control de inhibición | 1 | 5,0 fg / l |
| Total | 49 |
Tabla 1. MDR-TB de microarrays de amplificación composición mezcla maestra.
- Vortex la mezcla maestra y recoger contenidos a la parte inferior del tubo con un pulso de espín en un mini-centrífuga.
- Combine 49 l de mezcla maestra y 1 l de M. tuberculosis ADN a cada uno de los tubos de muestra de la etapa 1.4, más arriba. Para una externa, sin control de la plantilla (NTC), use 1 l de agua grado biología molecular en lugar de la M. muestra de ADN de la tuberculosis. Vortex y el pulso y gire el tubo (s) cuando haya terminado.
2. Carga de amplificación Microarrays
- Añadir 48 l de cada master mix / muestra en el centro de sus respectivos microarrays, teniendo cuidado de no tocar el mismo microarray.
- Coloque una hoja de la cubierta en la parte superior de la junta de microarrays y el sello, con cuidado de no atrapar burbujas de aire en la cámara de microarrays. Las burbujas de aire pueden afectar negativamente a la eficiencia de amplificacióny pueden crear artefactos o ruido en la imagen de microarrays posterior.
3. Ciclo térmico
- Una vez que todos los microarrays se cargan con la muestra, lugar sustratos en el termociclador bloque plano. Asegúrese de que la opción de tapa térmica se encuentre en "Off". Equipo obtenida de Akonni Biosystems ya estará precalificada para su uso. De lo contrario, es muy importante verificar que el termociclador bloque plano (s) proporcionan (s) uniforme, calefacción consistente a través de todos los sustratos de microarrays.
- Abra el software termociclador, seleccione el programa apropiado, escriba "50 l" para el volumen de reacción, e iniciar la carrera. El protocolo de ciclado térmico descrito aquí consiste en:
Pasos del ciclo termal 1 88 ° C 5 min 2 88 ° C 30 seg 3 55 ° C 1 min 4 65 ° C 30 seg 5 Repita los pasos (2-4) durante 50 ciclos 6 65 ° C 3 min 7 55 ° C 3 hr - El número total de ciclos térmicos y de 55 ° C después de la amplificación de tiempo de espera son variables independientes que el usuario puede modificar, según sea necesario o apropiado para el experimento específico. Debido a que la mezcla maestra de la MDR-TB crea amplicones asimétricos (predominantemente de cadena sencilla), por lo general es útil para incluir más ciclos térmicos que de otro modo podrían ser utilizados para un protocolo convencional, exponencial de PCR de amplificación.
- Cuando el programa de ciclos y la hibridación térmica es completa, terminar el programa, retire los microarrays de amplificación, cierre el software y apague el termociclador (s).
4. Lavar y seco
- Para el lavado de hasta 24 sustratos simultáneamente, preparar al menos 250 ml de SSPE 1x - 0,1% de Triton X-100 de tampón de lavado, y dos contenedores con al menos 250 ml de agua desionizada o agua Milli-Q grado cada uno. El tampón de lavado puede ser preparado de antemano.
- Retire con cuidado la hoja de la cubierta y la junta de cada cámara de amplificación de microarrays utilizando pinzas de gama plana. Este paso es el punto en el que existe el mayor riesgo de dañar físicamente a conjuntos de elementos de gel. Utilice los controles adecuados de contaminación de PCR para evitar la propagación de los ácidos nucleicos amplificados dentro del entorno de trabajo.
- Coloque sustratos de microarrays en un soporte de diapositivas histología, y coloque todas las diapositivas en el cubo de lavado que contiene el tampón de lavado. Cubrir el recipiente con una tapa.
- Lavar microarrays durante 10 min a temperatura ambiente con agitación suave.
- Sumerja los microarrays tres veces en cada una de dos lavados sucesivos del desionizada oAgua de calidad Milli-Q, y secar al aire.
5. Imaging
La mezcla de cebadores MDR-TB asimétrica genera amplicones etiquetados con Cy3. Microarrays elementos Gel se pueden obtener imágenes con cualquier reproductor de imágenes de microarrays estándar capaz de Cy3 imágenes. El siguiente procedimiento de imagen es específico para la mezcla de la MDR-TB maestro, campo Dx2100 generador de imágenes portátil, y el software de análisis automatizado proporcionado por Akonni.
- Asegúrese de que el cable Ethernet de la cámara se conecta al ordenador.
- Encienda el reproductor de imágenes. El interruptor de encendido se encuentra en el panel posterior del instrumento. LEDs azules en la parte frontal de la cámara termográfica se encienden cuando cámara se enciende.
- Encienda el ordenador.
- En el escritorio del ordenador, haga doble clic en el icono del software para iniciar el software automatizado de análisis de imágenes.
- Esperar a que el software para establecer una conexión con la cámara de imágenes. Una vez se establece la conexión, el botón Analizar esté disponible, y elmensaje "Conexión correcta" aparecerá en la esquina inferior izquierda de la pantalla.
- Insertar el microarray de amplificación se secó con el microarray frente lejos del usuario, y hacia la lente del objetivo. Si el microarray está orientada de forma incorrecta con respecto a la lente y la cámara, el software de análisis automatizado fallará para colocar una cuadrícula en la imagen de fluorescencia.
- Cierre la puerta de acceso. Una imagen de vista previa estará disponible en la pantalla de ordenador.
- Seleccione la MDR-TB script de análisis desde el menú desplegable e introduzca el tiempo de exposición deseado (en milisegundos). Un punto de partida típico para elementos gel microarrays de amplificación es 100-500 ms.
- Píxeles saturados se mostrarán en la Vista preliminar, Imagen en color rojo. Ajustar el tiempo de exposición para reducir al mínimo el número de píxeles saturados dentro de manchas individuales.
- Haga clic en Analizar para adquirir y analizar la imagen de fluorescencia. El software automáticamente colocará unMDR-TB grid-ensayo específico sobre la imagen, extraer intensidad integrada y valores de fondo, e informar los resultados de resistencia a los medicamentos y de genotipificación. El análisis automatizado normalmente tarda unos segundos. Para imágenes desafiantes que contienen rayaduras, polvo, artefactos fluorescentes, o daño físico a las características de microarrays, el software puede necesitar hasta 1 min para completar el análisis.
- Una vez terminado el análisis, haga clic en Guardar, seleccione la carpeta de destino, escriba un nombre de archivo y haga clic en Aceptar. Microarrays de datos subyacentes se guardan como un archivo xls. Y pueden ser exportados para análisis fuera de línea, si lo desea.
- Una vez que el análisis haya finalizado, retire los microarrays de amplificación de la cámara termográfica, y haga clic en Nuevo para iniciar el siguiente análisis.
- Cuando haya terminado la recolección de datos, cierre el software, apague el ordenador y apague el reproductor de imágenes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Análisis de imágenes cualitativa puede dar una idea de las fuentes de ruido experimental o variabilidad que son difíciles de identificar en las tablas de datos generados por el software automatizado de análisis de imágenes. Por lo tanto, puede ser útil para comprobar visualmente que 1) todos los elementos de gel están intactos y en buen estado, 2) el fondo mundial está libre de artefactos fluorescentes que pueden afectar señal individual a ruido (SNR) valores, 3) no hay evidencia para la formación de burbujas o no uniforme de amplificación / hibridación a través de la matriz, y 4) que el software identifica con precisión todos los puntos en la imagen de microarrays. Ejemplo de TB-MR imágenes de microarrays de amplificación se muestran en la Figura 1, que ilustra una matriz y artefactos que puedan surgir debido a daños físicos o burbujas durante el ciclo térmico de alta calidad. Software de análisis de imágenes de microarrays estándar suele ser capaz de colocar una rejilla y extraer la intensidad integral y los datos de fondo, incluso a partir de imágenes de mala calidad, como shpropia en la Figura 1B, por lo que es responsabilidad del investigador para establecer criterios y parámetros de control de calidad para aceptar o rechazar las imágenes de microarrays de análisis posteriores. Redundancia sonda puede ayudar a mejorar estos problemas. Sin embargo, un diagnóstico de MDR-TB algoritmo de informes de microarrays de amplificación completamente automatizado sería bien declarar la prueba de la Figura 1B como "no válida".
Valores de SNR de microarrays de amplificación para una serie de dilución de ADN genómico H37Ra de tipo salvaje se muestran en la Tabla 2. En 6,25 pg de entrada de ADN genómico por reacción o aproximadamente 1,25 x 10 3 equivalentes de células, todas las sondas de tipo silvestre se detectan fácilmente. Valores de SNR para cada uno de los controles de amplificación y la inhibición interna varió de 98,48 (rpoB) a 967,24 (Akonni suministrado por el control positivo interno), lo que indica que todos los objetivos de genes en la reacción de amplificación multiplex asimétrica se amplifican y detectable. Noplantilla controles fueron negativos (SNR <3) para todas las sondas en los microarrays de amplificación. Relaciones de genotipado a 6,25 pg de ADN de entrada varió 0,18 a 1,00 para todos los pares de sondas WT / MU, lo que demuestra el comportamiento correcto de WT y MU sondas y genotipado apropiado.
Genotipo de datos representativos para un panel de cepas de referencia de la Organización Mundial de la Salud de genotipo conocido se muestran en la Tabla 3. Si un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) se representa en el elemento en gel de microarrays, entonces la prueba de microarrays de amplificación detecta con precisión la mutación correspondiente en la MDR -TB genoma. Algunos de los microarrays de amplificación de sondas también son sensibles a las mutaciones cerca del vecino que no están representados explícitamente en la matriz como una sonda única. Por ejemplo, aislar el TDR-0129 contiene una mutación S531E en el gen rpoB, pero no hay una sonda específica en el microarray de amplificación para S531E. Sin embargo, otros cinco sondas de SNP targeting codón 531 indica que está presente una mutación en el codón 531 - los microarrays de amplificación, por lo tanto indica correctamente que este aislamiento es resistente rifampicina. Sensibilidad similar a la mutación rpoB S513W es evidente para aislar TDR-0148. Por otro lado, algunas sondas de SNP no son sensibles a las mutaciones vecino cercano, como se ilustra por el aislado de TDR-0148 y la mutación rpoB S512G, y aislar el TDR-0011 y la mutación S315R katG. Tenemos la sospecha de que este tipo de comportamiento de la sonda es una consecuencia de la estructura secundaria y terciaria en la amplificación de una sola cadena y / o de la sonda 34, y no es algo que se puede predecir a priori. Sin embargo, la sonda sensibilidad a mutaciones vecino cerca es análogo al uso de descuidados balizas moleculares para la detección de múltiples mutaciones de resistencia a fármacos con un conjunto mínimo de PCR en tiempo real explora 35.36, y puede ser ventajoso para el diagnóstico siempre que el ensayo no genera falsos positivos relacióntiva a la susceptibilidad al fármaco fenotípica.
Figura 1. (A) Imagen de microarrays Ejemplo de amplificación para 100 pg de tipo salvaje M. la tuberculosis H37Ra ADN genómico y un tiempo de exposición 100 mseg. Cy3 balizas (por cuadriculación automatizado y software de segmentación) se encuentran en la periferia de la imagen. (B) Imagen de un microarray de amplificación que muestra un artefacto de halo fluorescente resultante de la formación de burbujas durante el ciclo térmico, y dañado elementos de gel / escombros. Automatizado de software de análisis de imagen sigue siendo capaz de colocar una rejilla y extraer datos de esta imagen. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Empresa | Número de catálogo |
| Akonni Biosystems | Preguntar |
| Qiagen | # 206143 |
| Qiagen | # 201207 |
| Qiagen | # 206143 |
| Thermo Fisher Scientific, Inc. | # BP227-500 |
| Sigma-Aldrich | # 3B6917 |
| Akonni Biosystems | Preguntar |
| Akonni Biosystems | Preguntar |
| Thermo Fisher Scientific, Inc. | # BP1328-4 |
| Thermo Fisher Scientific, Inc. | # BP151-500 |
| Tecnologías actuales, Inc. | # BRSPRAY128 |
| Decon Labs, Inc. | # 8416 |
| Empresa | Número de catálogo |
| Akonni Biosystems | 100-20011 |
| 100-10021 | |
| Arrayit | HTW |
| Thermo Fisher Scientific, Inc. | # 10-300 |
| VWR | # 3365040 |
| VWR | # 93000-196 |
| Pneumatic central | # 95630 |
Tabla 2. Material y Equipo necesario.
| Codón | Sonda Identificación | Valores PESO Sonda SNR | 500 pg | 100 pg | 50 pg | 25 pg | 12,5 pg | 6,25 pg | |||||||
| rpoB | 507 | 1 | 900.22 | 644.46 | 523.17 | 431.08 | 364.49 | 287.47 | |||||||
| 3 | 1016.37 | 699.38 | 600.16 | 525.07 | 446.51 | 361.64 | |||||||||
| 511 | 5 | 867.67 | 611.97 | 529.90 | 451.73 | 403.76 | 307.68 | ||||||||
| 512 | 8 | 810.69 | 544.04 | 488.85 | 436.89 | 391.62 | 257.46 d> | ||||||||
| 513 | 11 | 824.36 | 547.04 | 496.00 | 472.01 | 408.96 | 242.25 | ||||||||
| 515 | 15 | 715.48 | 536.59 | 416.96 | 335.81 | 267.48 | 189.10 | ||||||||
| 516 | 17 | 723.83 | 496.44 | 402.95 | 69 "> 329.09270.10 | 201.98 | |||||||||
| 522 | 27 | 674.37 | 413.33 | 360.40 | 316.75 | 236.19 | 153.40 | ||||||||
| 524 | 29 | 269.46 | 153.69 | 117.71 | 118.02 | 110.13 | 51.22 | ||||||||
| 526 | 31 | 136.37 | <td class = "xl69"> 109.9082.63 | 76.76 | 53.61 | 37.76 | |||||||||
| 531 | 44 | 219.92 | 136.31 | 109.16 | 96.18 | 80.58 | 26.44 | ||||||||
| 533 | 51 | 130.54 | 83.60 | 76.03 | 63.47 | 61.35 | 41.54 | ||||||||
| rpsL | = "Xl71"> 43 | 54 | 10.41 | 12.75 | 53.30 | 767.18 | 5.39 | 362.42 | |||||||
| 88 | 56 | 655.54 | 542.79 | 527.43 | 690.34 | 403.86 | 456.05 | ||||||||
| katG | 315 | 58 | 1037.03 | 873.46 | p: none "> 816.64974.83 | 811.79 | 876.47 | ||||||||
| embB | 306 | 66 | 940.81 | 781.13 | 788.75 | 837.65 | 787.05 | 696.69 | |||||||
| inh | 8 | 82 | 1069.43 | 934.38 | 862.58 | 936.88 | 809.85 | 682 0.56 | |||||||
| 15 | 85 | 1111.66 | 931.88 | 918.22 | 957.87 | 795.72 | 723.16 | ||||||||
| 17 | 87 | 1114.49 | 926.03 | 920.60 | 970.70 | 854.15 | 744.41 | ||||||||
Tabla 3. Señal a ruido para sondas de tipo silvestre y una serie de diluciones de M. tuberculosis H37Ra ADN genómico. valores de SNR> 3 se consideran detectable.
ntent "fo: keep-together.within-page =" always ">
Tabla 4. Datos de genotipos representativos de la MDR-TB aislados de genotipo conocido a 25 pg por amplificación por reacción en microarrays. Asteriscos señalan mutaciones que no están representados por una sonda única en el gel elemento de microarrays. PESO = secuencia de ácido nucleico de tipo salvaje. Los valores negativos (negrita y sombreados) son indicativos de una mutación, por lo tanto fenotípica de resistencia a fármacos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
La medida de multiplexación con una micromatriz de amplificación es dictado en última instancia por la eficiencia de la PCR asimétrica múltiplex, no el microarray. En nuestra experiencia, 10 a 12 pares de cebadores únicos pueden ser multiplexados fácilmente en un formato de microarrays de amplificación. Por lo tanto, criterios de cebador y sonda de diseño convencionales se aplican a los nuevos ensayos, excepto que también se debe tener en cuenta las posibles interacciones entre ácidos nucleicos en fase de solución y inmovilizadas sondas de microarrays, la eficiencia térmica de la ciclador térmico, y el comportamiento de hibridación de la sonda en un tampón de PCR que también contiene cebadores de PCR y artefactos de baja amplificación peso molecular. Enfoques de amplificación altamente multiplexados tales como la amplificación de todo el genoma no son propicias para una sola cámara de protocolo de microarrays de amplificación para un número de razones técnicas, incluyendo la interferencia entre hexámeros aleatorios y sondas inmovilizadas, y la hibridación ineficiente de los amplicones largos, de doble cadena. Hayes también una interrelación entre la facilidad de uso, el tiempo total de análisis y límites de detección que los usuarios individuales tendrán que considerar en el diseño de ensayos personalizados o mediante la prueba de la tuberculosis MDR se describe aquí. Por ejemplo, la reducción del número de ciclos de amplificación, e incluso la eliminación de la etapa de hibridación después de la amplificación reducirá significativamente el tiempo total de análisis, pero a expensas de la sensibilidad de la prueba. Por otro lado, la consecución de un límite de detección de copia 10 gen reproducibles puede requerir más ciclos de amplificación o el tiempo de hibridación, extendiendo así el tiempo total de análisis más allá de un solo turno de trabajo.
Los genes, mutaciones, de imágenes, software de análisis y presentación de informes algoritmo descrito aquí son ilustrativos del método de microarrays de amplificación y el sistema, en lugar de un informe sobre su desempeño analítico y utilidad clínica. Por ejemplo, la muestra de partida puede ser esputo, sedimento descontaminado, culturas sólidas o líquidas - la exigenciapara la micromatriz de amplificación es simplemente que los ácidos nucleicos extraídos son amplificable por asimétrica, PCR multiplexada. Algunos investigadores o los médicos pueden encontrar poco o ningún valor clínico en la detección de mutaciones o rpsL embB que confieren resistencia a la estreptomicina y etambutol, respectivamente, sólo la resistencia a la rifampicina y la isoniazida definir MDR-TB. Por lo tanto, estos cebadores de PCR y sondas de microarrays pueden ser reemplazados con los cebadores y sondas que se dirigen a los genes y las mutaciones que confieren resistencia a otros antibióticos de primera o de segunda línea. Es posible escribir un algoritmo de informes para proporcionar al usuario información detallada sobre las mutaciones específicas que se detectan en una muestra dada, en lugar de una "resistencia detectada" simple o "resistencia no detectado" número. Para los investigadores interesados en el uso de este ensayo específico para analizar M. tuberculosis aislados, también es posible proporcionar los datos de genotipos incluso si el elemento IS6110 no es detected en la muestra.
Independientemente de las posibles permutaciones de ensayo y presentación de informes, los microarrays de amplificación y protocolo descrito aquí está diseñado para simplificar significativamente el flujo de trabajo de microarrays mediante la combinación de múltiples pasos de biología molecular en una sola reacción bioquímica y la cámara de microfluidos. Los datos representativos demuestran la eficacia del enfoque mediante la amplificación de nueve MDR-TB regiones genómicas y detectar esas amplicones asimétricas con una baja densidad elemento gel de microarrays. El protocolo descrito aquí utiliza un procedimiento de lavado mayor que requiere que el usuario retire físicamente la junta y hoja de la cubierta de la micromatriz de amplificación antes del lavado, y por lo tanto es más apropiado para-sólo la investigación del uso de aplicaciones en lugar de los diagnósticos clínicos. Como se describe en otro lugar, sin embargo, es ciertamente posible incorporar una etapa de lavado en el chip usando fluidos de flujo lateral 33 y por lo tanto retener un consumible amplicón totalmente cerrado, incluidouding uno que se puede incorporar fácilmente en un sistema de diagnóstico de la muestra-en-respuesta que es apropiado para aplicaciones de punto de atención.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores declaran no tener intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Esta labor fue apoyada por los Institutos Nacionales de Salud (NIH) en AI089106 RC3 subvención.
Ácidos nucleicos MDR-TB fueron proporcionados por / Programa Especial de las Naciones Unidas para el Fondo / Naciones Unidas para el Desarrollo del Banco Mundial / Organización Mundial de la Salud para la Investigación y Capacitación en Enfermedades Tropicales (TDR), Ginebra, Suiza.
Agradecemos al Dr. Tom Shinnick de los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades de orientación sobre los genes y las mutaciones específicas para incluir en el ensayo de prototipos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MDR-TB amplification microarrays, with applied gasket and pre-cut cover slips | Akonni Biosystems | Inquire | |
| Multiplex PCR kit, containing 2X PCR buffer with HotStar Taq plus | Qiagen | #206143 | |
| Taq polymerase | Qiagen | #201207 | |
| RNAse-free water | Qiagen | #206143 | |
| Formamide | Thermo Fisher Scientific, Inc. | #BP227-500 | |
| 20 mg mL-1 non-acetlyated bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | #3B6917 | |
| 5X concentrated MDR-TB primer mix | Akonni Biosystems | Inquire | |
| 500 fg uL-1 amplification and inhibition control | Akonni Biosystems | Inquire | |
| 20X SSPE | Thermo Fisher Scientific, Inc. | #BP1328-4 | |
| Triton X-100 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | #BP151-500 | |
| Disinfecting Spray | Current Technologies, Inc. | #BRSPRAY128 | |
| 70% Isopropyl Alcohol | Decon Labs, Inc. | #8416 | |
| Microarray imager, with automated image and data analysis software | Akonni Biosystems | 100-20011 | |
| Thermal cycler with flat block insert | Akonni Biosystems | 100-10021 | |
| High-throughput wash station and slide holder | ArrayIt | HTW | |
| Dissecting forceps | Thermo Fisher Scientific, Inc. | #10-300 | |
| Mini Vortexer | VWR | #3365040 | |
| Mini-centrifuge | VWR | #93000-196 | |
| Airbrush Compressor Kit | Central Pneumatic | #95630 |
References
- Lemaire, J. -F., Casenghi, M. New diagnostics for tuberculosis: fulfilling patient needs first. J. Int. AIDS Soc. 13, 40 (2010).
- World Health Organization. Tuberculosis diagnostic technology landscape. 42, World Health Organization. Geneva, Switzerland. (2012).
- Notomi, T., Okayama, H., et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucl. Acids Res. 28, e63 (2000).
- Vincent, M., Xu, Y., Kong, H. Helicase-dependent isothermal DNA amplification. EMBO Rep. 5, 795-800 (2004).
- Pritchard, C. G., Stefano, J. E. Amplified detection of viral nucleic acid at subattomole levels using Q beta replicase. Ann. Biol. Clin. 48, 492-497 (1990).
- Compton, J. Nucleic acid sequence-based amplification. Nature. 350, 91-92 (1991).
- Guatelli, J. C., Whitfield, K. M., et al. Isothermal, in vitro amplification of nucleic acids by a multienzyme reaction modeled after retroviral replication. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 1874-1878 (1990).
- Shi, X. C., Liu, X. Q., Xie, X. L., Xu, Y. C., Zhao, Z. X. Gene chip array for differentiation of mycobacterial species and detection of drug resistance. Chin. Med. J. , 3292-3297 (2012).
- Troesch, A., Nguyen, H., et al. Mycobacterium species identification and rifampin resistance testing with high-density DNA probe arrays. J. Clin. Microbiol. 37, 49-55 (1999).
- Caoili, J. C., Mayorova, A., et al. Evaluation of the TB-biochip oligonucleotide microarray system for rapid detection of rifampin resistance in Mycobacterium tuberculosis. J. Clin. Microbiol. 44, 2378-2381 (2006).
- Waddell, S., Laing, K., Senner, C., Butcher, P. Microarray analysis of defined Mycobacterium tuberculosis populations using RNA amplification strategies. BMC Genomics. 9, 94 (2008).
- Fukushima, M., Kakinuma, K., et al. Detection and identification of mycobacterium species isolates by DNA microarray. J. Clin. Microbiol. 41, 2605-2615 (2003).
- Park, H., Jang, H., et al. Detection and genotyping of Mycobacterium species from clinical isolates and specimens by oligonucleotide array. J. Clin. Microbiol. 43, 1782-1788 (2005).
- Yao, C., Zhu, T., et al. Detection of rpoB, katG and inhA gene mutations in Mycobacterium tuberculosis clinical isolates from Chongqing as determined by microarray. Clin. Microbiol. Infect. 16, 1639-1643 (2010).
- Sun, A. H., Fan, X. L., et al. Rapid detection of rpoB gene mutations in rif-resistant M. tuberculosis isolates by oligonucleotide microarray. Biomed. Environ. Sci. 22, 253-258 (2009).
- Volokhov, D. V., Chizhikov, V. E., Denkin, S., Zhang, Y. Molecular detection of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis with a scanning-frame oligonucleotide microarray. Methods Mol. Biol. 465, 395-417 (2009).
- Fu, L., Shinnick, T. M. Understanding the action of INH on a highly INH-resistant Mycobacterium tuberculosis strain using Genechips. Tuberculosis. 87, 63-70 (2007).
- Fu, L. M., Shinnick, T. M. Genome-wide exploration of the drug action of capreomycin on Mycobacterium tuberculosis using Affymetrix oligonucleotide GeneChips. J. Infect. 54, 277-284 (2007).
- Denkin, S., Volokhov, D., Chizhikov, V., Zhang, Y. Microarray-based pncA genotyping of pyrazinamide-resistant strains of Mycobacterium tuberculosis. J. Med. Microbiol. 54, 1127-1131 (2005).
- Gryadunov, D. A., Mikhailovich, V., et al. Evaluation of hybridisation on oligonucleotide microarrays for analysis of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis. Clin. Microbiol. Infect. 11, 531-539 (2005).
- Tang, X., Morrix, S. L., Langone, J. J., Bockstahler, L. E. Microarray and allele specific PCR detection of point mutations in Mycobacterium tuberculosis genes associated with drug resistance. J. Microbiol. Methods. 63, 318-330 (2005).
- Wade, M. M., Volokhov, D., Peredelchuk, M., Chizhikov, V., Zhang, Y. Accurate mapping of mutations of pyrazinamide-resistant Mycobacterium tuberculosis strains with a scanning-frame oligonucleotide microarray. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 49, 89-97 (2004).
- Yue, J., Shi, W., et al. Detection of rifampin-resistant Mycobacterium tuberculosis strains by using a specialized oligonucleotide microarray. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 48, 47-54 (2004).
- Kim, S. Y., Park, Y. K., et al. Evaluation of the CombiChip Mycobacteria Drug-Resistance detection DNA chip for identifying mutations associated with resistance to isoniazid and rifampin in Mycobacterium tuberculosis. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 54, 203-210 (2006).
- Brown, T. J., Herrera-Leon, L., Anthony, R. M., Drobniewski, F. A. The use of macroarrays for the identification of MDR Mycobacterium tuberculosis. J. Microbiol. Methods. 65, 294-300 (2006).
- Brossier, F., Veziris, N., Truffot-Pernot, C., Jarlier, V., Sougakoff, W. Performance of the genotype MTBDR line probe assay for detection of resistance to rifampin and isoniazid in strains of Mycobacterium tuberculosis with low- and high-level resistance. J. Clin. Microbiol. 44, 3659-3664 (2006).
- Padilla, E., Gonzalez, V., et al. Comparative evaluation of the new version of the INNO-LiPA Mycobacteria and GenoType Mycobacterium assays for identification of Mycobacterium species from MB/BacT liquid cultures artificially inoculated with mycobacterial strains. J. Clin. Microbiol. 42, 3083-3088 (2004).
- Barnard, M., Gey van Pittius, N. C., et al. The diagnostic performance of the GenoType MTBDRplus Version 2 line probe assay is equivalent to that of the Xpert MTB/RIF assay. J. Clin. Microbiol. 50, 3712-3716 (2012).
- Sekiguchi, J. -I., Nakamura, T., et al. Development and evaluation of a line probe assay for rapid identification of pncA mutations in pyrazinamide-resistant Mycobacterium tuberculosis strains. J. Clin. Microbiol. 45, 2802-2807 (2007).
- Chandler, D. P., Bryant, L., et al. Integrated amplification microarrays for infectious disease diagnostics. Microarrays. 1, 107-124 (2012).
- Vincent, V., Rigouts, L., et al. The TDR Tuberculosis Strain Bank: a resource for basic science, tool development and diagnostic services. Int. J. Tuberc. Lung Dis. 16, 24-31 (2012).
- Golova, J. B., Chernov, B. K., et al. Non-volatile copolymer compositions for fabricating gel element microarrays. Anal. Biochem. 421, 526-533 (2012).
- Cooney, C. G., Sipes, D., Thakore, N., Holmberg, R., Belgrader, P. A plastic, disposable microfluidic flow cell for coupled on-chip PCR and microarray detection of infectious agents. Biomed. Microdevices. 14, 45-53 (2012).
- Lane, S., Evermann, J., Loge, F., Call, D. R. Amplicon secondary structure prevents target hybridization to oligonucleotide microarrays. Biosens. Bioelectron. 20, 728-735 (2004).
- El-Hajj, H. H., Marras, S. A. E., et al. Use of sloppy molecular beacon probes for identification of Mycobacterial species. J. Clin. Microbiol. 47, 1190-1198 (2009).
- Boehme, C. C., Nabeta, P., et al. Rapid molecular detection of tuberculosis and rifampin resistance. N. Engl. J. Med. 363, 1005-1015 (2010).
