Summary
En forsterkning microarray kombinerer asymmetrisk PCR forsterkning og microarray hybridisering til en enkelt kammer, som i betydelig grad strømlinjemicroarray arbeidsflyt for sluttbrukeren. Forenkling microarray arbeidsflyt er et nødvendig første skritt for å skape microarray-baserte diagnostikk som kan brukes rutinemessig i lavere ressursmiljøer.
Abstract
Forenkling microarray arbeidsflyt er et nødvendig første skritt for å skape MDR-TB microarray-baserte diagnostikk som kan brukes rutinemessig i lavere ressursmiljøer. En forsterkning microarray kombinerer asymmetrisk PCR forsterkning, target størrelse valg, target merking, og microarray hybridisering innen en enkelt løsning og inn i en enkelt microfluidic kammer. En gruppebehandling metoden er demonstrert med en 9-plex asymmetrisk mester mix og lav tetthet gel element microarray for genotyping multiresistent Mycobacterium tuberculosis (MDR-TB). Protokollen er beskrevet her kan være ferdig i 6 timer og gi korrekt genotyping med minst 1000 celle ekvivalenter av genomisk DNA. Innlemming on-chip vasketrinn er mulig, noe som vil føre til en helt lukket fragment fremgangsmåte og et system. Omfanget av multipleksing med en forsterkning microarray er slutt begrenset av antall primer parene som kan kombineres til en enkelt master mix og likevel oppnå ønsket følsomhet og spesifisitet resultattall, snarere enn antall sonder som er immobilisert i matrisen. På samme måte kan den totale analysetiden forkortes eller forlenges avhengig av den spesifikke tiltenkte bruk, problemstilling, og ønskede deteksjonsgrenser. Likevel, den generelle tilnærmingen betydelig strømlinjemicroarray arbeidsflyt for sluttbrukeren ved å redusere antall manuelt intensive og tidkrevende behandlingstrinn, og gir en forenklet biokjemisk og microfluidic banen for å oversette microarray-baserte diagnostikk i rutinemessig klinisk praksis.
Introduction
Tidlig tilfelle oppdagelse og rask behandling er ansett som de mest effektive kontrollstrategier for å redusere Mycobacterium tuberculosis (MTB) overføring ett, og det er nå bred enighet i TB fellesskap som et poeng av omsorg (POC) eller i nærheten av POC test for å samtidig diagnostisere tuberkulose og legemiddelresistens (DR) er nødvendig. Teknologier som Cepheid største GeneXpert og andre nukleinsyre-amplifikasjon tester redusere tiden til diagnose for mange TB-pasienter, og gir en hurtig avlesing som indikerer resistens overfor rifampicin eller utvalgte mutasjoner som gir resistens til andre første eller andre medikamenter 2. Selv om sanntids-og isotermisk nukleinsyre-amplifikasjon testene er utformet for å identifisere medikament-resistente mutasjoner som fører til MDR-TB, er spekteret av mutasjoner de registrerer ofte utilstrekkelig til å utforme en individuell medikamentregime som svarer til den legemiddelresistens profilen av pasienten, og tekniske begrensninger knyttettil optisk cross-talk eller kompleksiteten av forsterkning og rapporterings kjemi 3 til 7 mai begrense antall loci eller mutasjoner som blir funnet. Dermed er sporingsteknologien med høyere multipleksing kapasitet som kreves for å løse kjente hull i MDR-TB POC diagnostikk.
Mikromatriser og WHO-godkjent Hain linjen prØveassays kan adressere "multiple genet, flere mutasjoner" utfordring å diagnostisere MDR-TB 8-29. Dessverre er disse hybridisering-basert, multipleksede deteksjons plattformer bruker multistep, komplisert, og open-fragment protokoller som krever betydelig opplæring og kompetanse i molekylære teknikker. Forsterkningen microarray 30 er designet for å ta opp noen av disse microarray arbeidsflyt og operasjonelle hensyn. De forenkler fluidic prinsipper er å forsterke, hybridisere, og detektere nukleinsyre-mål innen en enkelt mikrofluidkammer. Brukeren introduserer nukleinsyre og forsterkning master blandes inn i et virvelkammer med en pipette og starter termisk sykling protokollen. For satsvis behandling metode som er vist her, er mikromatriser deretter vasket i bulkløsning, tørket og fotografert. Denne studien viser funksjonaliteten til en forsterkning microarray ved hjelp av en MDR-TB microarray test for rpoB (30 mutasjoner), katG (2 mutasjoner), Inha (4 mutasjoner), rpsL (2 mutasjoner), embB (en mutasjon), IS1245, IS6110 , og en intern forsterkning og hybridisering kontroll. Minst en matchende par av microarray prober (villtype (WT) og mutant enkelt-nukleotid (MU)) er inkludert for hver mutasjon av interesse. Rensede nukleinsyrer fra multi-legemiddelresistent M. tuberkulose er fra TDR Tuberkulose Strain Bank 31. Gel element mikromatriser er fremstilt på glass-substrater ved kopolymerisasjon i det vesentlige som beskrevet andre steder 32, bortsett fra at vi bruker 4% monomer og 0,05 mM av hver sonde i polymerisasjonskatalysatorenasjon blanding. Matriser er omgitt med en 50 ml pakning før bruk. Etter termisk sykling, hybridisering, og vasketrinn, er forsterkning mikromatriser avbildes på en Akonni bærbar analysator. Bakgrunn-korrigert, integrerte signalintensitet er hentet fra den rå. Tif bilder ved hjelp av en fast sirkel algoritme. Støy for hver gel element beregnes som tre ganger standardavviket for de lokale spot-bakgrunn. Genet mål er vanligvis betraktet påvisbare for signal til støy-forhold (SNR) verdier ≥ 3. For å bestemme nærvær eller fravær av en spesifikk mutasjon i hvert gen eller kodon, er en diskriminant forhold beregnet fra SNR verdiene som (WT-MU) / (WT + MU). Diskriminant forholdstall <0 er en indikasjon på en medikamentresistens-mutasjonen ved locus, mens forholdstall> 0 er beskrivende for villtype-sekvensen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
For laboratorier som følger universelle forholdsregler PCR, er det operasjonelt mer effektivt å inkludere flere forsterkning mikromatriser og pakninger per substrat og vaske alle forsterkning mikromatriser samtidig i en bulk container, som beskrevet her. Forbruks formater er tilgjengelige for å utføre post-forsterkning microarray vasketrinn i en helt lukket, lukket fragment test, som rapportert andre steder 30,33.
En. Setup
- Ekstraher og rense nukleinsyrer fra prøven under passende biologisk forhold med en metode for valg. Kravet er at nukleinsyrer være av tilstrekkelig renhet for asymmetrisk, multipleks PCR amplifikasjon.
- Forbered arbeidsområdet ved å tørke overflater og utstyr med dekontaminering løsninger.
- Plasser forsterkning reagenser på is eller kald blokk.
- Merk et sterilt 1,5 ml mikrosentrifugerør for forsterkning Master Mix, og merke en steril 0,2 ml mikro tuvære for hver prøve.
- Etter at reagensene er tint, kort vortex og samle innholdene til bunnen av røret med en puls-spinn i en mini-sentrifuge. Ikke vortex Taq polymerase. Knips forsiktig på røret for å mikse og følge med en puls-spinn i mini-sentrifuger.
- Tilbered en forsterkning konsentrat-blanding ved hjelp av per-sample reaksjonsvolumer som er vist i tabell 1.. For å ta hensyn til mulige unøyaktigheter pipettering, forberede minst ett reaksjonsvolum enn det totale antall prøver som blir behandlet. Merk at master mix inneholder tilleggs Taq polymerase, utover det som følger med den muliplex PCR buffer. Bare legge forsterkning / hemming kontrollen til konsentrat-blandingen etter at alle andre reagenser blir kombinert, og de lager reagensrør returnert til lagring.
| Reagens | Per-prøvevolum (mL) | <strong> Final [] |
| Mulitplex PCR Buffer med HotStar Taq Plus | 25 | 1x |
| Bovint serum albumin (BSA) | 0,55 | 0,6 mg / ml |
| Formamide | 3,8 | 7,6% |
| Tilleggs Taq polymerase | 0,8 | enheter / mL (4 enheter totalt) |
| MDR-TB primerblandingen | 15.75 | - |
| RNase-free H 2 O | 2.1 | - |
| Amplification / Hemming kontroll | 1 | 5,0 fg / mL |
| Total | 49 |
Tabell 1. MDR-TB forsterkning microarray mester mix komposisjon.
- Vortex Master Mix og samle innholdene til bunnen av røret med en puls-spinn i en mini-sentrifuge.
- Kombiner 49 mL av master-mix og en ul av M. tuberculosis DNA til hvert av prøverørene fra trinn 1.4, ovenfor. For en ekstern, ingen mal kontroll (NTC), bruke en ul av molekylærbiologi grade vann i stedet for M. tuberkulose DNA-prøve. Vortex-og puls-spin røret (s) når den er ferdig.
2. Last Amplification Mikromatriser
- Legg 48 mL av hver master mix / sample på midten av sine respektive mikromatriser, er forsiktig med å ikke ta på microarray selv.
- Plasser et dekkglass på toppen av microarray pakning og segl, være forsiktig med å felle noen luftbobler i microarray kammeret. Luftbobler kan negativt påvirke amplifiseringseffektivitetog kan skape artefakter eller støy i den påfølgende microarray bildet.
Tre. Termisk Sykling
- Når alle mikromatriser er lastet med sample, sted substrater på den flate blokktermosykler. Pass på at det oppvarmede lokket alternativet er satt til "Av". Utstyr innhentet fra Akonni Biosystems vil allerede være prekvalifisert for bruk. Ellers er det svært viktig å kontrollere at den flate blokk termisk cycler (s) gi (s) ensartet og jevn varme over alle microarray underlag.
- Åpne termosykleren programvaren, velger du det aktuelle programmet, skriv "50 mL" for reaksjonen volum, og starte løp. Den termisk sykling protokoll beskrevet her består av:
Termisk sykling Steps 1 88 ° C 5 min 2 88 ° C 30 sek 3 55 ° C 1 min 4 65 ° C 30 sek 5 Gjenta trinn (2-4) for 50 sykluser 6 65 ° C 3 min 7 55 ° C 3 hr - Det totale antall av termiske sykluser og 55 ° C etter forsterkning holdetid er uavhengige variabler som brukeren kan modifisere, som er nødvendig eller hensiktsmessig for det bestemte forsøk. På grunn av at MDR-TB konsentrat-blandingen skaper asymmetriske (overveiende enkelt-trådede) amplikonene, er det vanligvis nyttig å inkludere mer termiske sykluser enn ellers kunne benyttes for en konvensjonell, eksponentiell PCR amplifikasjon protokoll.
- Når termisk sykling og hybridisering programmet er ferdig, avslutter programmet, fjerne forsterkning mikromatriser, lukke programmet, og slå av termisk cycler (s).
4. Vaske og tørke
- For å vaske opp til 24 substratene samtidig forbereder minst 250 ml 1 x SSPE - 0,1% Triton X-100 vaskebuffer og to beholdere med i det minste 250 ml avionisert eller Milli-Q vann hver klasse. Vaskebufferen kan være forberedt på forhånd.
- Fjern forsiktig dekkglass og pakning fra hver forsterkning microarray kammer hjelp flat-end tang. Dette trinnet er det punktet hvor det er størst risiko for fysisk skade gel element arrays. Bruk egnet PCR forurensning kontroller for å hindre spredning av forsterkede nukleinsyrer innenfor arbeidsmiljø.
- Plasser microarray underlag i en histologi glassholder, og plassere alle lysbildene i vaske bin inneholder vaskebufferen. Dekk beholder med lokk.
- Vask mikromatriser i 10 minutter ved romtemperatur med forsiktig omrøring.
- Dypp microarrays tre ganger hver i to påfølgende vasker av ionisert ellerMilli-Q kvalitetsbestemt vann, og lufttørkes.
5. Imaging
Den asymmetriske MDR-TB primerblandingen genererer Cy3-merket amplicons. Gel element mikromatriser kan avbildes med enhver standard microarray imager stand til bildebehandling Cy3. Følgende bildebehandling Prosedyren er spesifikk for MDR-TB mester mix, Dx2100 feltet bærbar imager, og automatisert analyse programvare levert av Akonni.
- Forsikre deg om at Ethernet-kabelen fra kamera er koblet til datamaskinen.
- Slå på imager. Strømbryteren er plassert på baksiden av instrumentet. Blå lysdioder på fronten av imager lyser når imager er slått på.
- Slå på datamaskinen.
- På skrivebordet, dobbeltklikk på programvareikonet for å starte automatisert bildeanalyse programvare.
- Vent til programvaren for å etablere en forbindelse med imager kamera. Når tilkoblingen er opprettet, blir Analyze knappen tilgjengelig, ogmeldingen "Connection Successful" vises i nedre venstre hjørne av skjermen.
- Sett tørket forsterkning microarray med microarray vender bort fra brukeren, og mot objektiv. Dersom mikroarray er feil orientert i forhold til linsen og kameraet, blir automatisert analyseprogramvare mislykkes i å plassere et rutenett på fluorescens bildet.
- Lukk dekselet. En forhåndsvisning vil være tilgjengelig på dataskjermen.
- Velg MDR-TB analyse script fra rullegardinmenyen og skriv inn ønsket lukkertid (i millisekunder). En typisk utgangspunkt for gel element forsterkning mikromatriser er 100-500 msek.
- Mettede piksler vil bli vist på Forhåndsvis bilde i rødt. Juster eksponeringstiden for å minimalisere antallet av mettede punkter innenfor individuelle flekker.
- Klikk Analyser for å skaffe og analysere fluorescens bildet. Programvaren vil automatisk plassere enMDR-TB assay-bestemt rutenett på bildet, ekstraher integrerte intensitet og bakgrunnsverdier og rapportere legemiddelresistens og genotyping resultater. Den automatiserte analysen tar vanligvis noen få sekunder. For utfordrende bilder som inneholder riper, støv, fluorescerende gjenstander, eller fysisk skade på mikromatriser funksjoner, kan programvaren trenger opptil 1 min å fullføre analysen.
- Når analysen er fullført, klikker du på Lagre, velger målmappen, skriv inn et filnavn, og klikk OK. Underliggende microarray data lagres som en. Xls-fil og kan eksporteres for off-line analyser, hvis det er ønskelig.
- Når analysen er fullført, fjerner forsterkning microarray fra imager, og klikk på Ny for å starte neste analyse.
- Når du er ferdig å samle inn data, lukker programvaren, slå av datamaskinen, og slå av imager.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kvalitativ bildeanalyse kan gi innsikt i kilder til eksperimentell støy eller variasjon som er utfordrende å identifisere i datatabeller generert av automatisert bildeanalyse programvare. Dermed kan det være nyttig å visuelt konstatere at 1) alle gel elementer er intakt og uskadet, 2) den globale bakgrunnen er fri fra fluorescerende gjenstander som kan påvirke enkelte signal til støy-forhold () verdier SNR, 3) det er ingen bevis for bobledannelse eller ujevn forsterkning / hybridisering tvers over matrisen, og 4) at programvaren nøyaktig identifisert alle flekker på mikromatrisebilde. Eksempel MDR-TB forsterkning microarray bilder er vist i figur 1, som illustrerer en høy kvalitet på matrisen og gjenstander som kan oppstå på grunn av fysisk skade eller bobler under termisk sykling. Standard microarray bildeanalyse programvare er vanligvis i stand til å plassere et rutenett og pakke integrert intensitet og bakgrunn data selv fra dårlig kvalitet på bilder som shegen figur 1B, så det påhviler forskeren å etablere kontrollkriteriet og beregninger kvalitet for å akseptere eller avvise microarray bilder fra videre analyse. Probe redundans kan hjelpe lindre disse problemene. Imidlertid vil en helautomatisk, diagnostisk MDR-TB forsterkning microarray rapportering algoritme ellers erklære testen fra Figur 1B som "ugyldig".
Amplifikasjon microarray SNR verdiene for en fortynning serie av villtype H37Ra genomiske DNA er vist i tabell 2.. At 6,25 pg inndata genomisk DNA per reaksjon eller omtrent 1,25 x 10 3 celle-ekvivalenter, er alle villtype-prober lett oppdages. SNR-verdiene for hver av de innvendige forsterkning og inhiberings-kontroller varierte fra 98,48 (rpoB) til 967,24 (Akonni forsynt intern positiv kontroll), noe som indikerer at alle genet mål i den asymmetriske multipleks forsterkning reaksjonen forsterkes og detekterbare. Neitemplat-kontroller var negative (SNR <3) for alle sonder i forsterkning microarray. Genotyping forholdstall på 6,25 pg innspill DNA varierte 0,18 til 1,00 for alle WT / MU probe par, noe som viser korrekt oppførsel av WT og MU prober og hensiktsmessig genotyping.
Representative genotyping data for et panel av World Health Organization referanse isolater av kjente genotype er vist i tabell 3.. Hvis et enkelt nukleotid polymorfisme (SNP) er representert på gelen elementet microarray, da forsterkningen microarray test nøyaktig detekterer den tilsvarende mutasjon i MDR -TB genom. Noen av forsterkning microarray sonder er også følsomme for nær-nabo mutasjoner som ikke er eksplisitt representert på tabellen som en unik probe. For eksempel, isolere TDR-0129 inneholder en S531E mutasjon i rpoB genet, men det er ikke en spesifikk probe på forsterkning microarray for S531E. Likevel, fem andre SNP sonder targeting kodon 531 indikere at en mutasjon er tilstede ved kodon 531 - forsterkningen microarray derfor indikerer riktig at dette isolatet er rifampin motstandsdyktig. Lignende følsomhet til rpoB S513W mutasjon er tydelig for isolat TDR-0148. På den annen side er det enkelte SNP-prober ikke er følsomme for nær nabo mutasjoner, som illustrert ved isolat TDR-0148 og rpoB S512G mutasjon, og isolere TDR-0011 og katG S315R mutasjonen. Vi tror at denne type sonde oppførsel er et resultat av sekundær og tertiær struktur i enkelt-trådet fragment og / eller probe 34, og er ikke noe som kan forutsies a priori. Ikke desto mindre er probe følsomhet for i nærheten av nabo mutasjoner som er analog med bruken av slurvet molekyl radiofyr for å detektere flere medikament resistensmutasjonene med et minimalt sett av sanntids-PCR-prober 35,36, og kan være diagnostisk fordelaktig forutsatt at testen ikke genererer falske positiver forholdtiv til den fenotypiske resistens.
Figur 1 (A). Eksempel forsterkning mikromatrisebilde for 100 pg villtype M. tuberculosis H37Ra genomisk DNA og en 100 msek eksponeringstid. Cy3 radiofyr (for automatisert slipe og segmentering programvare) er på periferien av bildet. (B) Bilde av en forsterkning microarray som viser en fluorescerende halogen artefakt som skyldes dannelse av bobler under termisk sykling, og skadet gel elementer / rusk. Automatisert bildeanalyse programvare er fortsatt i stand til å plassere et rutenett og trekke ut data fra dette bildet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Selskapet | Katalognummer |
| Akonni Biosystems | Spørre |
| Qiagen | # 206143 |
| Qiagen | # 201207 |
| Qiagen | # 206143 |
| Thermo Fisher Scientific, Inc. | # BP227-500 |
| Sigma-Aldrich | # 3B6917 |
| Akonni Biosystems | Spørre |
| Akonni Biosystems | Spørre |
| Thermo Fisher Scientific, Inc. | # BP1328-4 |
| Thermo Fisher Scientific, Inc. | # BP151-500 |
| Omløps Technologies, Inc. | # BRSPRAY128 |
| Decon Labs, Inc. | # 8416 |
| Selskapet | Katalognummer |
| Akonni Biosystems | 100-20011 |
| 100-10021 | |
| ArrayIt | HTW |
| Thermo Fisher Scientific, Inc. | # 10-300 |
| VWR | # 3365040 |
| VWR | # 93000-196 |
| Sentral pneumatisk | # 95630 |
Tabell 2. Nødvendige materialer og utstyr.
| Kodon | Probe ID | WT Probe SNR verdier | 500 pg | 100 pg | 50 pg | 25 pg | 12,5 pg | 6,25 pg | |||||||
| rpoB | 507 | 1 | 900,22 | 644,46 | 523,17 | 431,08 | 364,49 | 287,47 | |||||||
| 3 | 1016,37 | 699,38 | 600,16 | 525,07 | 446,51 | 361,64 | |||||||||
| 511 | 5 | 867,67 | 611,97 | 529,90 | 451,73 | 403,76 | 307,68 | ||||||||
| 512 | 8 | 810,69 | 544,04 | 488,85 | 436,89 | 391,62 | 257,46 d> | ||||||||
| 513 | 11 | 824,36 | 547,04 | 496.00 | 472,01 | 408,96 | 242,25 | ||||||||
| 515 | 15 | 715,48 | 536,59 | 416,96 | 335,81 | 267,48 | 189,10 | ||||||||
| 516 | 17 | 723,83 | 496,44 | 402,95 | 69 "> 329,09270,10 | 201,98 | |||||||||
| 522 | 27 | 674,37 | 413,33 | 360,40 | 316,75 | 236,19 | 153,40 | ||||||||
| 524 | 29 | 269,46 | 153,69 | 117,71 | 118,02 | 110,13 | 51.22 | ||||||||
| 526 | 31 | 136,37 | <td class = "xl69"> 109,9082,63 | 76.76 | 53.61 | 37.76 | |||||||||
| 531 | 44 | 219,92 | 136,31 | 109,16 | 96,18 | 80.58 | 26.44 | ||||||||
| 533 | 51 | 130,54 | 83.60 | 76.03 | 63.47 | 61.35 | 41.54 | ||||||||
| rpsL | = "Xl71"> 43 | 54 | 10.41 | 12.75 | 53.30 | 767,18 | 5,39 | 362,42 | |||||||
| 88 | 56 | 655,54 | 542,79 | 527,43 | 690,34 | 403,86 | 456,05 | ||||||||
| katG | 315 | 58 | 1037,03 | 873,46 | p: none "> 816,64974,83 | 811,79 | 876,47 | ||||||||
| embB | 306 | 66 | 940,81 | 781,13 | 788,75 | 837,65 | 787,05 | 696,69 | |||||||
| Inha | 8 | 82 | 1069,43 | 934,38 | 862,58 | 936,88 | 809,85 | 682 0,56 | |||||||
| 15 | 85 | 1111,66 | 931,88 | 918,22 | 957,87 | 795,72 | 723,16 | ||||||||
| 17 | 87 | 1114,49 | 926,03 | 920,60 | 970,70 | 854,15 | 744,41 | ||||||||
Tabell 3. Signal til støyforholdet for villtype prober og en fortynning serie av M. tuberkulose H37Ra genomisk DNA. SNR verdier> 3 anses synlig.
ntent "fo: keep-together.within-page =" always ">
Tabell 4.. Representative genotyping data fra MDR-TB-isolater av kjent genotype ved 25 pg pr forsterkning microarray reaksjon. Stjernene identifisere mutasjoner som ikke er representert ved en unik probe på gelen elementet microarray. WT = villtype nukleinsyresekvens. Negative verdier (fet og skyggelagt) er tegn på en mutasjon, derav fenotypisk resistens. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Omfanget av multipleksing med en forsterkning microarray har sin endelige diktert av effektiviteten av PCR multipleks asymmetrisk, ikke microarray. I vår erfaring, kan 10-12 unike primer parene lett multiplekset i en forsterkning microarray-format. Konvensjonelle primer og probe design kriterier gjelder derfor nye analyser, bortsett fra at man trenger også å vurdere mulige interaksjoner mellom løsningsorientert fase nukleinsyrer og immobilisert microarray sonder, den termiske effektiviteten av termisk cycler, og sondehybridisering atferd i en PCR buffer som også inneholder PCR primere og lav molekylvekt forsterkning gjenstander. Meget multipleksede forsterkning tilnærminger som hele genomet forsterkning er ikke bidrar til en enkelt-kammer forsterkning microarray-protokollen for en rekke tekniske årsaker, inkludert interferens mellom tilfeldige hexamers og immobilisert sonder, og ineffektiv hybridisering av lange, doble-strandet amplicons. Deter også en innbyrdes forholdet mellom ease-of-bruk, total analyse tid, og deteksjonsgrenser som enkeltbrukere må vurdere når du utformer egne analyser eller ved hjelp av MDR-TB test beskrevet her. For eksempel vil redusere antallet amplifikasjons-sykluser, og til og med eliminere den post-amplifikasjon hybridiserings-trinnet redusere total analysetid, men på bekostning av test følsomhet. På den annen side kan oppnå en reproduserbar 10 gen kopideteksjonsgrense krever flere forsterknings sykluser eller hybridiserings-tiden, og dermed forlenge den totale analysetiden utover et enkelt arbeidsskift.
Genene, mutasjoner, imager, analyse programvare, og rapportering algoritme beskrevet her er illustrerende for forsterkning microarray-metoden og systemet, snarere enn en rapport om sine analytiske ytelse og klinisk nytte. For eksempel kan den starte prøven være sputum, dekontamineres sediment, solid-eller flytende kulturer - kravetfor forsterkning microarray er rett og slett at de utklipte nukleinsyrer er amplifibart ved asymmetrisk, multiplex PCR. Noen forskere eller klinikere kan finne liten eller ingen klinisk verdi i å oppdage rpsL eller embB mutasjoner som gir resistens mot streptomycin og etambutol, henholdsvis, bare motstand mot rifampicin og isoniazid definere MDR-TB. Således kan disse PCR-primere og prober microarray erstattes med primere og prober som er rettet mot gener og mutasjoner som gir resistens til andre første-eller andre-linje antibiotika. Det er mulig å skrive en rapporterings algoritme for å gi brukeren detaljert informasjon om de spesifikke mutasjoner som er påvist i et gitt mønster, snarere enn en enkel "motstand oppdaget" eller "motstand ikke oppdaget" resultat. For de forskere som er interessert i å bruke denne spesifikke analysen å analysere M. tuberculosis-isolater, er det også mulig å gi den genotyping data selv om IS6110 elementet er ikke detected i prøven.
Uavhengig av de mulige analyse-og rapporterings permutasjoner, blir forsterkningen og microarray protokollen beskrevet her, er utformet for å betydelig forenkle microarray arbeidsflyt ved å kombinere flere molekylære biologiske trinn til en enkelt biokjemisk reaksjon, og mikrofluidkammeret. De representative data demonstrere effekten av tilnærming ved å forsterke ni MDR-TB genomiske regioner og oppdager de asymmetriske amplicons med en lav tetthet gel element microarray. Protokollen er beskrevet her bruker en bulk vaskeprosedyre som krever at brukeren til å fysisk fjerne pakningen og dekkglass fra forsterkning microarray før vask, og er derfor mer egnet for forskning-bruk-bare applikasjoner snarere enn klinisk diagnostikk. Som beskrevet annet sted, er det imidlertid absolutt mulig å innlemme et vasketrinn på brikken ved hjelp av lateral-strømningslufthåndtering 33 og derfor opprettholde en helt lukket fragment forbruks, inkl.uding en som lett kan innlemmes i en prøve-i svar-out diagnostisk system som passer for point-of-care-applikasjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health (NIH) i henhold til tildelings RC3 AI089106.
MDR-TB nukleinsyrer ble gitt av FNs barnefond / FNs utviklingsprogram / Verdensbanken / World Health Organization Special Program for forskning og opplæring i tropiske sykdommer (TDR), Genève, Sveits.
Vi takker Dr. Tom Shinnick av US Centers for Disease Control and Prevention for veiledning på spesifikke gener og mutasjoner som skal inkluderes i prototype-analysen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MDR-TB amplification microarrays, with applied gasket and pre-cut cover slips | Akonni Biosystems | Inquire | |
| Multiplex PCR kit, containing 2X PCR buffer with HotStar Taq plus | Qiagen | #206143 | |
| Taq polymerase | Qiagen | #201207 | |
| RNAse-free water | Qiagen | #206143 | |
| Formamide | Thermo Fisher Scientific, Inc. | #BP227-500 | |
| 20 mg mL-1 non-acetlyated bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | #3B6917 | |
| 5X concentrated MDR-TB primer mix | Akonni Biosystems | Inquire | |
| 500 fg uL-1 amplification and inhibition control | Akonni Biosystems | Inquire | |
| 20X SSPE | Thermo Fisher Scientific, Inc. | #BP1328-4 | |
| Triton X-100 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | #BP151-500 | |
| Disinfecting Spray | Current Technologies, Inc. | #BRSPRAY128 | |
| 70% Isopropyl Alcohol | Decon Labs, Inc. | #8416 | |
| Microarray imager, with automated image and data analysis software | Akonni Biosystems | 100-20011 | |
| Thermal cycler with flat block insert | Akonni Biosystems | 100-10021 | |
| High-throughput wash station and slide holder | ArrayIt | HTW | |
| Dissecting forceps | Thermo Fisher Scientific, Inc. | #10-300 | |
| Mini Vortexer | VWR | #3365040 | |
| Mini-centrifuge | VWR | #93000-196 | |
| Airbrush Compressor Kit | Central Pneumatic | #95630 |
References
- Lemaire, J. -F., Casenghi, M. New diagnostics for tuberculosis: fulfilling patient needs first. J. Int. AIDS Soc. 13, 40 (2010).
- World Health Organization. Tuberculosis diagnostic technology landscape. 42, World Health Organization. Geneva, Switzerland. (2012).
- Notomi, T., Okayama, H., et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucl. Acids Res. 28, e63 (2000).
- Vincent, M., Xu, Y., Kong, H. Helicase-dependent isothermal DNA amplification. EMBO Rep. 5, 795-800 (2004).
- Pritchard, C. G., Stefano, J. E. Amplified detection of viral nucleic acid at subattomole levels using Q beta replicase. Ann. Biol. Clin. 48, 492-497 (1990).
- Compton, J. Nucleic acid sequence-based amplification. Nature. 350, 91-92 (1991).
- Guatelli, J. C., Whitfield, K. M., et al. Isothermal, in vitro amplification of nucleic acids by a multienzyme reaction modeled after retroviral replication. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 1874-1878 (1990).
- Shi, X. C., Liu, X. Q., Xie, X. L., Xu, Y. C., Zhao, Z. X. Gene chip array for differentiation of mycobacterial species and detection of drug resistance. Chin. Med. J. , 3292-3297 (2012).
- Troesch, A., Nguyen, H., et al. Mycobacterium species identification and rifampin resistance testing with high-density DNA probe arrays. J. Clin. Microbiol. 37, 49-55 (1999).
- Caoili, J. C., Mayorova, A., et al. Evaluation of the TB-biochip oligonucleotide microarray system for rapid detection of rifampin resistance in Mycobacterium tuberculosis. J. Clin. Microbiol. 44, 2378-2381 (2006).
- Waddell, S., Laing, K., Senner, C., Butcher, P. Microarray analysis of defined Mycobacterium tuberculosis populations using RNA amplification strategies. BMC Genomics. 9, 94 (2008).
- Fukushima, M., Kakinuma, K., et al. Detection and identification of mycobacterium species isolates by DNA microarray. J. Clin. Microbiol. 41, 2605-2615 (2003).
- Park, H., Jang, H., et al. Detection and genotyping of Mycobacterium species from clinical isolates and specimens by oligonucleotide array. J. Clin. Microbiol. 43, 1782-1788 (2005).
- Yao, C., Zhu, T., et al. Detection of rpoB, katG and inhA gene mutations in Mycobacterium tuberculosis clinical isolates from Chongqing as determined by microarray. Clin. Microbiol. Infect. 16, 1639-1643 (2010).
- Sun, A. H., Fan, X. L., et al. Rapid detection of rpoB gene mutations in rif-resistant M. tuberculosis isolates by oligonucleotide microarray. Biomed. Environ. Sci. 22, 253-258 (2009).
- Volokhov, D. V., Chizhikov, V. E., Denkin, S., Zhang, Y. Molecular detection of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis with a scanning-frame oligonucleotide microarray. Methods Mol. Biol. 465, 395-417 (2009).
- Fu, L., Shinnick, T. M. Understanding the action of INH on a highly INH-resistant Mycobacterium tuberculosis strain using Genechips. Tuberculosis. 87, 63-70 (2007).
- Fu, L. M., Shinnick, T. M. Genome-wide exploration of the drug action of capreomycin on Mycobacterium tuberculosis using Affymetrix oligonucleotide GeneChips. J. Infect. 54, 277-284 (2007).
- Denkin, S., Volokhov, D., Chizhikov, V., Zhang, Y. Microarray-based pncA genotyping of pyrazinamide-resistant strains of Mycobacterium tuberculosis. J. Med. Microbiol. 54, 1127-1131 (2005).
- Gryadunov, D. A., Mikhailovich, V., et al. Evaluation of hybridisation on oligonucleotide microarrays for analysis of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis. Clin. Microbiol. Infect. 11, 531-539 (2005).
- Tang, X., Morrix, S. L., Langone, J. J., Bockstahler, L. E. Microarray and allele specific PCR detection of point mutations in Mycobacterium tuberculosis genes associated with drug resistance. J. Microbiol. Methods. 63, 318-330 (2005).
- Wade, M. M., Volokhov, D., Peredelchuk, M., Chizhikov, V., Zhang, Y. Accurate mapping of mutations of pyrazinamide-resistant Mycobacterium tuberculosis strains with a scanning-frame oligonucleotide microarray. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 49, 89-97 (2004).
- Yue, J., Shi, W., et al. Detection of rifampin-resistant Mycobacterium tuberculosis strains by using a specialized oligonucleotide microarray. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 48, 47-54 (2004).
- Kim, S. Y., Park, Y. K., et al. Evaluation of the CombiChip Mycobacteria Drug-Resistance detection DNA chip for identifying mutations associated with resistance to isoniazid and rifampin in Mycobacterium tuberculosis. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 54, 203-210 (2006).
- Brown, T. J., Herrera-Leon, L., Anthony, R. M., Drobniewski, F. A. The use of macroarrays for the identification of MDR Mycobacterium tuberculosis. J. Microbiol. Methods. 65, 294-300 (2006).
- Brossier, F., Veziris, N., Truffot-Pernot, C., Jarlier, V., Sougakoff, W. Performance of the genotype MTBDR line probe assay for detection of resistance to rifampin and isoniazid in strains of Mycobacterium tuberculosis with low- and high-level resistance. J. Clin. Microbiol. 44, 3659-3664 (2006).
- Padilla, E., Gonzalez, V., et al. Comparative evaluation of the new version of the INNO-LiPA Mycobacteria and GenoType Mycobacterium assays for identification of Mycobacterium species from MB/BacT liquid cultures artificially inoculated with mycobacterial strains. J. Clin. Microbiol. 42, 3083-3088 (2004).
- Barnard, M., Gey van Pittius, N. C., et al. The diagnostic performance of the GenoType MTBDRplus Version 2 line probe assay is equivalent to that of the Xpert MTB/RIF assay. J. Clin. Microbiol. 50, 3712-3716 (2012).
- Sekiguchi, J. -I., Nakamura, T., et al. Development and evaluation of a line probe assay for rapid identification of pncA mutations in pyrazinamide-resistant Mycobacterium tuberculosis strains. J. Clin. Microbiol. 45, 2802-2807 (2007).
- Chandler, D. P., Bryant, L., et al. Integrated amplification microarrays for infectious disease diagnostics. Microarrays. 1, 107-124 (2012).
- Vincent, V., Rigouts, L., et al. The TDR Tuberculosis Strain Bank: a resource for basic science, tool development and diagnostic services. Int. J. Tuberc. Lung Dis. 16, 24-31 (2012).
- Golova, J. B., Chernov, B. K., et al. Non-volatile copolymer compositions for fabricating gel element microarrays. Anal. Biochem. 421, 526-533 (2012).
- Cooney, C. G., Sipes, D., Thakore, N., Holmberg, R., Belgrader, P. A plastic, disposable microfluidic flow cell for coupled on-chip PCR and microarray detection of infectious agents. Biomed. Microdevices. 14, 45-53 (2012).
- Lane, S., Evermann, J., Loge, F., Call, D. R. Amplicon secondary structure prevents target hybridization to oligonucleotide microarrays. Biosens. Bioelectron. 20, 728-735 (2004).
- El-Hajj, H. H., Marras, S. A. E., et al. Use of sloppy molecular beacon probes for identification of Mycobacterial species. J. Clin. Microbiol. 47, 1190-1198 (2009).
- Boehme, C. C., Nabeta, P., et al. Rapid molecular detection of tuberculosis and rifampin resistance. N. Engl. J. Med. 363, 1005-1015 (2010).
