Summary
우리는 아편 유발 통각 과민과 생쥐의 관용의 개발을 검토하는 프로토콜을 설명합니다. 순진과 모르핀 처리 된 동물의 열 및 기계적 통각 반응의 측정을 바탕으로, 그것은 고통의 감도 (통각 과민)의 증가를 정량화 및 만성 아편 관리와 관련된 진통제 (허용 오차)이 감소 할 수 있습니다.
Abstract
아편 유발 통각 과민과 허용 오차는 심각하게 동물과 인간의 진통제로 약물의 임상 효능에 영향을 미칠. 두 현상의 근간이되는 분자 메커니즘이 잘 이해되지 않고 자신의 해명이 동물 모델의 연구에서 적절한 실험 프로토콜의 설계에서 수혜가 예상된다.
우리는 여기에서, 유도 기록하고 야생형 생쥐의 꼬리 침수와 꼬리 압력 테스트를 사용하여, 진통제 내성을 증명뿐만 아니라 모르핀에 의한 통각 과민을 정량화하기위한 방법 론적 접근 방식을 설명합니다. 영상에 도시 된 바와 같이, 프로토콜은 오 순차 단계로 분할된다. 취급 및 습관화 단계는 동물의 기초 통각 반응의 안전한 결정을 할 수 있습니다. 모두 열 및 기계적 감도의 증가로 같이 만성 모르핀의 투여는 상당한 통각 과민을 유도하는 반면, 후 진통 시간 과정의 비교 급성 또는 담당자어갈 모르핀 치료는 분명 진통 응답 진폭의 감소에 의해 각성 관용의 개발을 나타냅니다. 이 프로토콜은 마찬가지로 통각 모르핀 진통제의 변조의 개별 유전자의 역할을 평가하기 위해 유전자 변형 마우스에 적응 될 수있다. 또한 아편 진통 효능을 향상시키는 잠재적 인 치료제의 효과를 조사하기 위해 모델 시스템을 제공한다.
Introduction
아편 유발 통각 과민 (OIH) 및 진통 허용 오차는 동물과 인간 1-3 약물의 임상 적 효능을 제한 할 수 있습니다. 염증성 4,5 또는 프로 통각 (안티 아편) 6,7 시스템의 참여는 현재 가설을 탐구하고 있습니다. OIH 관용 근본적인 메커니즘의 해명은 적절한 동물 모델 실험 프로토콜 및 분자 도구를 사용하여 생체 내 및 생체 외 접근법에서의 조합을 필요로한다.
행동 약리학 실험실 동물의 진통과 hyperalgesic 상태를 모니터링하고 정량화하는 지배적 인 패러다임 (쥐, 마우스)입니다. 동물의 편리한 본체 부품 (뒷발, 꼬리)에 유해 자극 (열 기계 또는 화학 물질)의 응용 프로그램을 쉽게 획득 할 수있는 nocifensive 철수로 연결됩니다.
우리는 OIH을 유도 기록하고 정량화 여기에 방법 론적 접근 방식을 제안하고꼬리 침수와 꼬리 압력 테스트를 사용하여 야생형 생쥐의 허용 오차. 절차는 마우스에서 열 및 기계적 통각 응답 값의 쉬운 민감하고 재현성있는 측정을 허용한다. 비디오 프로토콜에서와 같이, C57BL / 6 마우스는 만성 모르핀 투여 중요한 통각 과민을 경험하고 몇 일 동안이를 유지한다. 모두 열 및 기계적 통각 값은 상당히 순진 동물에 대한 기준 측정에 비해 감소된다. 또한, 우리의 실험 장치는 OIH, 모르핀 (허용 오차)에 진통 응답의 감소의 개발뿐만 아니라, 모니터링 할 수 있습니다. 발표 자료는이이 문학 1,10-12에 이의를 제기하고 있지만 통각 과민과 관용, 일반 세포와 분자 메커니즘 8,9를 포함 할 수 있다는 견해를 지원합니다. 마지막으로,이 프로토콜은 유사 모듈라 개별 유전자의 역할을 평가하기 위해 유전자 변형 마우스에 적응 될 수있다고통의 기. 또한 아편 진통 효과를 향상시키기 위해 잠재적 치료제의 효과를 평가하기위한 모델 시스템을 제공한다.
Protocol
모든 실험은 실험 동물 (유럽 공동체위원회 지침 86/609/ECC) 및 의식 동물 13 실험 고통의 조사를 위해 윤리 지침의 치료에 대한 유럽 지침에 따라 엄격하게 실시 하였다. 남성 C57BL6 / N 사탕 마우스 (10 주, 25-30그램)가 환경 기준을 준수하는 시설을 운영 담당 관리 직원과 기관 동물 시설에 보관 하였다. 동물 그룹에 보관 된 음식과 물에 자유롭게 접근 할 수있는 일정한 온도 (21 ± 1 ° C)에서 12 시간 / 12 시간 빛 / 어둠주기에 따라 (케이지 당 최대 다섯 마우스). 모든 실험은 16 생쥐의 코호트를 이용하여 하루의 같은 기간 (오전 10시에서 오후 4시까지)에서 수행 하였다. 특정 재료 및 장비는 재료 표에 표시됩니다.
모르핀 - 유도 된 통각 과민 및 내성을 모니터링하는 5 단계 절차
프로토콜은십오 일 그림 1의 기간에 걸쳐 다섯 순차적 단계 (AE)로 구분.
. 처리 한 마우스 (단계를, D-12 D-5)
- 마우스를 처리하고 자유롭게 제한 수단에 입력을 길들. 따라서 스트레스에 의한 진통과 혼란을 최소화 - -이 예비 단계는 스트레스를 줄이고 동물 마우스 제한 수단으로 취급 및 조작, 조사에 익숙 할 수 있습니다. 각 마우스가 부드럽게 매일 5 분 동안 처리됩니다.
.이 기저 침해 수용성 응답 (단계 B, D-1 내지 D-4)
- 꼬리 집중 테스트 (TIT)를 사용하여 꼬리 탈퇴 대기 시간을 측정 :
- 48 ° C로 온도를 설정
- 조심스럽게 제한 수단에 마우스를 소개합니다. 물을 욕조에 꼬리의 돌출 2 / 3 끝을 담그고 크로노 미터를 시작합니다.
- 즉시 마우스가 뜨거운 물에서 꼬리를 철회 등의 크로노 미터를 중지하고 (초 단위) 대기 시간을 기록. 일에어떤 통각 반응의 전자 부재는, 25 초 차단은 조직 손상을 방지하기 위해 사용된다.
- 그 새장에 마우스를 교체하고 시리즈가 끝날 때까지 다음을 테스트합니다.
- 같은 순서로 동물에서 측정을, 통각 반응 측정을 두 번 더 반복합니다. 각 마우스에 대한 통각 응답 대기 시간 (초)은 세 개의 연속적인 결정에 대한 평균값으로 결정된다.
- 꼬리 압력 테스트 (TPT)을 사용하여 기계적인 반응을 측정
- 조심스럽게 제한 수단에 마우스를 소개하고 analgesimeter의 원뿔 곡선 (이차 곡선) 끝에서 꼬리를 놓습니다.
- 첫 번째 통각 반응 (어려움을 겪고, 꽉)가 발생할 때까지 꼬리의 근위 부분에 균일하게 증가 압력을 적용하는 풋 스위치를 누르십시오. 동물이 반응하는 순간, 통각 반응을 이끌어 (그램) 현재의 힘을 기록한다. 모든 반응의 부재에서, 600g 컷오프 값 t를 피하기 위해 사용된다손상을 실행합니다.
- 같은 마우스의 꼬리의 중간 및 말단 부분에이 조치를 반복합니다. 적어도 30 초의 간격은 적응 또는 스트레스 바이어스를 피하기 위해 주어진 마우스 대책 사이에서 관찰된다. 그 새장에 마우스를 교체하고 시리즈 (즉, 모든 쥐가 테스트)이 끝날 때까지 다음 동물을 테스트합니다. 각 마우스의 통각 값 (그램) 세 가지 측정 (즉, 근위, 중앙과 각 동물의 꼬리의 말단 부분)의 평균 값으로한다.
- 이후의 일에 반복 통각 검사 (모든 절차가 2 단계에서 설명), D-3 D-1.
. 모르핀 진통제의 3 측정 (단계 C, D0)
- 안정과 비교 평균 통각 값이 마우스의 두 그룹 (그룹 당 N = 8), 어느 통각 양상 (TIT 또는 TPT)의 선택을 고려할 수 있습니다 동물의 최상의 조합을 정의합니다. 이 값을 기초로 수행 될미래의 '살리'와 '몰핀'그룹에 대한 기준의 통각 반응.
- 각 동물의 체중을 측정한다.
- 피하 투여 (동물의 체중 kg 당 5 mg의 모르핀)에 대한 멸균 생리 식염수 (염화나트륨 0.9 %)에서 모르핀 용액 (ML 당 0.5 mg의 모르핀)을 준비합니다.
- 모두 '생리 식염수'와 TIT있는 '몰핀'그룹 (이상 2.1 이하의 모든 단계)의 각 마우스에 (시점 0으로한다) 통각 응답 대기 시간을 측정한다. 그런 다음 TPT에서 (위의 2.2에서 모든 단계를) 통각을 측정합니다.
- 각각 '모르핀'과 '생리'그룹에 피하 모르핀 (25g의 마우스 체중 당 0.5 ㎎ / ㎖ 모르핀 솔루션의 일반적으로 0.25 ㎖), 식염수 (25g 마우스 중량 당 0.25 ㎖)에 주입한다.
- 시간 과정을 통해 TIT 및 TPT에 통각 값 (아래 위에서 설명한 모든 절차는 각각 2.1 및 2.2 단계) (측정 30 분 간격에의알이) 모르핀을 평가 (5 ㎎ / ㎏)에 의한 진통 :
- 30 분 후 분사 후 TIT 다음 TPT를 사용하여, '살리'및 '모르핀'그룹의 각 마우스에 대한 통각 반응 (단일 결정)를 측정한다.
- 1-1.5-2-2.5-3 및 3.5 포스트 분사 : 그런 (시간의) 시점에 모든 생쥐의 통각 반응 값 (TIT 및 TPT)를 측정한다.
4 만성 모르핀 치료 - 통각 과민 모르핀 유도. (단계 D, D6에 D1)
- 날 : D1
- (2.1 및 2.2 단계) 상술 한 바와 같이 TIT 및 TPT에서 통각 반응 값을 측정한다. 조심스럽게 탈퇴 대기 시간과 각 동물에 대한 압력 제한을 주석.
- 단계 3.2에 설명 된대로 새로운 모르핀 솔루션을 준비합니다.
- '생리 식염수'그룹 전체 '모르핀'그룹과 생리 식염수 (25g 마우스 중량 당 0.25 ㎖)을 피하 모르핀 (5 ㎎ / ㎏ BW)를 주입한다. 하자 일전자의 동물은 다음 날까지 휴식.
- 일에 : D2, D3, D4, D5 및 4.1 절에 설명 된 작업을 반복 D6
. 진통제 공차를위한 5 증거 (단계 E, D7)
- 이미 3 장에서 설명 된 시간 코스의 패러다임에 따라 모르핀 유발 진통제를 평가합니다.
6. 데이터 수집 및 통계 분석
- 기저 침해 수용성 응답 값의 평가 (단계 B)
- 각 날짜에 대해 계산 (이상 D-4 D-1 기간) SEM 값 평균 ± (N = 8) '식염수'과 '모르핀'그룹 내에서 TIT 및 TPT에서 여유로 기초 통각 응답.
- 두 그룹은 그림 2에 플롯 시간 (일)의 함수로 기저 통각 값을 의미한다.
- 일의 D0에서 모르핀의 진통 시간 코스의 분석 (단계 C) 및 D7 (단계 E)
- 모르핀 후 각 시점에서 계산주입, SEM 값 평균 ± (N = 8) 각 그룹 (SEC에) TIT에서 여유와 TPT (g 단위)으로 통각 응답.
- 플롯은 하루에 '생리 식염수'과 '모르핀'그룹에 대한 시간의 함수 0 그림 3과 7 일째 그림 5와 같은 통각 응답 값을 의미한다.
- 모르핀 - 유도 된 통각 과민 (단계 D)의 개발
- (D0-D7 치료 기간 동안) 각 날짜에 대해 계산 SEM 값 평균 ± (N = 8) '생리 식염수 처리'와 '모르핀 치료'그룹 내에서 TIT 및 TPT에서 여유로 기초 통각 응답 값.
- 플롯은 '생리 식염수 처리'와 '모르핀 처리'그룹 그림 4 시간 (일)의 함수로 기저 통각 응답 값을 의미한다.
- 진통제 공차에 대한 증거 (단계 C와 E)
- 모르핀 시간 코스 전자에서 결정xperiment는 D0 도표 3 최대 진통 반응을 유도하기 위하여 모르핀 필요한 시간 값 (또는 시간의 범위)에서 수행.
- 기준 시간은 D7 그림 5에서 추정으로 (보통 30 분)이 값을 통각 기준 값 (생리 식염수 처리 군)과 급성 모르핀의 실제 진통 응답 (모르핀 치료 그룹).
- 히스토그램은 그림 6과 같이 시점 식염수 처리 및 모르핀 치료 그룹 D0 및 D7에서 수행 모르핀 시간 코스 실험에서 30 분에 찍은 통각 값이 제시되어있다.
- 통계 : 편도 반복 측정 ANOVA를 사용하여 데이터를 분석 할 수 있습니다. 변화의 요인은 (주제 사이의) 치료 (주제 이내) 시간이었다. 각 그룹에서 개별적으로 차이를 확인하려면, 반복 측정 분산 분석을 수행 하였다. 두 그룹 간의 비교는 짝이 t-검정 또는 쌍 t-검정 적절한를 사용하여 수행 하였다.
- 유의 수준은 P <0.05로 설정된다. 모든 통계 분석은 STATview 소프트웨어를 사용하여 수행됩니다.
Representative Results
나이브 마우스의 기초 침해 수용성 값의 평가 (단계 B)
TIT 및 TPT 순차 평균 통각 응답 값을 제공하고, 전체 마우스의 코호트 (N = 16)에인가 하였다. 동물의 최고의 조합이 허용 된 두 그룹 (N = 8) 마우스의 유사하고 안정적인 기초 통각 값을 표시 식염수와 모르핀은, 그림 2라고도합니다. 두 그룹의 동등성은 어떤 통각 검사 유효 (의 사후 정의 TIT : 그림 2A, TPT : 선택한 그림 2B).
0 일에서 모르핀의 진통 시간 코스 (단계 C)
모르핀의 진통은 TIT 그림 3A 및 TPT 그림 (b)를 모두 사용하여 순진 생쥐에서 모르핀의 단일 주사 (SC) (5 ㎎ / ㎏) 다음과 같은 평가 하였다. 한 방향으로 반복 측정 ANOVA의 revea와 두 테스트, 통계 분석에서TIT에 대한 치료와 시간 사이에 상당한 상호 작용이 있음을 L (F (7, 98) 72, P <0.001 =) 및 TPT (F (7, 98) = 31, P <0.001). TIT 및 TPT 데이터는 ANOVA는 (p> 0.05, F (12, 49) = 0.49) 식염수 주입의 영향이 없다는 것을 나타내고 F (12, 49) = 1.85, P> 0.05 각각 TIT 및 TPT 반복 측정을 사용하여 분석 테스트), 모르핀 주사) TIT 및 TPT 테스트를 위해 각각 강한 쥐 진통제 (F (7, 49) = 92.46, P <0.001), F (7, 49) = 34.37, P <0.001을 유도하는 반면. 모르핀의 최대 진통 효과가 TIT에서 30 분 후 식염수를 주입 제어 (P <0.001, 짝이 t-검정)에 비해 TPT에서 60 분 후에 도달했다.
마우스의 반복 모르핀 주관청 유도 통각 과민 (단계 D)
기초 통각 값은 매일 측정생리 식염수 또는 모르핀 투여하기 전에 (프로토콜 참조). 및 기계류 (F (,도 4에 도시 된 바와 같이, 6 일 치료 기간에 걸쳐 하루에 한 번씩 모르핀 투여는 중요하고 진보적 열적 저하 (도 4a F (12, 56) = 11.6, p <0.001, 반복 측정 ANOVA)을 유도 그림 4B) 기초 통각 값, 7,56) 15,55, P <0.001, 반복 측정 ANOVA를 =. 통각 과민은 (생리 식염수 주입 컨트롤에 비해 P <0.01, 짝 t-테스트) TIT에 1 일에서 유의 한 것으로 시작으로 빠르게 발전하고 TPT 하루 2 식염수에 비해 (P <0.05, 짝 t-테스트에서 ) 컨트롤을 주입.
제 7 일에 모르핀의 진통 시간 코스, 만성 모르핀 치료 (단계 E) 후
하루 7 일 (D6에 D0) 7 일 동안 매일 모르핀 또는 식염수 주사를받은 생쥐는 T에서 조사 하였다IT가 기저 통각 값을 첫 번째 5A 및 TPT 그림 (b) 그림 후 급성 모르핀에 자신의 진통 응답 (5 ㎎ / ㎏, 사우스 캐롤라이나.)에 대한. 그림 4 통각 과민의 발전과 일치, 만성 모르핀으로 처리 된 생쥐의 기저 통각 값 (시간 0) 생리 식염수 주입 제어 마우스 (P <0.001, 짝이 t-검정)에 비해 유의하게 낮았다. 급성 모르핀 다음, 만성 모르핀 투여군의 통각 반응은 현저하게 증가하지만, 약간 30 TIT의 최소 및 TPT (p <0.01 및 p <0.05, 짝 t에서 측정 식염수 주입 된 대조군 마우스의 기저 통각 값을 초과 테스트, 각각)와 TIT 60 분 (p <0.05; 짝이 t-검정). 2 시간에서 모르핀 치료 후 실험이 끝날 때까지, 통각 반응은 대조군 마우스들 (p보다 낮은 값으로 반환<0.001, 짝이 t-검정).
모르핀에 마우스의 최대 진통제 응답의 비교 (0 일) 이전과 이후 만성 모르핀 치료 (주 7).
그림 6에 제시 통각 역치 값은 TIT (A)에서이며, 그림 3 (0 일), 5 (일 7)에 도시 된 바와 같이, TPT (B)는 생리 식염수 또는 모르핀 주사 후 30 분을 수행 하였다. 모르핀의 진통에 강한 감소는 모두 통각 테스트에서 0 일에서 초기 진통 응답 (P <0.001 쌍 t-검정)에 비해 7 일 만성 모르핀 치료 후 마우스에서 관찰되었다. 이러한 데이터는 허용 통증 과민 한 동물에서 개발 않았 음을 보여줍니다.
그림 1. 5 단계 프로모르핀 유도 통각 과민과 허용 오차를 모니터링하는 시저는. 프로토콜 15 일 전체 기간에 걸쳐 다섯 순차적 단계 (AE)로 분할된다.
. 기초 통각 응답 값 (단계 B, D-1 D-4)의 그림 2 정의. 꼬리 침수 (TIT) (A)와 꼬리 압력 (TPT) (B) 테스트는 동물의 전체 시리즈에 적용됩니다 그 기저 통각 값을 평가하기 위해. 그 후, 마우스의 두 그룹 (N = 8), '생리 식염수'로 언급하고 그들이 간주됩니다 어떤 통각 양상, 안정과 비교 평균 통각 값을 나타낼 수 있도록 '몰핀'그룹은 정의되어 있습니다.
TIT (A)와 TPT (B) 하루 0 (단계 C)에서 모르핀의 진통 그림 3. 시간 코스. 마우스의 기초 통각 응답 값은 하나의 모르핀 (5 ㎎ / ㎏, 사우스 캐롤라이나 후 매 30 분을 측정 하였다. ) 또는 식염수 주사. 데이터가 ± SEM 수단으로 표현, 그룹 당 n = 13 마우스된다. * P <0.05, ** P <0.01, *** P <0.001, 짝 t-검정기를 제어하는 비교.
. 반복 모르핀 관리 (단계 D, D6에 D1) 다음 통각 과민의 그림 4 개발은. 마우스의 기초 통각 값은 TIT에 의해 결정되었다 (A)와 TPT (B) 회 전 모르핀 (5 ㎎ / ㎏,사우스 캐롤라이나.) 또는 식염수 관리. 데이터는 SEM ± 등의 평균 값을 표현, 그룹 당 n = 8 마우스된다. * P <0.05, ** P <0.01, *** P <0.001 짝 t-검정에 의해 생리 식염수 - 처리 된 대조군과 비교.
그림 5. 시간 코스 7 일째에 만성 모르핀 치료를 생쥐의 모르핀 진통제 TIT 인 STEP (E) (A) 및 만성 모르핀 (검은 점) 또는 생리 식염수 (흰색 삼각형)으로 처리 하였다 TPT (B). 마우스에 대한 0 일에서 하루에 6, 7 일째에 모르핀의 단일 주입 (각각 5 ㎎ / ㎏, 사우스 캐롤라이나.) 또는 식염수를 받았다. 생쥐의 통각 반응은 모르핀 또는 식염수 주입 후 매 30 분을 측정 하였다. 데이터는 ± SEM 의미로 표현, N 그룹 당 = 8 쥐됩니다. * P <0.05, ** P & #60; 식염수 - 처리 된 대조군에 비해 짝 t-검정 0.01. 심볼의 크기를 초과하지 않는 오차 막대는 숨겨져 있습니다.
그림 6. 여기에보고 만성 모르핀 치료 (일 7). 값은 그림 3과 그림 5 실험에서이다 (0 일) 및 이후 전 모르핀 마우스의 최대 진통 반응 (5 ㎎ / ㎏, 사우스 캐롤라이나.)의 비교. 통각 값 TIT (A) 및 TPT (B) 모르핀 또는 식염수 주입 후 30 분을 사용하여 측정 하였다. 데이터는 ± SEM 의미로 표현, N 그룹 당 = 8 쥐됩니다. *** P <0.001 쌍 t-검정에 의해.
Discussion
중요한 단계
통각 측정을위한 동물 모델의 선택
쥐의 변종들 통각과 진통 감도의 변화가 원인이 상이한 다양한 통증 모델을 사용 (이용 후기 14 ~ 16) 리뷰를 검토 한 (통각을, 염증, 신경 병증), 양상 (열, 화학, 기계), 지속 시간 (급성, 토닉, 만성) 및 관리 사이트 (피부, 피하, 내장). 다른 균주에 비해 그들이 높은 기저 통각 감도 17, 18 및 약물 14,19에 적당한 진통 응답을 전시로, C57BL/6J 마우스 (잭슨 연구소에 대해 "J")는 통증 연구를위한 인기있는 동물 모델이되었다. 만성 모르핀 치료에 따라, 그들은 또한 상당한 진통 허용 오차 20, 21, 21, 22, 통각 과민과 의존 20,23을 개발한다.
NT "> 여기에서, 실험은 C57BL/6N 사탕 마우스에 수행 된 B6 혈통의 별도의 지점에 속한다 ("Taconics 팜 전술 ' "국민 건강의 연구소에 대해"N). C57BL / 6 마우스가 오래되어 있지만 교환, 최근의 연구는 C57BL/6J 및 C57BL/6N 24 균주 중 중요한 행동의 차이를 지적으로 간주. 특히, 열 통증이 급성하기 (사탕 하나를 포함한다)의 세 C57BL/6N의 substrains의 낮은 감도로 간주 될 수있다 이러한 표현형을 테스트하는 이점.수컷 마우스는 청소년 수컷 25에서 수행되는, 동물 모델로서 쥐를 사용하여 통증 연구의 대부분으로서 선택 하였다. 보기의 진통제 또는 통각 과민 지점에서 검사를 할 때 우리의 손에, 그들은 강력하고 재현 가능한 데이터를 제공했습니다. 때때로, 우리는 C57BL/6N의 여성은 TIT와 TPT 테스트 모두에서 더 많은 변수 응답을 제공하는 경향이 나타났습니다. 이 관찰은 할 수 있지만여성의 호르몬 상태에 연결된 자연의 변화를 반영, 통증과 진통제에 섹스의 차이를 기본 전반적인 메커니즘은 여전히 논쟁의 문제가 남아있다. 이 뜨거운 논쟁의 일부 측면은 간단히 섹션 다음 '기술의 한계'에 제출 될 것입니다.
동물 습관화
마우스는 첫 번째 주에 동물 시설에 익숙해 질 수 있었다. 다른 행동 연구와 마찬가지로, 테스트는 3 일간 - 적응 기간 (그림 1, 단계 A) 다음을 수행 하였다. 통각 검사가 스트레스에 민감한으로, 첫 번째 조치는 특히 비 길들여 마우스 (26, 27)에, 이후의 것들보다 더 긴 대기 시간을 제공 할 수 있습니다. 습관화 단계는 동일 일 이내 및 일 간의보다 안정적인 통각 반응 값의 obtention 2 및도 4를 피규어 허용한다. 통각과 진통에 효과주기를 줄이기 위해감도 28, 29, 모든 testings를은 오전 10시에서 오후 4시까지 실시했다.
통각 검사의 선택
통각 검사는 열, 기계적, 화학적 또는 전기적 자극 (리뷰 26,27,30. 다른 통각 양식이 다른 침해 수용체 섬유 18,31,32를 통해 처리 할 수 있으므로 자신의 선택이 중요한 하나를 사용하십시오.
우리는 열의 예로서 랜달과 Selitto 35에서 적응 꼬리 침지 시험 (TIT) (33), D' 아무르 스미스 (34)에 의해 개발 된 고전적인 꼬리 영화 테스트의 수정 된 버전, 꼬리 압력 시험 (TPT)를 선택하고 쥐에 모르핀 유발 진통제, 통각 과민과 관용을 연구하는 기계 양식. 두 시험은 널리 쥐에 사용되었습니다. 차단 시간을 체계적으로 조직 손상의 위험을 방지하거나 제한하기 위해 정의되었다.
모르핀 인덕턴스에드 진통제, 통각 과민과 관용
그것은 강력한 진통제와 OIH - 유도 그대로 모르핀, 원형 뮤 아편 작용제는 인간과 쥐 1,2,36 모두, 여기에 선정되었다. 모르핀의 진통 효능은 쥐의 변종, 투여 경로 및 통각 양식에 따라 변화하는 것으로 알려져 있습니다. C57BL / 6 마우스에서 안정적인 진통은 보통 1-20 ㎎ / kg의 투여 량 범위에서 14,21 모르핀 피하 주사 다음이 얻어진다. 따라서, 우리는 열 통각 (19, 21)에서 평가의 ED 50 값 (7-20 ㎎ / ㎏)에 가까운 5 ㎎ / ㎏,에서 모르핀의 단일 관리 (SC) 다음과 같은 심각한 진통을 공부하기로 결정했습니다.
반복 모르핀 투여 자주 통각 과민 (고통스러운 STIMUL에 악화 감도 (용량 - 반응 곡선의 우측 이동 또는 진통제 응답 진폭 또는 지속 시간의 감소에서 하나 입증) 진통제 내성과 함께합니다i)는 기저 통각 값이 감소 입증. 두 불리한 현상은 치료 기간에과 통각 양식 21 아편 선택 화합물 및 투여 량의 자연, 설치류의 변종에 따라 다릅니다. 예를 들어, 관용과 통각 과민을 연구하는 실험 패러다임은 일정한 고 (하루 20 ~ 40 ㎎ / ㎏)의 22 또는 (최대 50 또는 200 ㎎ / ㎏) 20, 21 모르핀의 투여 량을 고조의 일상 관리에 구성되어 있습니다. 8 일 동안, 따라서, 우리는 매일 모르핀 관리 (SC 5 ㎎ / ㎏)를 통해 C57BL / 6 마우스에서 통각 과민과 관용의 개발을 촉진. 이 정도 모르핀의 투여 량은 더 나은 모방 클리닉 사용에 더 높은 것보다 선호했다.
TIT 운영 윈도우의 설정
TIT에서 가능한 함정은 설치류 26,37의 체온 조절에 꼬리의 역할과 관련이있을 수 있습니다. 주위 온도가 nocicept에 중요한 요소이기 때문에응답 변화를 필자, 그것은 실험 38을 통해 (여기에 21 ° C에서) 일정하게 유지되어야한다. 열 강도는 보통 5 ~ 10 초 27에서 통각 반응을 감지하도록 설정되어 있습니다. 짧은 것들은 시험의 차분 전력을 감소시킬 수있는 반면 실제로, 큰 지연은 침해 수용성 자극에 관계없는 동물의 움직임을 모니터링하기 위해 위험을 증가시킬 수있다. 우리는 48 ° C의 온도를 일정에 TIT 측정을 수행 꼬리 탈퇴 대기 시간이 9 초 (기초 통각 값)에 가까운 25 초 4 초 (통각 과민)에서 변화했다 (최대 진통제, 차단). 실질적인 이유에 더하여, 고정 온도에서 통각 반응 값의 측정은 선험적함으로써 데이터 해석을 용이 침해 수용체 및 회로의 동일한 레퍼토리를 수반 할 수있다.
가능한 수정
진통제와 OIH 방식 측정 TIT 운영 윈도우의 최적화국세청
진통 반응에 집중하면, 낮은 초기 값 (높은 열 강도) 응답 지연의 검출을 선호 할 수 있습니다. 그림 4 빠른 응답의 검출을 용이하게 할 수있다, 차례 차례로, 고통스러운 자극의 결과 또는 OIH의 개발, 높은 초기 값 (여기에 48 ° C 낮은 열 강도)를 해결하기 위해.
모르핀 유발 진통제, (중요한 단계 이전에 언급 한 바와 같이 우리는 5 밀리그램에서 모르핀을 찾을 수 있지만, / 강력한 진통제 응답 그림 3을 유도하고 (반복 투여시) 중요한 통각 과민 그림 4를 촉진하기 편리한 용량을 kg, 그 용량은 구성 될 수있다 통각 과민과 관용). 예를 들어, 더 낮은 복용량은 고용량이 통각 과민의 발병을 촉진하고 그 진폭을 증가시키기 위해 선택 될 수있는 반면 (이를 차단 제한을 피하는) 진통제 진폭을 감소시키기 위해 사용될 수있다.
비켜rall, '통각 창'의 최적화 연구에서 생쥐의 유전 적 배경에 적응하고 계정에 침해 수용체 및 회로의 독특한 배열의 참여에 대한 가능성을해야합니다.
대체 아편 작용제 (펜타닐, remifentanyl)
대부분의 임상 적으로 사용이 아편 작용제로서 MU-오피오이드 수용체를 표적으로하지만, 이들은 시험 관내 및 생체 내 둘 다 그들의 약리학 적 특성에 대하여 상당히 다르다. 예를 들어, remifentanyl 및 펜타닐의 경우, 모르핀으로 표시 대조적으로 전체 작용제 행동 및 뮤 - 오피오이드 수용체 (39)의 국제화를 촉진한다. remifentanyl 몇 분 (41)의 매우 짧은 반감기를 가지고있는 동안 모르핀과 펜타닐 등 아편 진통제는 시간 40의 범위에서 반감기가 있습니다. 인간, OIH에 대한 최고의 증거는 짧은 연기 C를 포함하여, 수술 중 마취를받은 환자에서입니다같은 remifentanyl 2,42으로 ompounds. 따라서, 펜타닐과 remifentanyl는 TIT 및 TPT 패러다임에서 생쥐의 통각 과민과 관용의 개발을 연구 너무 가치있는 도구가 될 수 있습니다.
OIH의 유도의 대체 모드 (급성 관리 대 만성)
OIH은 매우 낮거나 매우 높은 복용량 1,2의 여부, 마취 관리의 결과로 인간과 동물 모델에서 볼 수있다. 우리는 모르핀의 적당한 용량과 생쥐의 만성 치료 다음 OIH 개발에보고한다. . C57BL/6N 마우스의 치료의 여러 가지 일 4 일간 모르핀 주사를 적절하게 이식 모르핀 펠릿으로 대체 될 수있는 명확하고 재현 hyperalgesic 상태도 증거가 필요했다 : 자신의 제거시를, 열 통각 과민 및 기계적 이질통 모두 이미 생쥐에서보고 된 바있다 43. 마이크로 침투 펌프를 통해 약물의 주입은 또 다른 가능성이다 44. 설치류에서 오래 지속되는 통각 과민도 달성 할 수있는 인간의 수술 36,45,46이 뮤 - 오피오이드 길항제의 사용을 흉내 낸 프로토콜을 사용하여 펜타닐의 급성 관리를 수행한다.
기술의 한계
통증에 대한 동물 종 및 모델
수많은 마우스 종자의 비교 연구는 4 일 모르핀 치료 22 다음과 같은 고통스러운 자극 17,31,47에 통각 반응과 OIH 수준에서 큰 변화에 대한 증거를 제공했다. 동물 모델 (쥐 및 쥐)에 통증 처리 및 변조를 기본 메커니즘은 만성 통증 환자에 대한 관련이 있는지 여부는 근본적인 열린 질문 남아있다. 따라서, 많은주의는 인간 16 동물을위한 데이터의 해석과 자신의 예측 타당성에 지불해야한다.
통증과 진통제에 성별 차이
ntent "> 통증 동물 모델에서 대부분의 임상 연구는이 선택의 편견에도 불구하고, 새로운 뷰가 아편을 개발하기 위해 아편 진통제 49,50, 적은 경향이 더 나은 조치로 남성을 고려하는 것이 었습니다. 남성 설치류 16,25,48에 진행되고있다 통각 과민 (51, 52)와 자신의 여성 대응 (리뷰 54)보다 모르핀 진통제 53 관대를 유도. 그러나, 통각 및 진통제의 효능에 관해서는 성별 차이는 재개하지 패러다임 '한 사이즈 것은 모두를 적합'. 사실, 풍부한 데이터는 이제 수많은 변수는 오피오이드 약물 효능 및 선택성, 통각 분석, 유전 적 배경, 나이, gonado 호르몬 상태 나 사회적 상호 작용 48,54 같은 성별 차이의 크기와 방향에 영향을 미칠 수 있음을 나타냅니다. 인간, 임상 통증 여성에서 더 유행하지만,이 사실은 실제 섹스의 차이를 반영하는지 여부를 토론 48,55,56의 문제가 남아있다. FO메타 분석은 여성 (57)의 상당히 큰 아편 효능을 지적 환자 제어 과목에서 수행하는 반면 R 예, 오십 임상 시험의 글로벌 분석은 성별 간의 진통에 유의 한 차이를 표시하지 않습니다. 현저하게 된 내용과 대조 후자의 관찰, 설치류에서 발견, 다시 같은 다방면의 16,48,55,57의 기원에 관한 몇 가지 질문을 제기한다. 전부, 진통제의 성별 차이가 존재하고 장점은 더욱 근본적인 메커니즘과 임상 적 의미에 초점을 맞 춥니 다.통각 테스트에 대한
꼬리 탈퇴 시험은 척수 반사이지만 supraspinal 영향 (58)의 적용을받을 수 있습니다. TIT 쥐에서 수행하기가 비교적 용이하지만, 마우스에 더 많은 전문 지식이 필요합니다. 잠재적 인 어려움은 원치 않는 스트레스를 유발하지 않고 올바른 자세로 마우스를 유지하는 것이다. 제안 된 프로토콜에 따라 조절 될 수있다코호트의 크기. 16 동물 (8 제어 및 8 처리) 쉽게까지 자신의 기초 통각 반응 값의 측정으로 (처음 TIT를 사용하여, 다음 마우스의 전체 시리즈를위한 TPT)이 관심을 받고있다 관리됩니다. 진통 시간의 과정을 모니터링 이수 시간 간격 (여기에서 30 분) 내에서 정확한 시간 일정의 설립 및 (먼저 TIT, TPT) 테스트 할 수 있습니다 동물의 최대 수의 평가를 필요로한다. 동물의 전체 코호트 따라서 실험자가 운동 제한을 준수 할 수 있도록 서브 그룹으로 분할 될 수있다.
기존 / 대체 방법에 대한 기술의 중요성
OIH 마우스 대 쥐
쥐 광범위하게 급성 또는 만성 아편 관리 46,59-61 다음, 아편 유사 진통제, 통각 과민과 관용을 연구하는 데 사용되었습니다. 실제로, 몇몇 실제적인 이유로, 이들은 우수한 것으로 간주 될 수있다통증 실험 16,61위한 동물 모델로 쥐. 그러나, 최근까지, 유 전적으로 변형 된 쥐의 생성은 간단 절차 아니었다. 수많은 유전자 변형 마우스 종자는 이미 사용할 수 있습니다, 우리의 모델 마우스에 OIH와 관용의 개발에 다수의 개별 유전자의 기여를 연구 할 수있는 기회를 제공합니다.
다른 통각 검사 대 TIT 및 TPT
TIT는 꼬리 영화 테스트, 자극의 영역 인 가장 명백한 차이의 변종이다. 복사열과는 대조적으로, 뜨거운 물에 꼬리의 침수의 온도에서 신속하고 균일 한 증가로 연결됩니다. 열 통각 검사 (핫 플레이트 또는 하그리브스 시험)의 다른 형태에 비해, 가슴을 가로 질러과 과목에서 모두 상당히 재현 가능한 결과를 제공합니다.
TPT 아마 포함 기계적 통각 26,27,35의 연구를위한 매우 인기있는 시험입니다별개의 통각 섬유 및 분자 트랜스 듀서 다음 TIT 32. 그것은 빠르고 신뢰할 수있는 측정 59을 제공하지만 실험 및 대형 동물 동료의 전문 지식이 필요합니다. 본 연구 결과, 다른 절차 나 장치에 사용 analgesimeter에 대한 대안으로 스트레인 게이지에 의존하는 (리뷰 27) 존재한다. TPT는 본 프레이 필라멘트는 일반적으로 기계적 이질통 (리뷰 27)을 평가하기 위해 수행되는 반면 기계적 통각 과민을 공부에 가장 적합합니다.
이 기술을 마스터 한 후 미래의 응용 프로그램 또는 방향
우리는 여기에 제시 실험 OIH / 오차 모델은 유사 통증 변조의 개별 유전자의 역할을 평가하기 위해 유전자 변형 마우스에 적응 될 수있다. 또한, 만성 통증을 완화하는 전위 치료제의 효과를 조사하기 위해 모델 시스템을 제공한다.
Disclosures
저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.
Acknowledgments
우리는 박사 JL 감사합니다. Galzi (UMR7242 CNRS, 스트라스부르, 프랑스) 자신의 지원.
이 작품은 CNRS, INSERM, Université 드 스트라스부르, 알자스 바이오 밸리에 의해 Conectus, 직원은 국립 드 라 공들인 (ANR 08 EBIO 014.02)에서 교부금에 의해 지원 된 헌법위원회 지역 달자 (Pharmadol), Communauté 어바인 드 스트라스부르 (Pharmadol) ICFRC (Pharmadol), OSEO (Pharmadol), 방향 제네랄 데 ENTREPRISES (Pharmadol).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6N Tac mice | Taconic, Ry, Denmark | C57BL/6N Tac B6-M | Male mice (25-30 g) |
| Morphine hydrochloride | Francopia, Paris, France | CAS no. 52-26-6 | Delivered with special authorization |
| Syringes (Terumo) | Dutscher, Brumath, France | 050000 | Polypropylene, sterile, volume: 1 ml |
| Needles (Terumo) | Dutscher, Brumath, France | 050101 | 26 G ½ (Terumo reference : NN2613RO1) |
| Mouse restrainer | Home-made | Two metallic grids (5 x 11 cm) assembled with adhesive tape and staples | |
| Thermostated water bath GR150 | Grant Instruments, Cambridge, UK | GP 0540003 | |
| Analgesimeter | Panlab, Barcelona, Spain | LE 7306 | |
| Kaleidagraph software | Synergy software, Reading, PA, USA | Kaleidagraph 4.03 | Scientific graphing |
| STATview software | Free download, statistics |
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