Summary
Een amplificatie microarray combineert asymmetrische PCR-amplificatie en microarray hybridisatie in een enkele kamer, die aanzienlijk stroomlijnt microarray workflow voor de eindgebruiker. Vereenvoudiging microarray workflow is een noodzakelijke eerste stap voor het maken van microarray-gebaseerde diagnostiek die routinematig kan worden gebruikt in een lagere-resource-omgevingen.
Abstract
Vereenvoudiging microarray workflow is een noodzakelijke eerste stap voor het creëren van MDR-TB-microarray gebaseerde diagnostiek die routinematig kan worden gebruikt in een lagere-resource-omgevingen. Een amplificatie microarray combineert asymmetrische PCR-amplificatie, doelgrootte selectie, doel etikettering, en microarray hybridisatie binnen een enkele oplossing en in een enkele microfluïdische kamer. Een batch processing methode wordt gedemonstreerd met een 9-plex asymmetrische master mix en low-density gel element microarray voor genotypering van multiresistente Mycobacterium tuberculosis (MDR-TB). De hier beschreven protocol kan in 6 uur worden ingevuld en voorzien juiste genotypering met minstens 1.000 cel equivalenten van genomisch DNA. Integratie on-chip wasstappen haalbaar, wat zal resulteren in een volledig gesloten amplicon werkwijze en systeem. De omvang van multiplexing met een amplificatie microarray uiteindelijk beperkt door het aantal primerparen die kunnen worden gecombineerd tot een enkele master mix en toch bereiken gewenste gevoeligheid en specificiteit prestatiemetingen dan het aantal probes die zijn geïmmobiliseerd op de array. Evenzo kan de totale analysetijd verkort of verlengd worden afhankelijk van de specifieke beoogde toepassing, vraagstelling en gewenste detectiegrenzen. Toch is de algemene aanpak aanzienlijk stroomlijnt microarray workflow voor de eindgebruiker door het verminderen van het aantal arbeidsintensieve en tijdrovende processtappen, en biedt een vereenvoudigde biochemische en microfluïdische pad voor het vertalen van microarray-gebaseerde diagnostiek in de dagelijkse klinische praktijk.
Introduction
Vroege opsporing en snelle behandeling worden beschouwd als de meest effectieve controle strategieën om Mycobacterium tuberculosis (MTB) transmissie 1 verminderen, en er is nu een brede consensus in de tbc-gemeenschap die een point of care (POC) of in de buurt POC test om gelijktijdig diagnosticeren TB en resistentie tegen (DR) nodig. Technologieën zoals Cepheid GeneXpert en andere nucleïnezuur amplificatie testen verminderen de tijd tot de diagnose voor veel tbc-patiënten, en zorgen voor een snelle uitlezing aangeeft resistentie tegen rifampicine of geselecteerde mutaties die resistentie tegen andere eerste of tweede lijn drugs 2. Hoewel realtime isotherme nucleïnezuur amplificatie zijn bedoeld om de resistentie mutaties die leiden tot MDR-TB identificeren, het spectrum van mutaties detecteren ze vaak ontoereikend om een geïndividualiseerd drugregime overeenkomt met de resistentie profiel van de patiënt te ontwerpen, en technische beperkingen met betrekkingoptische overspraak of de complexiteit van amplificatie en rapportage chemische 03-07 mei het aantal loci of mutaties die worden gedetecteerd beperken. Zo detectie technologieën met een hogere multiplexing capaciteit nodig zijn om bekend hiaten in MDR-TB POC diagnostiek.
Microarrays en de WHO-onderschreven Hain lijnprobe testen kunnen de "meerdere genen, meerdere mutaties" uitdaging van de diagnose van MDR-TB 8-29 pakken. Helaas zijn deze hybridisatie gebaseerde, multiplex detectie platforms gebruiken multistep, ingewikkeld, en open-amplicon protocollen die significante opleiding en deskundigheid in de moleculaire technieken vereisen. De amplificatie microarray 30 is ontworpen om een aantal van deze microarray workflow en operationele problemen aan te pakken. De vereenvoudiging van vloeibare principes zijn aan te vullen, hybridiseren, en detecteren nucleïnezuur doelen binnen een enkele microfluïdische kamer. De gebruiker nucleïnezuur en amplificatie introduceert master mengen in een vloeibare kamer met een pipet en begint de thermische cycli protocol. Voor de batchverwerking methode hier getoond, zijn microarrays vervolgens gewassen in bulk oplossing, gedroogd, en afgebeeld. Deze studie toont de functionaliteit van een amplificatie microarray met een MDR-TB microarray test voor rpoB (30 mutaties), KATG (2 mutaties), inha (4 mutaties), rpsL (2 mutaties), embB (1 mutatie), IS1245, IS6110 en een interne amplificatie en hybridisatie controle. Ten minste een matched pair van microarray probes (wild-type (WT) en single-nucleotide mutant (MU)) is opgenomen voor elke mutatie van belang. Gezuiverde nucleïnezuren uit multiresistente M. tuberculose van de TDR Tuberculose Strain Bank 31. Gel element microarrays worden geproduceerd op glassubstraten door copolymerisatie hoofdzaak zoals elders 32 beschreven, behalve dat we 4% monomeer en 0,05 mM elke probe in de polymerizatie mengsel. Arrays zijn omgeven met een 50 ml pakking voor gebruik. Na thermische cycli, hybridisatie en wassen stappen, zijn versterking microarrays afgebeeld op een Akonni draagbare analyzer. -Achtergrond gecorrigeerde, geïntegreerde signaal intensiteiten worden verkregen uit de ruwe. Tif beelden met behulp van een vaste cirkel algoritme. Noise elk gel-element wordt berekend als drie maal de standaardafwijking van de lokale plek achtergronden. Gendoelstellingen worden doorgaans beschouwd detecteerbaar voor signaal-ruisverhouding (SNR)-waarden ≥ 3. Om de aanwezigheid of afwezigheid van een specifieke mutatie in elk gen of codon bepalen, wordt een discriminant verhouding berekend uit de SNR waarden (WT-MU) / (WT + MU). Discriminant verhoudingen <0 zijn indicatief voor een resistentie mutatie op de locus, terwijl verhoudingen> 0 zijn aanwijzingen voor de wild-type sequentie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Voor laboratoria die universele PCR voorzorgsmaatregelen volgen, is het operationeel efficiënter om meerdere amplificatie microarrays en pakkingen per substraat op te nemen en te wassen alle versterking microarrays gelijktijdig in een container voor losgestort vervoer, zoals hier beschreven. Verbruiksartikelen formaten zijn beschikbaar voor het uitvoeren van stappen microarray wassen post-amplificatie in een volledig gesloten, gesloten amplicon test, zoals elders 30,33 gerapporteerd.
1. Setup
- Extraheren en zuiveren nucleïnezuren uit het monster in een geschikt bioveiligheid omstandigheden met een methode van keuze. De eis is dat nucleïnezuren zijn van voldoende zuiverheid voor asymmetrische, multiplex PCR amplificatie.
- Bereid werkruimte door vlakken schoon te vegen en apparatuur met ontsmettingsmiddelen oplossingen.
- Plaats amplificatiereagentia op ijs of koude blok.
- Label een steriele 1,5 ml microfugebuisje voor de amplificatie master mix, en label een steriele 0,2 ml microfugebuisje tuvoor elk monster.
- Na reagentia zijn ontdooid, kort vortex en inhoud verzamelen om de bodem van de buis met een puls-Spin in een mini-centrifuge. Niet vortex Taq-polymerase. Tik zachtjes tegen de buis te mengen en te volgen met een puls-spin-in mini-centrifuge.
- Bereid een amplificatie master mix met de per-monsterreactiemengsel volumes worden getoond in Tabel 1. Ter compensatie van eventuele onnauwkeurigheden pipetteren, minstens een reactievolume dan het totale aantal monsters wordt verwerkt bereiden. Merk op dat de master mix bevat aanvullende Taq-polymerase, dan wat is voorzien van de muliplex PCR-buffer. Voeg alleen de versterking / inhibitie controle met betrekking tot de master mix nadat alle andere reagentia worden gecombineerd, en de voorraad reagensbuizen terug naar de opslag.
| Reagens | Per-Sample Volume (pl) | <strong> Final [] |
| Mulitplex PCR Buffer met HotStar Taq Plus | 25 | 1x |
| Bovine serum albumine (BSA) | 0,55 | 0,6 mg / ml |
| Formamide | 3.8 | 7,6% |
| Aanvullende Taq polymerase | 0.8 | eenheden / pl (4 stuks totaal) |
| MDR-TB primer mix | 15.75 | - |
| RNase-free H2O | 2.1 | - |
| Amplification / Remming Controle | 1 | 5.0 fg / ul |
| Totaal | 49 |
Tabel 1. MDR-TB versterking microarray master mix samenstelling.
- Vortex de master mix en inhoud verzamelen om de bodem van de buis met een puls-Spin in een mini-centrifuge.
- Combineer 49 pi master mix en 1 pi van M. tuberculosis DNA aan elk van de monsterbuizen uit stap 1.4, hierboven. Voor een externe templateloze controle (NTC), gebruikt 1 pl moleculaire biologie rang water in plaats van de M. tuberculose DNA-monster. Vortex en pulse-draai de buis (s) als u klaar bent.
2. Belastingversterking Microarrays
- Voeg 48 ul van elke master mix / monster op het midden van hun respectieve microarrays, let daarbij goed op de microarray zelf niet aan.
- Plaats een dekglas op de top van de microarray pakking en afdichting, en let niet te vangen eventuele luchtbellen in de microarray kamer. Luchtbellen kan een negatieve invloed hebben op amplificatie-efficiëntieen kunnen artefacten of ruis uit de daaropvolgende microarray creëren.
3. Thermische Fietsen
- Zodra alle microarrays worden geladen met staal, plaats substraten op het platte blok PCR-apparaat. Zorg ervoor dat de verwarmde deksel optie "Off" is ingeschakeld. Apparatuur verkregen uit Akonni Biosystems wordt reeds geprekwalificeerde voor gebruik. Anders, is het zeer belangrijk om te controleren of de platte blok PCR-apparaat (s) te voorzien (s) uniforme, consistente verwarming in alle microarray substraten.
- Open de PCR-apparaat software, kies de juiste programma, voert u "50 pl" voor de reactie volume, en start de run. De thermische cycli hier beschreven protocol bestaat uit:
Thermische Fietsen Stappen 1 88 ° C 5 min 2 88 ° C 30 sec 3 55 ° C 1 min 4 65 ° C 30 sec 5 Herhaal de stappen (2-4) voor 50 cycli 6 65 ° C 3 min 7 55 ° C 3 hr - Het totale aantal thermische cycli en 55 ° C na amplificatie wachttijd onafhankelijk variabelen die de gebruiker kan wijzigen, indien nodig of passend om het specifieke experiment. Omdat MDR-TB master mix gemaakt asymmetrische (voornamelijk enkelstrengs) amplicons, is meestal nuttig meer temperatuurcycli dan anders zou worden gebruikt voor een conventionele, exponentiële PCR amplificatie protocol omvatten.
- Wanneer de thermische cycli en hybridisatie programma is voltooid, eindigt het programma, verwijder de versterking microarrays, sluit de software, en zet de PCR-apparaat (s).
4. Was en droog
- Voor wassen tot 24 substraten gelijktijdig bereiden minstens 250 ml 1x SSPE - 0,1% Triton X-100 wasbuffer, en twee containers met ten minste 250 ml gedeïoniseerd of Milli-Q-kwaliteit water elk. De wasbuffer kan worden voorbereid.
- Verwijder voorzichtig het deksel slip en de pakking van elkaar amplificatie microarray kamer met behulp van een flatscreen-end tang. Deze stap is het punt waarop er het grootste risico van fysiek schadelijke gel element arrays. Gebruik geschikte PCR-besmetting controles om de verspreiding van versterkte nucleïnezuren voorkomen binnen de werkomgeving.
- Plaats microarray substraten in een houder histologie glijbaan, en leg alle dia's in de was bak daarin de wasbuffer. Bedek de container met een deksel.
- Was microarrays gedurende 10 min bij kamertemperatuur onder zacht schudden.
- Dompel de microarrays drie keer elk in twee opeenvolgende wasbeurten gedeïoniseerd ofMilli-Q kwaliteit water en de lucht drogen.
5. Imaging
De asymmetrische MDR-TB primer mix genereert Cy3-gelabelde amplicons. Gel element microarrays kunnen worden afgebeeld met elke standaard microarray imager staat beeldvorming Cy3. De volgende imaging procedure is specifiek voor de MDR-TB master mix, Dx2100 veld draagbare imager, en geautomatiseerde analyse software die door Akonni.
- Zorg ervoor dat de Ethernet-kabel van de imager is aangesloten op de computer.
- Zet de imager. De schakelaar bevindt zich op het achterpaneel van het instrument. Blauwe LED's aan de voorzijde van de imager gaat branden wanneer imager is ingeschakeld.
- Zet de computer aan.
- Op de desktop computer, dubbelklikt u op het pictogram om de software automatische beeldanalyse software te starten.
- Wacht tot de software om een verbinding met de imager camera vast. Wanneer de verbinding is gemaakt, de knop Analyseren beschikbaar, enmelding "Connection Successful" wordt weergegeven in de linker bovenhoek van het scherm.
- Plaats de gedroogde versterking microarray met de microarray afgekeerd van de gebruiker, en de richting van het objectief. Als de microarray onjuist georiënteerd ten opzichte van de lens en camera, de geautomatiseerde analyse software niet een raster te plaatsen op afbeelding de fluorescentie.
- Sluit de toegangsdeur. Een voorbeeld van de afbeelding zal beschikbaar zijn op het computerscherm.
- Selecteer de MDR-TB analyse script van de drop-down menu en voer de gewenste Exposure Time (in milliseconden). Een typische uitgangspunt voor gel element versterking microarrays is 100-500 msec.
- Verzadigde pixels zal op het preview-beeld worden weergegeven in het rood. Pas de blootstellingstijd aan het aantal verzadigde beeldpunten binnen individuele vlekken minimaliseren.
- Klik op Analyseren om het imago van de fluorescentie te verwerven en te analyseren. De software zal automatisch plaatsen van eenMDR-TB test-specifieke raster op de afbeelding, extract geïntegreerde intensiteit en achtergrondwaarden, en rapporteren resistentie en genotypering resultaten. De geautomatiseerde analyse zal doorgaans een paar seconden duren. Voor uitdagende beelden die krassen, stof, fluorescerende artefacten, of fysieke schade aan de microarray functies bevatten, moet de software van maximaal 1 minuut om de analyse te voltooien.
- Zodra de analyse is voltooid, klikt u op Opslaan, selecteer de doelmap, typ een bestandsnaam en klik op OK. Onderliggende microarray gegevens worden opgeslagen als een. Xls-bestand en kan worden geëxporteerd voor off-line analyses, indien gewenst.
- Zodra de analyse is voltooid, verwijdert u de versterking microarray van de imager, en klik op Nieuw om de volgende analyse te starten.
- Wanneer u klaar bent het verzamelen van gegevens, sluit de software, sluit de computer af, en zet de imager.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kwalitatieve beeldanalyse kan inzicht geven in bronnen van experimentele noise of variabiliteit die zijn uitdagend te identificeren in data tabellen gegenereerd door geautomatiseerde software voor beeldanalyse. Zo kan het nuttig zijn om visueel te vergewissen dat 1) Alle gel elementen intact en onbeschadigd zijn, 2) de globale achtergrond is vrij van fluorescerende artefacten die individuele signaal invloed kunnen ruisverhouding (SNR) waarden, 3) er is geen bewijs voor blaasvorming of niet-uniforme amplificatie / hybridisatie over de array, en 4) dat de software nauwkeurig geïdentificeerd alle spots op het imago van de microarray. Voorbeeld MDR-TB amplificatie microarray beelden worden getoond in Figuur 1 illustreert een hoogwaardige array en effecten die kunnen ontstaan door fysieke schade of bellen tijdens thermische cycli. Standaard afbeelding microarray analyse software is meestal in staat om een raster te plaatsen en pak integraal intensiteit en achtergrond gegevens zelfs van slechte kwaliteit afbeeldingen zoals sheigen in Figuur 1B, dus het is de taak van de onderzoeker om controle criteria en metrics kwaliteit vast te stellen voor het aanvaarden of verwerpen microarray beelden van verdere analyse. Probe redundantie kan helpen verbeteren deze problemen. Toch zou een volledig geautomatiseerde, diagnostische MDR-TB versterking microarray rapportage algoritme anders verklaren de test uit figuur 1B als "ongeldig".
Amplificatie microarray SNR waarden voor een verdunningsreeks van H37Ra wildtype genomisch DNA worden getoond in Tabel 2. Op 6,25 pg ingang genomisch DNA per reactie of ongeveer 1,25 x 10 3 cellen equivalenten worden alle wildtype probes gemakkelijk gedetecteerd. SNR voor elk van de interne amplificatie en remming controles varieerde van 98,48 (rpoB) tot 967,24 (Akonni geleverde interne positieve controle), wat aangeeft dat alle gendoelstellingen in de asymmetrische multiplex amplificatiereactie worden geamplificeerd en gedetecteerd. Geensjabloon controles waren negatief (SNR <3) voor alle sondes bij de amplificatie microarray. Genotypering ratio op 6,25 pg ingang DNA varieerde 0,18-1,00 voor alle WT / MU probeparen, die correct gedrag van WT en MU sondes en passende genotypering demonstreert.
Representatieve genotypering gegevens voor een panel van Wereldgezondheidsorganisatie referentie isolaten van bekende genotype worden getoond in Tabel 3. Indien een enkel nucleotide polymorfisme (SNP) is vertegenwoordigd in de gel element microarray, wordt de amplificatie microarray proef nauwkeurig de overeenkomstige mutatie in de MDR detecteert -TB genoom. Sommige van de versterking microarray sondes zijn ook gevoelig voor bijna-buurman mutaties die niet expliciet zijn vertegenwoordigd op de array als een unieke probe. Bijvoorbeeld isoleren TDR-0129 bevat een S531E mutatie in het rpoB-gen, maar er is geen specifieke probe voor de amplificatie microarray voor S531E. Toch vijf andere SNP sondes Targreting codon 531 geven aan dat een mutatie aanwezig op codon 531 is - de versterking microarray dus terecht geeft aan dat dit isolaat is rifampicine bestendig. Vergelijkbare gevoeligheid voor de rpoB S513W mutatie blijkt voor isoleren TDR-0148. Anderzijds, sommige SNP probes niet gevoelig zijn naaste buur mutaties, zoals geïllustreerd door isoleren TDR-0148 en rpoB S512G mutatie en isoleren TDR-0011 en KATG S315R mutatie. We vermoeden dat dit soort gedrag sonde is een gevolg van secundaire en tertiaire structuur in het enkelstrengs amplicon en / of sonde 34, en is niet iets dat kan worden voorspeld a priori. Toch sonde gevoeligheid voor naaste buur mutaties is analoog aan het gebruik van slordige moleculaire beacons om meerdere resistentie mutaties te detecteren met een minimale set van real-time PCR sondes 35,36, en kan diagnostisch voordelig zijn op voorwaarde dat de test niet het genereren van valse positieven relatief voor de fenotypische drug gevoeligheid.
Image Figuur 1. (A) Voorbeeld versterking microarray voor 100 pg wildtype M. tuberculose H37Ra genomische DNA en een 100 msec belichtingstijd. Cy3 bakens (voor geautomatiseerde gridding en segmentatie software) staan op de rand van het beeld. (B) Afbeelding van een amplificatie microarray met een fluorescerende aureool artefact als gevolg van de vorming van luchtbellen tijdens thermische cycli, en beschadigde gel elementen / puin. Geautomatiseerde beeldanalyse software is nog steeds in staat om een net en extraheren van gegevens plaats van deze afbeelding. klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
| Vennootschap | Catalogusnummer |
| Akonni Biosystems | Informeren |
| Qiagen | # 206143 |
| Qiagen | # 201207 |
| Qiagen | # 206143 |
| Thermo Fisher Scientific, Inc | # BP227-500 |
| Sigma-Aldrich | # 3B6917 |
| Akonni Biosystems | Informeren |
| Akonni Biosystems | Informeren |
| Thermo Fisher Scientific, Inc | # BP1328-4 |
| Thermo Fisher Scientific, Inc | # BP151-500 |
| Huidige Technologies, Inc | # BRSPRAY128 |
| Decon Labs, Inc | # 8416 |
| Vennootschap | Catalogusnummer |
| Akonni Biosystems | 100-20011 |
| 100-10021 | |
| Arrayit | HTW |
| Thermo Fisher Scientific, Inc | # 10-300 |
| VWR | # 3365040 |
| VWR | # 93000-196 |
| Centraal Pneumatische | # 95630 |
Tabel 2. Benodigde materialen en apparatuur.
| Codon | Sonde ID | WT Probe SNR Waarden | 500 pg | 100 pg | 50 pg | 25 pg | 12.5 pg | 6,25 pg | |||||||
| rpoB | 507 | 1 | 900,22 | 644,46 | 523,17 | 431,08 | 364,49 | 287,47 | |||||||
| 3 | 1.016,37 | 699,38 | 600,16 | 525,07 | 446,51 | 361,64 | |||||||||
| 511 | 5 | 867,67 | 611,97 | 529,90 | 451,73 | 403,76 | 307,68 | ||||||||
| 512 | 8 | 810,69 | 544,04 | 488,85 | 436,89 | 391,62 | 257,46 d> | ||||||||
| 513 | 11 | 824,36 | 547,04 | 496.00 | 472,01 | 408,96 | 242,25 | ||||||||
| 515 | 15 | 715,48 | 536,59 | 416,96 | 335,81 | 267,48 | 189,10 | ||||||||
| 516 | 17 | 723,83 | 496,44 | 402,95 | 69 "> 329,09270,10 | 201,98 | |||||||||
| 522 | 27 | 674,37 | 413,33 | 360,40 | 316,75 | 236,19 | 153,40 | ||||||||
| 524 | 29 | 269,46 | 153,69 | 117,71 | 118.02 | 110.13 | 51.22 | ||||||||
| 526 | 31 | 136,37 | <td class = "xl69"> 109.9082.63 | 76.76 | 53.61 | 37.76 | |||||||||
| 531 | 44 | 219,92 | 136,31 | 109.16 | 96.18 | 80.58 | 26.44 | ||||||||
| 533 | 51 | 130,54 | 83.60 | 76.03 | 63.47 | 61.35 | 41.54 | ||||||||
| rpsL | = "Xl71"> 43 | 54 | 10.41 | 12.75 | 53.30 | 767,18 | 5.39 | 362,42 | |||||||
| 88 | 56 | 655,54 | 542,79 | 527,43 | 690,34 | 403,86 | 456,05 | ||||||||
| KATG | 315 | 58 | 1.037,03 | 873,46 | p: none "> 816,64974,83 | 811,79 | 876,47 | ||||||||
| embB | 306 | 66 | 940,81 | 781,13 | 788,75 | 837,65 | 787,05 | 696,69 | |||||||
| Inha | 8 | 82 | 1.069,43 | 934,38 | 862,58 | 936,88 | 809,85 | 682 .56 | |||||||
| 15 | 85 | 1.111,66 | 931,88 | 918,22 | 957,87 | 795,72 | 723,16 | ||||||||
| 17 | 87 | 1.114,49 | 926,03 | 920,60 | 970,70 | 854,15 | 744,41 | ||||||||
Tabel 3. Signal to noise ratio voor wildtype sondes en een verdunningsreeks van M. tuberculose H37Ra genoom DNA. SNR waarden> 3 zijn detecteerbaar beschouwd.
ntent "fo: keep-together.within-page =" altijd ">
Tabel 4. Vertegenwoordiger genotypering gegevens van MDR-TB isolaten van bekende genotype bij 25 pg per amplificatie microarray reactie. Asterisks identificeren mutaties die niet vertegenwoordigd zijn door een uniek sonde op de gel element microarray. WT = wild-type nucleïnezuursequentie. Negatieve waarden (vet en gearceerd) zijn indicatief voor een mutatie, vandaar fenotypische resistentie. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De omvang van multiplexing met een amplificatie microarray wordt uiteindelijk bepaald door de efficiëntie van multiplex asymmetrische PCR, niet de microarray. In onze ervaring, kan 10-12 unieke primer paren gemakkelijk worden multiplexfunctionaliteit een amplificatie microarray-formaat. Conventionele primer en probe ontwerpcriteria gelden derhalve nieuwe assays, behalve dat men moet ook potentiële interacties tussen oplossing-fase nucleïnezuren en microarray geïmmobiliseerde probes, het thermisch rendement van de thermische cycler en probe hybridisatie gedrag in een PCR buffer van mening dat ook bevat PCR primers en laag molecuulgewicht amplificatie artefacten. Sterk multiplex versterking benaderingen zoals hele genoom amplificatie zijn niet bevorderlijk voor een single-kamer versterking microarray protocol voor een aantal technische redenen, met inbegrip van interferentie tussen willekeurige hexameren en geïmmobiliseerde probes, en inefficiënt hybridisatie van lange, double-stranded amplicons. Eris ook een inter-relatie tussen gemak van het gebruik, de totale analyse tijd, en detectiedrempels dat individuele gebruikers moeten overwegen bij het ontwerpen van aangepaste testen of het gebruik van de MDR-TB-test hier beschreven. Een vermindering van het aantal amplificatiecycli en zelfs elimineren de post-amplificatie hybridisatiestap aanzienlijk verminderen totale analysetijd, maar ten koste van testgevoeligheid. Aan de andere kant, het bereiken van een reproduceerbare 10 genkopie detectielimiet kan meer amplificatiecycli of hybridisatie tijd nodig, waardoor de uitbreiding van de totale analysetijd dan een enkele dienst.
De genen, mutaties, imager, analysesoftware en rapportage algoritme beschreven illustreren de amplificatie microarray werkwijze en systeem, in plaats van een verslag over hun analytische prestaties en klinisch nut. Bijvoorbeeld, kan het beginnen monster sputum, gedecontamineerd sediment, vaste of vloeibare culturen - de eisvoor de amplificatie microarray is gewoon dat de geëxtraheerde nucleïnezuren te amplificeren door asymmetrische, multiplex PCR. Sommige onderzoekers of artsen kunnen weinig tot geen klinische waarde bij het opsporen rpsL of embB mutaties die resistentie tegen streptomycine en ethambutol verlenen vinden, respectievelijk, alleen resistentie tegen rifampicine en isoniazide definiëren MDR-TB. Zo kunnen deze PCR primers en probes microarray worden vervangen met primers en probes die genen en mutaties die resistentie tegen andere eerste of tweede lijnantibiotica richten. Het is mogelijk om een rapportage-algoritme te schrijven aan de gebruiker te voorzien van gedetailleerde informatie over de specifieke mutaties die worden gedetecteerd in een bepaald monster, in plaats van een eenvoudige "weerstand gedetecteerd" of "verzet niet gedetecteerd" resultaat. Voor die onderzoekers die geïnteresseerd zijn in het gebruik van deze specifieke test om M. te analyseren tuberculosis isolaten, is het ook mogelijk om de genotypering gegevens zelfs als de IS6110 element niet detected in het monster.
Ongeacht de mogelijke test en rapportage permutaties, wordt de versterking microarray en hier beschreven protocol ontworpen om aanzienlijk vereenvoudigen microarray workflow door meerdere stappen moleculaire biologie te combineren in een enkele biochemische reactie en microfluïdische kamer. De representatieve gegevens tonen de effectiviteit van de aanpak door het versterken van negen MDR-TB genomische regio's en het opsporen van die asymmetrische amplicons met een lage dichtheid gel element microarray. De hier beschreven protocol maakt gebruik van een bulk wassen procedure die de gebruiker nodig heeft om fysiek te verwijderen van de pakking en dekglas van de versterking microarray voor het wassen, en is daarom meer geschikt voor onderzoek-gebruik-alleen aanvragen in plaats van klinische diagnostiek. Zoals elders beschreven, echter, is het zeker mogelijk om een wasstap on-chip met laterale flow fluïdica 33 bevatten en derhalve nog steeds een volledig gesloten amplicon verbruiksgoederen, including een die gemakkelijk kan worden opgenomen in een monster-doende-out diagnostisch systeem dat geschikt is voor point-of-care toepassingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health (NIH) onder toekenning RC3 AI089106.
MDR-TB nucleïnezuren werden verstrekt door het Fonds / United Nations Development Programme / Wereldbank / World Health Organization speciale programma het Kinderfonds van de Verenigde Naties voor Onderzoek en Opleiding in Tropische Ziekten (TDR), Genève, Zwitserland.
Wij danken dr. Tom Shinnick van de Amerikaanse Centers for Disease Control en Prevention voor begeleiding op de specifieke genen en mutaties in de prototype-test op te nemen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MDR-TB amplification microarrays, with applied gasket and pre-cut cover slips | Akonni Biosystems | Inquire | |
| Multiplex PCR kit, containing 2X PCR buffer with HotStar Taq plus | Qiagen | #206143 | |
| Taq polymerase | Qiagen | #201207 | |
| RNAse-free water | Qiagen | #206143 | |
| Formamide | Thermo Fisher Scientific, Inc. | #BP227-500 | |
| 20 mg mL-1 non-acetlyated bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | #3B6917 | |
| 5X concentrated MDR-TB primer mix | Akonni Biosystems | Inquire | |
| 500 fg uL-1 amplification and inhibition control | Akonni Biosystems | Inquire | |
| 20X SSPE | Thermo Fisher Scientific, Inc. | #BP1328-4 | |
| Triton X-100 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | #BP151-500 | |
| Disinfecting Spray | Current Technologies, Inc. | #BRSPRAY128 | |
| 70% Isopropyl Alcohol | Decon Labs, Inc. | #8416 | |
| Microarray imager, with automated image and data analysis software | Akonni Biosystems | 100-20011 | |
| Thermal cycler with flat block insert | Akonni Biosystems | 100-10021 | |
| High-throughput wash station and slide holder | ArrayIt | HTW | |
| Dissecting forceps | Thermo Fisher Scientific, Inc. | #10-300 | |
| Mini Vortexer | VWR | #3365040 | |
| Mini-centrifuge | VWR | #93000-196 | |
| Airbrush Compressor Kit | Central Pneumatic | #95630 |
References
- Lemaire, J. -F., Casenghi, M. New diagnostics for tuberculosis: fulfilling patient needs first. J. Int. AIDS Soc. 13, 40 (2010).
- World Health Organization. Tuberculosis diagnostic technology landscape. 42, World Health Organization. Geneva, Switzerland. (2012).
- Notomi, T., Okayama, H., et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucl. Acids Res. 28, e63 (2000).
- Vincent, M., Xu, Y., Kong, H. Helicase-dependent isothermal DNA amplification. EMBO Rep. 5, 795-800 (2004).
- Pritchard, C. G., Stefano, J. E. Amplified detection of viral nucleic acid at subattomole levels using Q beta replicase. Ann. Biol. Clin. 48, 492-497 (1990).
- Compton, J. Nucleic acid sequence-based amplification. Nature. 350, 91-92 (1991).
- Guatelli, J. C., Whitfield, K. M., et al. Isothermal, in vitro amplification of nucleic acids by a multienzyme reaction modeled after retroviral replication. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 1874-1878 (1990).
- Shi, X. C., Liu, X. Q., Xie, X. L., Xu, Y. C., Zhao, Z. X. Gene chip array for differentiation of mycobacterial species and detection of drug resistance. Chin. Med. J. , 3292-3297 (2012).
- Troesch, A., Nguyen, H., et al. Mycobacterium species identification and rifampin resistance testing with high-density DNA probe arrays. J. Clin. Microbiol. 37, 49-55 (1999).
- Caoili, J. C., Mayorova, A., et al. Evaluation of the TB-biochip oligonucleotide microarray system for rapid detection of rifampin resistance in Mycobacterium tuberculosis. J. Clin. Microbiol. 44, 2378-2381 (2006).
- Waddell, S., Laing, K., Senner, C., Butcher, P. Microarray analysis of defined Mycobacterium tuberculosis populations using RNA amplification strategies. BMC Genomics. 9, 94 (2008).
- Fukushima, M., Kakinuma, K., et al. Detection and identification of mycobacterium species isolates by DNA microarray. J. Clin. Microbiol. 41, 2605-2615 (2003).
- Park, H., Jang, H., et al. Detection and genotyping of Mycobacterium species from clinical isolates and specimens by oligonucleotide array. J. Clin. Microbiol. 43, 1782-1788 (2005).
- Yao, C., Zhu, T., et al. Detection of rpoB, katG and inhA gene mutations in Mycobacterium tuberculosis clinical isolates from Chongqing as determined by microarray. Clin. Microbiol. Infect. 16, 1639-1643 (2010).
- Sun, A. H., Fan, X. L., et al. Rapid detection of rpoB gene mutations in rif-resistant M. tuberculosis isolates by oligonucleotide microarray. Biomed. Environ. Sci. 22, 253-258 (2009).
- Volokhov, D. V., Chizhikov, V. E., Denkin, S., Zhang, Y. Molecular detection of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis with a scanning-frame oligonucleotide microarray. Methods Mol. Biol. 465, 395-417 (2009).
- Fu, L., Shinnick, T. M. Understanding the action of INH on a highly INH-resistant Mycobacterium tuberculosis strain using Genechips. Tuberculosis. 87, 63-70 (2007).
- Fu, L. M., Shinnick, T. M. Genome-wide exploration of the drug action of capreomycin on Mycobacterium tuberculosis using Affymetrix oligonucleotide GeneChips. J. Infect. 54, 277-284 (2007).
- Denkin, S., Volokhov, D., Chizhikov, V., Zhang, Y. Microarray-based pncA genotyping of pyrazinamide-resistant strains of Mycobacterium tuberculosis. J. Med. Microbiol. 54, 1127-1131 (2005).
- Gryadunov, D. A., Mikhailovich, V., et al. Evaluation of hybridisation on oligonucleotide microarrays for analysis of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis. Clin. Microbiol. Infect. 11, 531-539 (2005).
- Tang, X., Morrix, S. L., Langone, J. J., Bockstahler, L. E. Microarray and allele specific PCR detection of point mutations in Mycobacterium tuberculosis genes associated with drug resistance. J. Microbiol. Methods. 63, 318-330 (2005).
- Wade, M. M., Volokhov, D., Peredelchuk, M., Chizhikov, V., Zhang, Y. Accurate mapping of mutations of pyrazinamide-resistant Mycobacterium tuberculosis strains with a scanning-frame oligonucleotide microarray. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 49, 89-97 (2004).
- Yue, J., Shi, W., et al. Detection of rifampin-resistant Mycobacterium tuberculosis strains by using a specialized oligonucleotide microarray. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 48, 47-54 (2004).
- Kim, S. Y., Park, Y. K., et al. Evaluation of the CombiChip Mycobacteria Drug-Resistance detection DNA chip for identifying mutations associated with resistance to isoniazid and rifampin in Mycobacterium tuberculosis. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 54, 203-210 (2006).
- Brown, T. J., Herrera-Leon, L., Anthony, R. M., Drobniewski, F. A. The use of macroarrays for the identification of MDR Mycobacterium tuberculosis. J. Microbiol. Methods. 65, 294-300 (2006).
- Brossier, F., Veziris, N., Truffot-Pernot, C., Jarlier, V., Sougakoff, W. Performance of the genotype MTBDR line probe assay for detection of resistance to rifampin and isoniazid in strains of Mycobacterium tuberculosis with low- and high-level resistance. J. Clin. Microbiol. 44, 3659-3664 (2006).
- Padilla, E., Gonzalez, V., et al. Comparative evaluation of the new version of the INNO-LiPA Mycobacteria and GenoType Mycobacterium assays for identification of Mycobacterium species from MB/BacT liquid cultures artificially inoculated with mycobacterial strains. J. Clin. Microbiol. 42, 3083-3088 (2004).
- Barnard, M., Gey van Pittius, N. C., et al. The diagnostic performance of the GenoType MTBDRplus Version 2 line probe assay is equivalent to that of the Xpert MTB/RIF assay. J. Clin. Microbiol. 50, 3712-3716 (2012).
- Sekiguchi, J. -I., Nakamura, T., et al. Development and evaluation of a line probe assay for rapid identification of pncA mutations in pyrazinamide-resistant Mycobacterium tuberculosis strains. J. Clin. Microbiol. 45, 2802-2807 (2007).
- Chandler, D. P., Bryant, L., et al. Integrated amplification microarrays for infectious disease diagnostics. Microarrays. 1, 107-124 (2012).
- Vincent, V., Rigouts, L., et al. The TDR Tuberculosis Strain Bank: a resource for basic science, tool development and diagnostic services. Int. J. Tuberc. Lung Dis. 16, 24-31 (2012).
- Golova, J. B., Chernov, B. K., et al. Non-volatile copolymer compositions for fabricating gel element microarrays. Anal. Biochem. 421, 526-533 (2012).
- Cooney, C. G., Sipes, D., Thakore, N., Holmberg, R., Belgrader, P. A plastic, disposable microfluidic flow cell for coupled on-chip PCR and microarray detection of infectious agents. Biomed. Microdevices. 14, 45-53 (2012).
- Lane, S., Evermann, J., Loge, F., Call, D. R. Amplicon secondary structure prevents target hybridization to oligonucleotide microarrays. Biosens. Bioelectron. 20, 728-735 (2004).
- El-Hajj, H. H., Marras, S. A. E., et al. Use of sloppy molecular beacon probes for identification of Mycobacterial species. J. Clin. Microbiol. 47, 1190-1198 (2009).
- Boehme, C. C., Nabeta, P., et al. Rapid molecular detection of tuberculosis and rifampin resistance. N. Engl. J. Med. 363, 1005-1015 (2010).
