Summary
We beschrijven een protocol bij de ontwikkeling van door opioïden veroorzaakte hyperalgesie en tolerantie in muizen te onderzoeken. Op basis van de meting van thermische en mechanische nociceptieve reacties van naïeve en morfine behandelde dieren, het mogelijk om de toename van gevoeligheid voor pijn (hyperalgesie) kwantificeren afname analgesie (tolerantie) geassocieerd met chronische opiaat toediening.
Abstract
Opioïd-geïnduceerde hyperalgesie en tolerantie ernstige gevolgen voor de klinische werkzaamheid van opiaten als pijnstillers bij dieren en mensen. De moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan beide fenomenen zijn niet goed begrepen en hun opheldering moeten kunnen profiteren van de studie van diermodellen en uit het ontwerpen van passende experimentele protocollen.
We beschrijven hier een methodische aanpak voor het induceren, registreren en kwantificeren van morfine geïnduceerde hyperalgesie evenals voor waaruit analgesietolerantie, met behulp van de staart-immersie en staart druktesten in wild-type muizen. Zoals in beeld, wordt het protocol verdeeld in vijf opeenvolgende stappen. Hantering en gewenning fase om een veilige vaststelling van de basale nociceptieve respons van de dieren. Chronische morfine toediening induceert significante hyperalgesie zoals blijkt uit een toename van zowel thermische en mechanische gevoeligheid, terwijl de vergelijking van analgesie tijd gangen na acute of repeated morfinebehandeling duidelijk de ontwikkeling van tolerantie gemanifesteerd door een daling van de pijnstillende reactie amplitude. Dit protocol kan eveneens worden aangepast aan genetisch gemodificeerde muizen om de rol van individuele genen in de modulatie van nociceptie en morfine analgesie evalueren. Het biedt ook een modelsysteem om de effectiviteit van mogelijke therapeutische middelen te onderzoeken om opiate analgetische effectiviteit verbeteren.
Introduction
Opioïd-geïnduceerde hyperalgesie (OIH) en analgesietolerantie beperken de klinische werkzaamheid van opiaten bij dieren en mensen 1-3. De betrokkenheid van pro-inflammatoire 4,5 of van pro-nociceptieve (anti-opioïde) 6,7 worden momenteel verkend hypothesen. De ontrafeling van de mechanismen die ten grondslag liggen OIH en tolerantie vereist een combinatie van in vivo en in vitro benaderingen, met behulp van geschikte diermodellen, experimentele protocollen en moleculaire technieken.
Behavioral farmacologie is het dominante paradigma te monitoren en te kwantificeren pijnstillende en hyperalgetische staten in proefdieren (ratten, muizen). De toepassing van een schadelijke prikkel (thermisch, mechanisch of chemisch) een geschikte lichaamsdeel (achterpoot, staart) van het dier leidt tot een nocifensive terugtrekking die gemakkelijk kunnen worden gemaakt.
We stellen hier een methodische aanpak voor het induceren, registreren en kwantificeren OIH entolerantie in wild-type muizen, met behulp van de staart-immersie en staart druktesten. De werkwijze maakt een eenvoudige, gevoelige en reproduceerbare bepaling van thermische en mechanische nociceptieve respons waarden bij muizen. Zoals aangetoond in de video-protocol, C57BL / 6 muizen betekenis ervaren hyperalgesie na chronische toediening van morfine en deze te behouden voor meerdere dagen. Zowel thermische en mechanische nociceptieve waarden zijn aanzienlijk verminderd, in vergelijking met nulmetingen op naïeve dieren. Bovendien, onze experimentele opstelling maakt het mogelijk om te monitoren, in aanvulling op de ontwikkeling van OIH, de daling van de pijnstillende reactie op morfine (tolerantie). Gepresenteerde gegevens ondersteunen de opvatting dat hyperalgesie en tolerantie gemeenschappelijke cellulaire en moleculaire mechanismen 8,9 kan inhouden, hoewel dit wordt betwist in de literatuur 1,10-12. Tenslotte kan dit protocol eveneens worden aangepast om genetisch gemodificeerde muizen om de rol van individuele genen in de modula evaluerentie van de pijn. Het biedt ook een modelsysteem om de effectiviteit van mogelijke therapeutische middelen te evalueren opiate analgetische effecten te verbeteren.
Protocol
Alle experimenten werden uitgevoerd in strikte overeenstemming met de Europese richtlijnen voor de verzorging van proefdieren (Richtlijn 86/609/ECC Europese Gemeenschappen Raad) en de ethische richtlijnen voor onderzoek van experimentele pijn in dieren bij bewustzijn 13 uitgevoerd. Man C57BL6 / N Tac muizen (10 weken, 25-30 g) werden ondergebracht in een institutionele dier faciliteit met een verzorgend personeel belast met de exploitatie van de installatie in overeenstemming met de milieunormen. De dieren werden gehuisvest in groepen (maximaal vijf muizen per kooi) onder een 12 uur / 12 uur licht / donker cyclus bij een constante temperatuur (21 ± 1 ° C) met vrije toegang tot voedsel en water. Alle experimenten werden uitgevoerd in dezelfde periode van de dag (10:00-16:00) met behulp van een cohort van 16 muizen. Specifieke materialen en apparatuur zijn aangegeven in de tabel Materials.
Een procedure van vijf stappen om morfine geïnduceerde hyperalgesie en tolerantie te controleren
Het protocol isverdeeld in vijf opeenvolgende stappen (AE) over een periode van 15 dagen Figuur 1.
. 1 Muizen lossen (Stap A, d-7 tot d-5)
- Handvat muizen en wennen zij vrij kunnen invoeren in het restrainer. Deze voorbereidende stap vermindert stress - dus elke verwarring met stress geïnduceerde analgesie minimaliseren - en laat de dieren gewend aan de onderzoeker, behandeling en manipulatie in de muis restrainer. Elke muis wordt voorzichtig behandeld gedurende 5 min per dag.
. 2 Basale nociceptieve respons (Stap B, d-4 tot d-1)
- Meet staart terugtrekking latenties met behulp van de Staart Immersion Test (TIT):
- Zet de thermostaat op 48 ° C.
- Voorzichtig introduceren de muis in de restrainer. Dompel de uitstekende 2/3 einde van zijn staart in het waterbad en start de chronometer.
- De chronometer wordt gestopt zodra de muis trekt zijn staart uit het warme water en noteer de latentie tijd (in seconden). In the afwezigheid van nociceptieve reactie wordt een 25 seconden cut-off gebruikt om weefselschade te voorkomen.
- Plaats de muis in de kooi en test het volgende tot het einde van de reeks.
- Herhaal de nociceptieve respons metingen twee keer, metingen van de dieren in dezelfde volgorde. De nociceptieve respons latentie (s) voor elke muis bepaald als de gemiddelde waarde van drie opeenvolgende bepalingen.
- Meten mechanische antwoorden via de Staart Pressure Test (TPT)
- Voorzichtig introduceren de muis in de restrainer en zet zijn staart onder de conische punt van de analgesimeter.
- Druk op de voet-schakelaar om gelijkmatig toenemende druk uit te oefenen op het proximale deel van de staart tot aan de eerste nociceptieve reactie (worstelen, piepen) optreedt. Op het moment dat het dier reageert, neem het huidige kracht (in grammen) dat de nociceptieve reactie uitlokt. Bij gebreke van een reactie wordt een 600 g afkapwaarde gebruikt om t te voorkomenafgeven schade.
- Herhaal deze maatregel op de mediaan en distale delen van de staart van dezelfde muis. Een interval van ten minste 30 seconden wordt waargenomen tussen de maatregelen op een gegeven muis om aanpassing of stress vertekening te voorkomen. Plaats de muis in de kooi en test de volgende dier tot het einde van de reeks (alle muizen getest). De nociceptieve waarde (g) voor elke muis wordt genomen als de gemiddelde waarde van drie metingen (dwz proximale, middelste en distale delen van de staart van elk dier).
- Herhaal nociceptieve testen (alle procedures beschreven onder stap 2) op de volgende dagen, d-3 d-1.
. 3 Meting van morfine analgesie (Stap C; d0)
- Definieer de beste combinatie van dieren waarmee de selectie van twee groepen (n = 8 per groep) muizen met stabiele en vergelijkbare gemiddelde nociceptieve waarden, welke nociceptieve modaliteit (TIT of TPT) wordt beschouwd. Deze waarde wordt als het basalenociceptieve reactie referentiepunt voor toekomstige 'Saline' en 'Morphine' groepen.
- Meet het lichaamsgewicht van elk dier.
- Bereid een morfine-oplossing (0,5 mg morfine per ml) in steriele fysiologische zoutoplossing (NaCl 0,9%) voor subcutane toediening (5 mg morfine per kg lichaamsgewicht dier).
- Meet de nociceptieve response latency (genomen als tijdstip 0) voor elke muis zowel 'Saline' en 'Morphine' groepen in de TIT (alle stappen onder 2.1 hierboven). Meet vervolgens nociceptie in de TPT (alle stappen onder 2.2).
- Injecteer subcutaan morfine (typisch 0,25 ml van een 0,5 mg / ml morfine-oplossing per 25 g muis gewicht) en zoutoplossing (0,25 ml per 25 g muis gewicht) aan de "morfine" en "saline" groepen.
- Meet nociceptive waarden op de TIT en TPT (alle procedures beschreven hierboven onder stap 2.1 en 2.2, respectievelijk) over een tijd-cursus (op 30 min interval) morfine beoordelen (5 mg / kg) geïnduceerde analgesie:
- Na 30 minuten na de injectie, het meten van de nociceptieve respons (enkele bepaling) voor elke muis van de 'Saline' en 'Morphine' groepen, met behulp van de TIT dan de TPT.
- Meet vervolgens nociceptieve respons waarden (TIT en TPT) in alle muizen op tijdstippen (in uren): 1-1.5-2-2.5-3 en 3,5 na de injectie.
4 Chronische behandeling met morfine - Morfine-geïnduceerde hyperalgesie. (Stap D; d1 tot d6)
- Op de dag: d1
- Meet nociceptieve responswaarden de TIT en TPT zoals hierboven beschreven (stap 2.1 en 2.2). Annoteren zorgvuldig terugtrekking latencies en druk limieten voor elk dier.
- Bereid een nieuwe morfine-oplossing, zoals beschreven in stap 3.2.
- Injecteer subcutaan morfine (5 mg / kg lichaamsgewicht) de hele 'Morphine "groep en fysiologische zoutoplossing (0,25 ml per 25 g muis gewicht) aan de" Saline "groep. Laat the dieren rusten tot de volgende dag.
- Op Dagen: d2, d3, d4, d5 en d6 de in afdeling 4.1 beschreven handelingen te herhalen
. 5 Bewijs voor analgesietolerantie (Stap E; d7)
- Evalueer morfine geïnduceerde analgesie volgens het tijdsverloop paradigma reeds beschreven in hoofdstuk 3.
6. Data Acquisition en statistische analyses
- Beoordeling van Basale Nociceptieve Response Waarden (Stap B)
- Bereken voor elke dag (via d-4 tot d-1) worden de gemiddelde waarden ± SEM (n = 8) voor basale nociceptieve reacties zoals geboden door TIT en TPT in het "Saline" en "Morphine-groepen.
- Plot bedoel basale nociceptive waarden als functie van de tijd (dag) voor beide groepen Figuur 2.
- Analyse van Morphine Analgesia Time-cursus bij Days d0 (stap C) en d7 (stap E)
- Bereken, op elk tijdstip na morfineinjectie, het gemiddelde ± SEM-waarden (n = 8) voor nociceptieve reacties als leverde uit TIT (in seconden) en TPT (in g) in elke groep.
- Plot gemiddelde nociceptieve respons als functie van tijd voor de "Saline" en "Morphine-groepen op dag 0 Figuur 3 en dag 7 Figuur 5.
- Ontwikkeling van morfine-geïnduceerde hyperalgesie (stap D)
- Bereken voor elke dag (via d0-d7 behandelingsperiode) het gemiddelde ± SEM-waarden (n = 8) voor basale nociceptieve respons waarden leverde uit TIT en TPT in het "zoutoplossing behandelde en 'Morphine-behandelde" groep.
- Plot gemiddelde basale nociceptieve respons als functie van tijd (dag) voor de "zoutoplossing behandelde en 'Morphine-behandelde" groep figuur 4.
- Bewijs voor analgesietolerantie (Stappen C en E)
- Bepaal met behulp van de morfine tijdsverloop experiment uitgevoerd op d0 Figuur 3 de tijdswaarde (of tijdschaal) die nodig is voor morfine via een maximale analgetische respons te induceren.
- Neem deze waarde (meestal 30 min) als de referentietijd te schatten op d7 Figuur 5 de nociceptie basiswaarde (zoutoplossing behandelde groep) en de feitelijke pijnstillende werking (morfine-behandelde groep) aan acute morfine.
- Nociceptieve waarden genomen op tijdstip 30 min van morfine tijdsverloop experimenten uitgevoerd bij d0 en d7 voor de zoutoplossing behandelde en morfine-behandelde groepen, worden gepresenteerd als histogrammen figuur 6.
- Statistieken: Analyseer gegevens met behulp van one-way herhaalde metingen ANOVA. De factoren van variatie waren behandeling (tussen subjecten) en tijd (binnen onderwerp). Om verschillen afzonderlijk te controleren in elke groep, werd herhaalde metingen ANOVA uitgevoerd. Vergelijkingen tussen twee groepen werden uitgevoerd met ongepaarde t-test of een gepaarde t-test waar nodig.
- Het significantieniveau is ingesteld bij P <0,05. Alle statistische analyses zijn uitgevoerd met behulp van de Statview Software.
Representative Results
Beoordeling van Basale Nociceptieve Waarden van Naïve Muizen (Stap B)
TIT en TPT werden achtereenvolgens aangebracht op het gehele cohort van muizen (n = 16), zodat gemiddelde waarden nociceptieve respons. Beste combinatie van toegelaten a posteriori definitie van twee groepen (n = 8) van muizen, aangeduid als Saline en Morfine, die vergelijkbare en stabiele basale nociceptieve waarden weer Figuur 2. De gelijkwaardigheid van beide groepen geldt ongeacht de nociceptieve proef ( TIT: Figuur 2A; TPT: Figuur 2B) dat werd geselecteerd.
Time-cursus voor Morphine Analgesia op dag 0 (stap C)
Morfine analgesie werd geëvalueerd na een eenmalige injectie (sc) van morfine (5 mg / kg) in naïeve muizen met behulp van zowel MEES figuur 3A en TPT Figuur 3B. In beide tests, statistische analyses met een manier herhaalde metingen ANOVA REVEAl dat er een significante interactie tussen behandeling en tijd TIT (F (7, 98) = 72, p <0,001) en TPT (F (7, 98) = 31, p <0,001). TIT en TPT gegevensanalyses toepassing van herhaalde metingen ANOVA blijkt dat er geen effect van zoutoplossing (F (7, 49) = 0,49, p> 0,05) en F (7, 49) = 1,85, p> 0,05 voor respectievelijk TIT en TPT proeven), terwijl morfine injectie induceert een sterke analgesie bij muizen (F (7, 49) = 92,46, p <0,001) en F (7, 49) = 34,37, p <0,001 respectievelijk TIT en TPT testen). De maximale analgetische effect van morfine werd bereikt na 30 min in TIT en na 60 minuten TPT in vergelijking met zoutoplossing geïnjecteerde controles (p <0,001, ongepaarde t-test).
Herhaalde Morfine Administraties induceert Hyperalgesie in Muizen (stap D)
Basale nociceptieve waarden werden dagelijks gemetenvoordat zoutoplossing of morfine toediening (zie protocol). Zoals getoond in figuur 4, eenmaal daags morfine toedieningen gedurende 6 dagen behandeling induceerde een aanzienlijke en progressieve verlaging van thermische (F (7, 56) = 11,6, p <0,001, herhaalde metingen ANOVA, Figuur 4A) en mechanische (F ( 7,56) = 15,55, p <0,001, herhaalde metingen ANOVA; Figuur 4B) basale nociceptieve waarden. Hyperalgesie ontwikkelde snel begon significant op dag 1 in TIT (p <0,01, ongepaarde t-test vergeleken met zoutoplossing geïnjecteerde controles) en op dag 2 in TPT (p <0,05, ongepaarde t-test vergeleken met zoutoplossing geïnjecteerde controles).
Time-cursus voor Morphine Analgesia op dag 7 na chronische behandeling met morfine (stap E)
Op dag 7 werden muizen die dagelijks morfine of zoutoplossing injecties gedurende een periode van 7 dagen (d0 d6) in T onderzochtIT Figuur 5A en figuur 5B TPT eerst hun basale nociceptieve waarden en hun analgetische respons op acute morfine (5 mg / kg, sc.). In overeenstemming met de ontwikkeling van hyperalgesie getoond in figuur 4, de basale nociceptieve waarde (tijd 0) van muizen die chronisch behandeld werden met morfine was significant lager dan die van met zoutoplossing geïnjecteerde controlemuizen (p <0,001, ongepaarde t-test). Na acute morfine, de nociceptieve respons van de chronische morfine behandelde groep aanzienlijk toegenomen, maar slechts licht nociceptieve de basale waarde van zoutoplossing geïnjecteerde controlemuizen gemeten bij 30 min in TIT en TPT (p <0,01 en p <0,05, ongepaarde t overschreden test, respectievelijk) en 60 min in TIT (p <0,05, ongepaarde t-test). Vanaf 2 uur na behandeling met morfine tot eind experiment nociceptieve respons terug naar lagere waarden dan die van controlemuizen (p<0,001, ongepaarde t-test).
Vergelijking van Maximum Analgetische Reacties van Muizen aan morfine voor (dag 0) en na chronische behandeling met morfine (Dag 7).
Nociceptieve drempelwaarden in Figuur 6 zijn afkomstig TIT (A) en TPT (B) uitgevoerd 30 minuten na zoutoplossing of morfine injectie zoals weergegeven in figuren 3 (dag 0) en 5 (dag 7). Een sterke afname van morfine analgesie werd waargenomen bij muizen na chronische behandeling met morfine gedurende 7 dagen in vergelijking met hun oorspronkelijke analgesie respons op dag 0 in nociceptieve test (p <0,001 gepaarde t-test). Deze gegevens tonen aan dat de tolerantie ontwikkelden pijn overgevoelig dieren.
Figuur 1. Een vijf-stap proprocedure aan morfine geïnduceerde hyperalgesie en tolerantie te controleren. Het protocol is verdeeld in vijf opeenvolgende stappen (AE) over een totale duur van 15 dagen.
. Figuur 2 Bepaling van de basale nociceptieve respons waarden (Stap B, d-4 tot d-1). De staart onderdompeling (TIT) (A) staart en druk (TPT) (B) tests worden gebruikt om de gehele reeks dieren teneinde de basale waarden nociceptieve evalueren. Daarna twee groepen muizen (n = 8), hierna "Saline" en "Morphine-groepen worden gedefinieerd dat ze vertonen stabiele en vergelijkbare gemiddelde nociceptieve waarden, ongeacht de nociceptieve modaliteit wordt beschouwd.
Figuur 3. Tijdsverloop voor morfine analgesie op dag 0 (stap C) TIT (A) en TPT (B). Denbsp nociceptieve respons waarde van muizen werd bepaald om de 30 minuten na enkele morfine (5 mg / kg, sc. ) of zoutoplossing injecties. Gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± SEM, n = 8 muizen per groep. * P <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001, ongepaarde t-test vergeleken met de controlegroep.
. Figuur 4 Ontwikkeling van hyperalgesie na herhaalde toediening van morfine (stap D; d1 tot d6). De basale nociceptieve waarde van muizen werd bepaald door TIT (A) en TPT (B) eenmaal daags voor morfine (5 mg / kg,sc.) of zoutoplossing administratie. Gegevens zijn uitgedrukt als gemiddelde waarden ± SEM, n = 8 muizen per groep. * P <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001 met ongepaarde t-test vergeleken met de met zoutoplossing behandelde controlegroep.
Figuur 5. Tijdsverloop voor morfine analgesie bij chronische morfine behandelde muizen op dag 7 (stap E) in TIT (A) en TPT (B). Muizen die chronisch behandeld met morfine (zwarte stippen) of zoutoplossing (witte driehoekjes) van dag 0 tot dag 6, ontvangen op dag 7 een enkele injectie van morfine (5 mg / kg, sc.) of zoutoplossing, respectievelijk. De nociceptieve reactie van muizen werd bepaald om de 30 minuten na morfine of zoutoplossing voor injectie. Gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± SEM, n = 8 muizen per groep. * P <0,05, ** P & #60; 0,01 door ongepaarde t-test vergeleken met de met zoutoplossing behandelde controlegroep. Error bars die niet hoger zijn dan symbolen grootte zijn verborgen.
Figuur 6. Vergelijking maximale analgetische responsen van muizen morfine (5 mg / kg, sc.) Voor (dag 0) en na chronische behandeling met morfine (dag 7). Hier vermelde waarden zijn van experimenten in figuur 3 en figuur 5. Nociceptieve waarden werden gemeten met TIT (A) en TPT (B) 30 minuten na morfine of zoutoplossing voor injectie. Gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± SEM, n = 8 muizen per groep. *** P <0,001 door gepaarde t-test.
Discussion
Kritische stappen
Keuze van het diermodel voor nociceptie metingen
Variabiliteit in nociceptieve en pijnstillende gevoeligheid bij muizen stammen is (reviews 14-16) Beoordelingen onderzocht met behulp van diverse pijn modellen verschillen in hun etiologie (nociceptieve, inflammatoire, neuropathische), modaliteit (thermische, chemische, mechanische), duur (acute, tonic, chronisch) en de plaats van toediening (cutane, subcutane, viscerale). In vergelijking met andere stammen, C57BL/6J ("J" voor Jackson Laboratory) muizen werd een populaire diermodel voor pijn studies als ze vertonen een hoge basale nociceptieve gevoeligheid 17,18 en een matige pijnstillende reactie op opiaten 14,19. Na chronische behandeling met morfine, ontwikkelen ze ook significante analgesietolerantie 20,21, hyperalgesie 21,22 en afhankelijkheid 20,23.
nt "> Hier werden experimenten uitgevoerd op C57BL/6N Tac muizen (" N "voor de Nationale Instituut voor Gezondheid en" Tac 'voor Taconics boerderij) die behoren tot een aparte tak van de B6 afkomst. Hoewel C57BL / 6 muizen al lang beschouwd als onderling verwisselbaar recente studies gewezen op aanzienlijke verschillen tussen gedrag C57BL/6J en C57BL/6N stammen 24. Vooral de lagere gevoeligheid van de drie C57BL/6N substammen (waaronder een Tac) thermische acute pijn kan worden beschouwd als een voordeel voor het testen van dit fenotype.Mannelijke muizen werden geselecteerd als de overgrote meerderheid van pijn, met behulp van muizen als diermodel worden uitgevoerd voor jonge mannen 25. In onze handen, op voorwaarde dat zij robuuste en reproduceerbare gegevens bij onderzoek van de analgesie of hyperalgesie standpunten. Af en toe zagen we een tendens voor C57BL/6N vrouwen om meer variabele antwoorden te geven, zowel in de TIT en TPT testen. Hoewel deze waarneming kanreflecteren natuurlijke variaties in verband met de hormonale status van de vrouwen, de totale onderliggende mechanismen van sekseverschillen in pijn en analgesie nog steeds een kwestie van controverse. Sommige aspecten van deze hete debat zal kort worden gepresenteerd in de volgende 'Beperkingen van de techniek' sectie.
Animal gewenning
Muizen werden voor het eerst toegestaan om te wennen aan het dier faciliteit krijgt gedurende een week. Net als andere gedragsonderzoek, werd testen uitgevoerd na een 3-daagse gewenningsperiode (Figuur 1, stap A). Zoals nociceptieve tests zijn gevoelig voor stress, kan eerst maatregelen langer latencies dan daaropvolgende degenen geven, vooral in niet-gewende muizen 26,27. De gewenning stap kunt ook het verkrijgen van meer stabiele nociceptieve respons waarden binnen dezelfde dag en tussen dagen figuren 2 en 4. Om circadiane effecten op nociceptieve en pijnstillende verminderengevoeligheid 28,29, werden alle keuringen uitgevoerd 10:00-04:00.
Selectie van nociceptieve proeven
Nociceptieve testen gebruikt u een thermische, mechanische, chemische of elektrische prikkels (beoordeling 26,27,30. Hun keuze is van cruciaal belang als verschillende nociceptive modaliteiten kan worden verwerkt via verschillende nociceptoren en vezels 18,31,32.
Wij selecteerden de staart dompeltest (TIT) 33, een aangepaste versie van de klassieke staart flick-test ontwikkeld door D'amour en Smith 34, en de staart druktest (TPT), overgenomen van Randall en Selitto 35, als voorbeelden van thermische en mechanische modaliteiten om morfine geïnduceerde analgesie, hyperalgesie en tolerantie studie bij muizen. Beide testen zijn op grote schaal gebruikt bij ratten. Een afgesneden tijd werd systematisch gesteld om te voorkomen of te beperken het risico op weefselbeschadiging.
Morfine-inductieed analgesie, hyperalgesie en tolerantie
Morfine, de prototypische mu-opiaat agonist, werd hier gekozen omdat het een krachtige pijnstillende en OIH-inductor, zowel bij mensen en muizen 1,2,36. Morfine analgetische vermogen bekend is te variëren met muizen stammen, toedieningswijzen en nociceptieve modaliteiten. In C57BL / 6 muizen, is betrouwbaar analgesie meestal verkregen na subcutane injecties van morfine in de 1-20 mg / kg dosisbereik 14,21. Daarom kozen we voor acute pijnbestrijding na een enkele toediening (sc) van morfine bij 5 mg / kg, dicht bij de ED 50-waarde (7-20 mg / kg) bij de beoordeling van thermische nociceptie 19,21 bestuderen.
Herhaalde morfine toediening vaak gepaard met analgetische tolerantie (al hetzij een verschuiving naar rechts van de dosis-responscurve of een afname analgetische respons amplitude en duur) en hyperalgesie (een verergerd gevoeligheid voor pijnlijke stimuli blijkt uit een daling van nociceptieve basale waarde). Beide nadelige verschijnselen afhankelijk knaagdierrassen, de aard van de opiaat verbinding die wordt gekozen en de dosis in behandelingsduur en nociceptieve modaliteiten 21. Bijvoorbeeld experimentele paradigma tolerantie en hyperalgesie bestuderen bestaan uit dagelijkse toediening van hoge en constante (20 tot 40 mg / kg per dag) 22 of escaleren (tot 50 of zelfs 200 mg / kg) 20,21 doses morfine. Daarom hebben we bevorderde de ontwikkeling van hyperalgesie en tolerantie in C57BL / 6 muizen door dagelijkse toediening van morfine (5 mg / kg, sc) gedurende 8 dagen. Deze matige dosis morfine werd de voorkeur boven hogeren om beter na te bootsen kliniek gebruik.
Opzetten van TIT operationele venster
Een mogelijke valkuil TIT kan worden gerelateerd aan de rol van de staart in de thermoregulatie knaagdieren 26,37. De omgevingstemperatuur is een belangrijke factor in nociceptive reactie variaties moet worden constant (hier bij 21 ° C) gedurende 38 experimenten bewaard. Warmte intensiteit wordt meestal opgezet om een nociceptieve reactie binnen 5 tot 10 sec 27 detecteren. Inderdaad, kan groter latencies het risico verhogen voor het toezicht op het vervoer van dieren die niets met de nociceptieve stimulus, terwijl kortere het differentieel kracht van de test kan verminderen. We voerden TIT metingen bij een vaste temperatuur van 48 ° C. Staart terugtrekking latenties waren bijna 9 sec (basale nociceptieve waarde) en varieerde van 4 sec (hyperalgesie) tot 25 sec (maximale analgesie; afgesneden). Naast praktische redenen, kan metingen van nociceptieve respons waarden bij een vaste temperatuur a priori gelden dezelfde repertoire van nociceptoren en circuits, waardoor data interpretatie te vergemakkelijken.
Eventuele wijzigingen
Optimalisatie van de TIT operationele venster voor analgesie en OIH metents
Bij het scherpstellen op een pijnstillende reactie, kan een lage uitgangswaarden (hogere warmte-intensiteit) de detectie van een vertraging in de respons te bevorderen. Op zijn beurt, het gevolg van een pijnlijke stimulus of de ontwikkeling van OIH hogere uitgangswaarden (lagere warmte-intensiteit, hier 48 ° C) te gaan kunnen de detectie van een snellere reactie vergemakkelijken Figuur 4.
Hoewel we vonden morfine bij 5 mg / kg een geschikte dosis voor een robuuste analgetische respons Figuur 3 induceren en bevorderen (na herhaalde toediening) significante hyperalgesie Figuur 4, kan de dosering worden aangepast zoals eerder vermeld (Critical stap: morfine-geïnduceerde analgesie, hyperalgesie en tolerantie). Bijvoorbeeld kunnen lagere doses worden gebruikt om analgesie amplitude (waarbij Uiterste beperkingen vermijden) te verminderen dat hogere doses worden gekozen om hyperalgesie begin versnellen en verhoging van de amplitude.
OveRall, optimalisatie van de 'nociceptieve venster' moet worden aangepast aan de genetische achtergrond van muizen bestudeerd en rekening houden met de mogelijkheid voor de betrokkenheid van de verschillende arrays van nociceptoren en circuits.
Alternatieve opiaatagonisten (fentanyl, remifentanyl)
Hoewel de meeste klinisch gebruikte opiaten richten op de mu-opioïde receptor agonisten, die sterk verschillen wat betreft hun farmacologische eigenschappen zowel in vitro als in vivo. Bijvoorbeeld, remifentanyl en fentanyl, in schril contrast met morfine, gedragen zich als volwaardige agonisten en het bevorderen van internalisering van mu-opioïde receptoren 39. Opiaat analgetica zoals morfine en fentanyl halveringstijden in het bereik van 40 uur, terwijl remifentanyl heeft een ultra-korte halfwaardetijd van enkele minuten 41. Bij mensen, beste bewijs voor OIH is van patiënten die opiaten kregen tijdens de operatie, met inbegrip van kortwerkende compounds zoals remifentanyl 2,42. Aldus kan fentanyl en remifentanyl waardevolle instrumenten te zijn om de ontwikkeling van hyperalgesie en tolerantie bij muizen te bestuderen, onder TIT en TPT paradigma.
Alternatieve wijzen van inductie van OIH (chronische versus acute toediening)
OIH wordt gezien bij mensen en diermodellen als gevolg van opiaat toediening, hetzij bij zeer lage of zeer hoge doseringen 1,2. Wij rapporteren hier op OIH ontwikkeling na chronische behandeling van muizen met een matige doses morfine. Enkele dagen van de behandeling van C57BL/6N muizen waren noodzakelijk om een duidelijke en reproduceerbare hyperalgetische staat Figuur 4 Daily morfine-injecties kon adequaat worden vervangen door geïmplanteerde morfine pellets bewijs:. Op hun verwijdering, zowel thermische hyperalgesie en mechanische allodynie zijn reeds gemeld in muizen 43. Infusie van opiaten door een micro-osmotische pomp andere mogelijkheid 44. Bij knaagdieren langdurige hyperalgesie is ook haalbaar na acute toediening van fentanyl volgens een protocol nabootsen het gebruik van deze mu-opioïde agonist in humane chirurgie 36,45,46.
Beperkingen van de Techniek
Diersoorten en modellen voor pijn
Vergelijkende studies van talrijke muisspanningen leverde bewijs voor grote variaties in nociceptieve reacties op pijnlijke stimuli 17,31,47 en in OIH niveaus na 4 dagen behandeling met morfine 22. Of onderliggende mechanismen van pijn verwerking en modulatie in diermodellen (muizen en ratten) die relevant zijn voor patiënten met chronische pijn zijn blijft een fundamentele en opende vraag. Daarom moet veel voorzichtigheid worden besteed aan de interpretatie van gegevens over dieren en hun voorspellende waarde voor de mens 16.
Sekseverschillen in pijn en analgesie
ntent "> Meest preklinische studies op diermodellen voor pijn zijn uitgevoerd op mannelijke knaagdieren 16,25,48. Ondanks deze selectie bias, de opkomende uitzicht was om mannen te beschouwen als beter responders opiaatanalgetica 49,50, minder vatbaar voor opioïde ontwikkelen geïnduceerde hyperalgesie 51,52 en meer tolerant aan morfine analgesie 53 dan hun vrouwelijke tegenhangers (overzicht 54). Echter, sekseverschillen met betrekking tot nociceptie en pijnstillers werkzaamheid niet te hervatten in een dergelijke 'een one size fits all' paradigma. Inderdaad, een schat aan gegevens blijkt nu dat vele variabelen de grootte en richting van geslacht verschillen zoals opioïde geneesmiddel-effectiviteit en selectiviteit, nociceptieve test genetische achtergrond, leeftijd, gonado-hormonale status of sociale interactie 48,54 beïnvloeden. Bij mensen klinische pijn komt vaker voor bij vrouwen, maar of dit feit geeft over het actuele sekseverschillen een kwestie van debat 48,55,56 blijft. For bijvoorbeeld globale analyse van vijftig klinische studies gaf aan dat er geen significante verschillen in pijnstillende eigenschappen tussen de seksen terwijl meta-analyses uitgevoerd op patiënten-gecontroleerde subjecten wees op een significant grotere opioïde werkzaamheid bij vrouwen 57. Deze laatste observatie, die sterk contrasteert met wat is geweest gevonden bij knaagdieren, weer roept een aantal vragen over de herkomst van dergelijke verschillen 16,48,55,57. Al met al, sekseverschillen in analgesie bestaan en verdienste verder richten op de onderliggende mechanismen en de klinische implicaties.Over nociceptieve testen
De staart terugtrekking test is een spinale reflex, maar het kan worden onderworpen aan supraspinale invloeden 58. TIT is relatief eenvoudig uit te voeren bij ratten, maar vereist meer deskundigheid in muizen. Een potentiële moeilijkheid is om de muis in een correcte houding te handhaven zonder het induceren van ongewenste stress. De voorgestelde protocol kan worden aangepast aan decohort grootte. 16 dieren (8 controle en 8 behandeld) zijn gemakkelijk zover meting van hun basale nociceptieve respons waarden (gebruik TIT eerst, dan TPT voor de hele reeks van muizen) is onder zorg beheerd. Monitoring analgesie time opleidingen voorziet in de oprichting van een precies tijdschema en de evaluatie van het maximale aantal dieren dat mag worden getest (TIT eerst, dan TPT) binnen de bijgebracht tijdsinterval (hier 30 min). De gehele cohort dieren kunnen aldus worden onderverdeeld in subgroepen om de experimentator in kinetische beperkingen ter.
Betekenis van de techniek met betrekking tot bestaande / alternatieve methoden
OIH bij ratten versus muis
Ratten zijn uitgebreid gebruikt om opioïde analgesie, hyperalgesie en tolerantie te bestuderen, na een acute of chronische opiaat toediening 46,59-61. Inderdaad, voor verschillende praktische redenen, kunnen worden beschouwd superieurmuizen als diermodel voor pijn experimenten 16,61. Tot voor kort, het genereren van genetisch gemodificeerde ratten geen eenvoudige procedure. Zo talrijk genetisch gemodifieerde muizen zijn reeds beschikbaar, ons model biedt de mogelijkheid om de bijdrage van een groot aantal individuele genen in OIH en tolerantie ontwikkeling in muizen te bestuderen.
MEES en TPT versus andere nociceptieve testen
TIT is een variant van de tail flick test de duidelijkste verschil is het gebied van stimulatie. In tegenstelling stralingswarmte, onderdompeling van de staart in heet water leidt tot een snelle en gelijkmatige verhoging van de temperatuur. In vergelijking met andere vormen van thermische nociceptie testen (hot-plaat of Hargreaves testen), TIT biedt redelijk reproduceerbare resultaten, zowel tussen en binnen vakken.
TPT is een zeer populaire test voor de studie van mechanische nociceptie 26,27,35 die waarschijnlijk gaatonderscheiden nociceptieve vezels en moleculaire transducers vervolgens TIT 32. Het biedt een snelle en betrouwbare metingen 59, maar vereist enige kennis van de experimentator en groot dier cohorten. Als alternatief voor de analgesimeter gebruikt in de onderhavige studie, andere procedures of apparatuur vertrouwen op rekstrookjes bestaan (beoordeling 27). TPT is het meest geschikt voor het bestuderen van de mechanische hyperalgesie terwijl von Frey filamenten meestal worden genomen om mechanische allodynie (beoordeling 27) te evalueren.
Toekomstige toepassingen of Routebeschrijving Na het beheersen van deze techniek
De experimentele OIH / Tolerance hier geïntroduceerde kunnen op soortgelijke wijze worden aangepast om genetisch gemodificeerde muizen om de rol van individuele genen in de modulatie van pijn te evalueren. Het biedt ook een modelsysteem om de effectiviteit van mogelijke therapeutische middelen te onderzoeken om chronische pijn te verlichten.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Wij danken dr. JL. Galzi (UMR7242 CNRS, Illkirch, Frankrijk) voor zijn steun.
Dit werk werd ondersteund door de CNRS, INSERM, Universite de Strasbourg, Elzas BioValley en door subsidies van Conectus, Agence Nationale de la Recherche (ANR 08 Ebio 014.02) Conseil Regional d'Alsace (Pharmadol), Communaute Urbaine de Strasbourg (Pharmadol), ICFRC (Pharmadol), OSEO (Pharmadol), Direction Generale des Entreprises (Pharmadol).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6N Tac mice | Taconic, Ry, Denmark | C57BL/6N Tac B6-M | Male mice (25-30 g) |
| Morphine hydrochloride | Francopia, Paris, France | CAS no. 52-26-6 | Delivered with special authorization |
| Syringes (Terumo) | Dutscher, Brumath, France | 050000 | Polypropylene, sterile, volume: 1 ml |
| Needles (Terumo) | Dutscher, Brumath, France | 050101 | 26 G ½ (Terumo reference : NN2613RO1) |
| Mouse restrainer | Home-made | Two metallic grids (5 x 11 cm) assembled with adhesive tape and staples | |
| Thermostated water bath GR150 | Grant Instruments, Cambridge, UK | GP 0540003 | |
| Analgesimeter | Panlab, Barcelona, Spain | LE 7306 | |
| Kaleidagraph software | Synergy software, Reading, PA, USA | Kaleidagraph 4.03 | Scientific graphing |
| STATview software | Free download, statistics |
References
- Angst, M. S., Clark, J. D. Opioid-induced hyperalgesia. A qualitative systematic review. Anesthesiology. 104, 570-587 (2006).
- Chu, L. F., Angst, M. S., Clark, D. Opioid-induced hyperalgesia in humans. Molecular mechanisms and clinical considerations. Clin. J. Pain. 24, 479-496 (2008).
- Lee, M., Silverman, S., Hansen, H., Patel, V., Manchikanti, L. A comprehensive review of opioid-induced hyperalgesia. Pain Physician. 14, 145-161 (2011).
- Hutchinson, M. R., Shavit, Y., Grace, P. M., Rice, K. C., Maier, S. F., Watkins, L. R. Exploring the neuroimmunopharmacology of opioids: An integrative review of mechanisms of central immune signaling and their implications for opioid analgesia. Pharmacol. Rev. 63, 772-810 (2011).
- Wang, X., et al. Morphine activates neuroinflammation in a manner parallel to endotoxin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109, 6325-6330 (2012).
- Colpaert, F. C. System theory of pain and of opiate analgesia: No tolerance to opiates. Pharmacol. Rev. 48, 355-402 (1996).
- Simonnet, G., Rivat, C. Opioid-induced hyperalgesia: abnormal or normal pain. NeuroReport. 14, 1-7 (2003).
- Mao, J., Sung, B., Ji, R. R., Lim, G. Chronic morphine induces downregulation of spinal glutamate transporters: implications in morphine tolerance and abnormal pain sensitivity. J. Neurosci. 22, 8312-8323 (2002).
- King, T., Ossipov, M. H., Vanderah, T. W., Porreca, F., Lai, J. Is paradoxical pain induced by sustained opioid exposure an underlying mechanism of opioid antinociceptive tolerance. Neurosignals. 14, 194-205 (2005).
- DuPen, A., Shen, D., Ersek, M. Mechanisms of opioid-induced tolerance and hyperalgesia. Pain Management Nursing. 8, 113-121 (2007).
- Chu, L. F., et al. Analgesic tolerance without demonstrable opioid-induced hyperalgesia : A double-blinded, randomized, placebo-controlled trial of sustained-release morphine for treatment of chronic nonradicular low-back. 153, 1583-1592 (2012).
- Ferrini, F., et al. Morphine hyperalgesia gated through microglia-mediated disruption of neuronal Cl- homeostasis. Nature Neurosci. 16, 183-192 (2013).
- Zimmermann, M. Ethical guidelines for investigation of experimental pain in conscious animals. Pain. 16, 109-110 (1983).
- Mogil, J. S. The genetic mediation of individual differences in sensitivity to pain and its inhibition. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96, 7744-7751 (1999).
- Mogil, J. S., et al. Screening for pain phenotypes : Analysis of three congenic mouse strains on a battery of nine nociceptive tests. Pain. 126, 24-34 (2006).
- Mogil, J. S. Animal models of pain : progress and challenges. Nature Rev. Neurosci. 10, 283-294 (2009).
- Mogil, J. S., et al. Heritability of nociception I : Responses of 11 inbred mouse strains on 12 measures of nociception. Pain. 80, 67-82 (1999).
- Larivière, W. R., et al. Heritability of nociception. III. Genetic relationships among commonly used assays of nociception and hypersensitivity. Pain. 97, 75-86 (2002).
- Elmer, G. I., Pieper, J. O., Negus, S. S., Woods, J. H. Genetic variance in nociception and its relationship to the potency of morphine-induced analgesia in thermal and chemical tests. Pain. 75, 129-140 (1998).
- Eidelberg, E., Erspamer, R., Kreinick, C. J., Harris, J. Genetically determined differences in the effects of morphine on mice. Eur. J. Pharmacol. 32, 329-336 (1975).
- Kest, B., Hopkins, E., Palmese, C. A., Adler, M., Mogil, J. S. Genetic variation in morphine analgesic tolerance: A survey of 11 inbred mouse strains. Pharmacol. Biochem. Behav. 73, 821-828 (2002).
- Liang, D. -Y., Liao, G., Wang, J., Usuka, J., Guo, Y., Peltz, G., Clark, J. D. A genetic analysis of opioid-induced hyperalgesia in mice. Anesthesiology. 104, 1054-1062 (2006).
- Kest, B., Palmese, C. A., Hopkins, E., Adler, M., Juni, A., Mogil, J. S. Naloxone-precipitated withdrawal jumping in 11 inbred mouse strains : Evidence for common genetic mechanisms in acute and chronic morphine physical dependence. Neurosci. 115, 463-469 (2002).
- Bryant, C. D., et al. Behavioral differences among C57BL/6 substrains: Implications for transgenic and knockout studies. J. Neurogenet. 22, 315-331 (2008).
- Mogil, J. S., Chanda, M. L. The case for the inclusion of female subjects in basic science studies of pain. Pain. 117, 1-5 (2005).
- Le Bars, D., Gozariu, M., Cadden, S. W. Animal models of nociception. Pharm. Rev. 53, 597-652 (2001).
- Barrot, M. Tests and models of nociception and pain in rodents. Neurosci. 211, 39-50 (2012).
- Kavaliers, M., Hirst, M. Daily rythms of analgesia in mice: effects of age and photoperiod. Brain Res. 279, 387-393 (1983).
- Castellano, C., Puglisi-Allegra, S., Renzi, P., Oliverio, A. Genetic differences in daily rhythms of pain sensivity in mice. Pharmacol. Biochem., and Behavior. 23, 91-92 (1985).
- Sandkühler, J. Models and mechanisms of hyperalgesia and allodynia. Physiol. Rev. 89, 707-758 (2009).
- Mogil, J. S., et al. Heritability of nociception II. ‘Types’ of nociception revealed by genetic correlation analysis. Pain. 80, 83-93 (1999).
- Scherrer, G., et al. Dissociation of the opioid receptor mechanisms that control mechanical and heat. 137, 1148-1159 (2009).
- Janssen, P. A. J., Niemegeers, C. J. E., Dony, J. G. H. The inhibitory effect of fentanyl and other morphine-like analgesics on the warm water induced tail withdrawal reflex. Arzneimittelforsch. 13, 502-507 (1963).
- Amour, F. E., Smith, D. L. A method for determining loss of pain sensation. J. Pharmacol. Exp. Ther. 72, 74-79 (1941).
- Randall, L. O., Selitto, J. J. A method for measurement of analgesic activity on inflamed tissue. Arch. Int. Pharmacodyn. Ther. 111, 409-419 (1957).
- Elhabazi, K., et al. Involvement of neuropeptides FF receptors in neuroadaptative responses to acute and chronic opiate treatments. Br. J. Pharmacol. 165, 424-435 (2012).
- Berge, O. -G., Garcia-Cabrera, I., Hole, K. Response latencies in the tail-flick test depend on tail skin temperature. Neurosci. Lett. 86, 284-288 (1988).
- Benoist, J. -M., Pincedé, I., Ballantyne, K., Plaghi, L., Le Bars, D. Peripheral and central determinants of a nociceptive reaction: An approach to psychophysics in the rat. PLoS ONE. 3, e3125 (2008).
- Morgan, M. M., Christie, M. J. Analysis of opioid efficacy, tolerance, addiction and dependence from cell culture to human. Br. J. Pharmacol. 164, 1322-1334 (2011).
- Trescot, A. M., Datta, S., Lee, M., Hansen, H. Opioid pharmacology. Pain Physician. 11, S133-S153 (2008).
- Egan, T. D., et al. The pharmacokinetics of the new short-acting opioid remifentanil (GI87084B) in healthy adult male volunteers. Anesthesiology. 79, 881-892 (1993).
- Hansen, E. G., Duedahl, T. H., Rømsing, J., Hilsted, K. L., Dahl, J. B. Intra-operative remifentanil might influence pain levels in the immediate post-operative period after major abdominal surgery. Acta Anaesthesiol Scand. 49, 1464-1470 (2005).
- Li, X., Angst, M. S., Clark, J. D. A murine model of opioid-induced hyperalgesia. Mol. Brain Res. 86, 56-62 (2001).
- Varnado-Rhodes, Y., Gunther, J., Terman, G. W., Chavkin, C. Mu opioid analgesia and analgesic tolerance in two mouse strains. C57BL/6 and 129/SvJ. Proc. West Pharmacol. Soc. 43, 15-17 (2000).
- Celerier, E., et al. Long-lasting hyperalgesia induced by fentanyl in rats: preventive effect of ketamine. Anesthesiology. 92, 465-472 (2000).
- Celerier, E., Simonnet, G., Maldonado, R. Prevention of fentanyl-induced delayed pronociceptive effects in mice lacking the protein kinase C gamma gene. Neuropharmacol. 46, 264-272 (2004).
- Larivière, W. R., Chesler, E. J., Mogil, J. S. Transgenic studies of pain and analgesia: Mutation or background phenotype. J. Pharmacol. Exp. Ther. 297, 467-473 (2001).
- Mogil, J. S. Sex differences in pain and pain inhibition: multiple explanations of a controversial phenomenon. Nature Rev. Neurosci. 13, 859-866 (2012).
- Kest, B., Wilson, S. G., Mogil, J. S. Sex differences in supraspinal morphine analgesia are dependent on genotype. J. Pharmacol. Exp. Ther. 289, 1370-1375 (1999).
- Kest, B., Sarton, E., Dahan, A. Gender differences in opioid-mediated analgesia. Anesthesiology. 93, 539-547 (2000).
- Holtman, J. R., Wala, E. P. Characterization of morphine-induced hyperalgesia in male and female rats. Pain. 114, 62-70 (2005).
- Juni, A., et al. Sex differences in hyperalgesia during morphine infusion: effect of gonadectomy and estrogen treatment. Neuropharmacol. 54, 1264-1270 (2008).
- Craft, R. M., et al. Sex differences in development of morphine tolerance and dependence in the rat. Psychopharmacol. 143, 1-7 (1999).
- Bodnar, R. J., Kest, B. Sex differences in opioid analgesia, hyperalgesia, tolerance and withdrawal: central mechanisms of action and roles of gonadal hormones. Hormones Behav. 58, 72-81 (2010).
- Greenspan, J. D., et al. Studying sex and gender differences in pain and analgesia: A consensus report. Pain. 132, S26-S45 (2007).
- Fillingim, R. B., Ness, T. J. Sex-related hormonal influences on pain and analgesic responses. Neurosci. Biobehav. Rev. 24, 485-501 (2000).
- Niesters, M., et al. Do sex differences exist in opioid analgesia? A systematic review and meta-analysis of human experimental and clinical studies. Pain. 151, 61-68 (2010).
- Millan, M. J. Descending control of pain. Prog. Neurobiol. 66, 355-474 (2002).
- Celerier, E., Laulin, J. -P., Corcuff, J. -B., Le Moal, M., Simonnet, G. Progressive enhancement of delayed hyperalgesia induced by repeated heroin administration : A sensitization process. J. Neurosci. 21, 4074-4080 (2001).
- Simonin, F., et al. RF9, a potent and selective neuropeptide FF receptor antagonist, prevents opioid-induced tolerance associated with hyperalgesia. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 466-471 (2006).
- Wilson, S. G., Mogil, J. S. Measuring pain in the (knockout) mouse: big challenges in a small mammal. Behav. Brain Res. 125, 65-73 (2001).
