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Neuroscience

Evaluación de la hiperalgesia inducida por la morfina y analgésicos Tolerancia en ratones utilizando térmicas y mecánicas Modalidades nociceptivos

Published: July 29, 2014 doi: 10.3791/51264
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Biotechnology and Cellular Signalling, UMR 7242 CNRS, Université de Strasbourg

Summary

Se describe un protocolo para examinar el desarrollo de la hiperalgesia y la tolerancia en ratones inducida por opioides. Sobre la base de la medición de las respuestas nociceptivas térmicas y mecánicas de los animales no tratados previamente y tratados con morfina, que permite cuantificar el aumento en la sensibilidad al dolor (hiperalgesia) y disminuir en la analgesia (tolerancia) asociada con la administración de opiáceos crónica.

Abstract

Hiperalgesia y tolerancia inducida por opioides afectan gravemente la eficacia clínica de los opiáceos como analgésicos en animales y humanos. Los mecanismos moleculares que subyacen a ambos fenómenos no son bien entendidos y su elucidación deberían beneficiarse del estudio de modelos animales y desde el diseño de protocolos experimentales apropiadas.

Se describe aquí un enfoque metodológico para la inducción, el registro y la cuantificación de la hiperalgesia inducida por la morfina, así como para evidenciar la tolerancia analgésica, utilizando las pruebas de presión de la cola-inmersión y de la cola en ratones de tipo salvaje. Como se muestra en el video, el protocolo se divide en cinco pasos secuenciales. Fases de manipulación y de habituación permiten una determinación segura de la respuesta nociceptiva basal de los animales. La administración crónica de morfina induce hiperalgesia significativa como se muestra por un aumento tanto en sensibilidad térmica y mecánica, mientras que la comparación de la analgesia cursos temporales después de aguda o representantetratamiento con morfina eated indica claramente el desarrollo de la tolerancia se manifiesta por una disminución de la amplitud de la respuesta analgésica. Este protocolo se puede adaptar de manera similar a los ratones modificados genéticamente con el fin de evaluar el papel de los genes individuales en la modulación de la nocicepción y analgesia de la morfina. También proporciona un sistema modelo para investigar la eficacia de agentes terapéuticos potenciales para mejorar la eficacia analgésica de los opiáceos.

Introduction

Hiperalgesia inducida por opiáceos (HIO) y la tolerancia analgésica limitan la eficacia clínica de los opiáceos en los animales y los seres humanos 1-3. La participación de los pro-inflamatoria de 4,5 o de pro-nociceptivos (anti-opioide) 6,7 sistemas están actualmente explorando hipótesis. La elucidación de los mecanismos subyacentes HIO y la tolerancia requiere una combinación de in vivo e in vitro enfoques, usando modelos animales adecuados, protocolos experimentales y herramientas moleculares.

Farmacología del comportamiento es el paradigma dominante para controlar y cuantificar los estados analgésicas y hiperalgésicas en animales de laboratorio (ratas, ratones). La aplicación de un estímulo nocivo (térmica, mecánica o química) a una parte del cuerpo conveniente (pata trasera, cola) del animal conduce a una retirada nocifensive que puede ser fácilmente anotó.

Proponemos aquí un enfoque metodológico para la inducción, el registro y cuantificación de OIH ytolerancia en ratones de tipo salvaje, utilizando las pruebas de presión de la cola-inmersión y de la cola. El procedimiento permite una determinación fácil, sensible y reproducible de los valores de respuesta nociceptivas térmicas y mecánicas en ratones. Como se demuestra en el protocolo de video, C57BL / 6 ratones experimentan hiperalgesia significativa después de la administración crónica de morfina y mantener esto durante varios días. Ambos valores nociceptivas térmicas y mecánicas se reducen significativamente, en comparación con las mediciones de línea de base en los animales no tratados previamente. Por otra parte, nuestro montaje experimental permite monitorear, además del desarrollo de OIH, la disminución de la respuesta analgésica de la morfina (tolerancia). Los datos presentados respaldan la opinión de que la hiperalgesia y la tolerancia pueden involucrar mecanismos celulares y moleculares comunes 8,9, aunque esto es discutido en la literatura 1,10-12. Finalmente, este protocolo se puede adaptar de manera similar a los ratones modificados genéticamente con el fin de evaluar el papel de los genes individuales en la modulaciónción del dolor. También proporciona un sistema modelo para evaluar la eficacia de agentes terapéuticos potenciales para mejorar los efectos analgésicos opiáceos.

Protocol

Todos los experimentos se llevaron a cabo en estricta conformidad con las directrices europeas para el cuidado de animales de laboratorio (Directiva 86/609/ECC Consejo Europeo de Comunidades) y las directrices éticas para la investigación del dolor experimental en animales conscientes 13. Ratones macho C57BL6 / N Tac (10 semanas, 25 - 30 g) fueron alojados en una instalación para animales institucional, con el personal de atención a cargo de la explotación de la instalación de acuerdo con las normas ambientales. Los animales fueron alojados en grupos (máximo cinco ratones por jaula) en virtud de un 12 h / 12 horas de luz / oscuridad ciclo a una temperatura constante (21 ± 1 ° C), con acceso libre a comida y agua. Todos los experimentos se realizaron en el mismo periodo del día (10:00 am a 4:00 pm), utilizando una cohorte de 16 ratones. Materiales y equipos específicos se indican en la tabla de materiales.

Un procedimiento de cinco pasos para supervisar la morfina inducida por la hiperalgesia y la tolerancia

El protocolo esdividido en cinco pasos secuenciales (AE) sobre una duración de 15 días Figura 1.

. 1 ratones Handling (fase A, d-7 a D-5)

  1. Maneje los ratones y habituarse a entrar libremente en la inmovilización. Este paso preliminar reduce el estrés - minimizando así cualquier confusión con la analgesia inducida por el estrés - y permite que los animales se acostumbren al investigador, el manejo y la manipulación a la inmovilización del ratón. Cada ratón se maneja suavemente durante 5 minutos todos los días.

. 2 Basal nociceptivo respuesta (Etapa B, d-4 a D-1)

  1. Mida las latencias de retirada de la cola utilizando la prueba de inmersión de cola (TIT):
    1. Ajuste el termostato a 48 ° C.
    2. Introducir suavemente el ratón en la inmovilización. Sumerja el que sobresale 2/3 final de su cola en el baño de agua e iniciar el cronómetro.
    3. Detenga el cronómetro tan pronto como el ratón se retira la cola del agua caliente y registrar el tiempo de latencia (en segundos). En the ausencia de cualquier reacción nociceptivo, a 25 seg de corte se utiliza para prevenir el daño tisular.
    4. Reemplazar el ratón en su jaula y probar la siguiente hasta el final de la serie.
    5. Repetir las mediciones de respuesta nociceptivas dos veces más, tomando mediciones de los animales en el mismo orden. La latencia de la respuesta nociceptiva (seg) para cada ratón se determina como el valor medio de tres determinaciones sucesivas.
  2. Mida respuestas mecánicas utilizando la prueba de presión de cola (TPT)
    1. Introducir suavemente el ratón en la inmovilización y la posición de la cola debajo de la punta cónica del analgesímetro.
    2. Pulse el interruptor de pedal para aplicar uniformemente creciente presión sobre la parte proximal de la cola hasta que la primera reacción nociceptiva (luchando, chirridos) ocurre. En el momento en que el animal reacciona, registrar la fuerza de la corriente (en gramos) que provoca la respuesta nociceptiva. En ausencia de cualquier reacción, un 600 g valor de corte se utiliza para evitar la temitir daños.
    3. Repetir esta medida en las partes medias y distales de la cola del mismo ratón. Se observa un intervalo de al menos 30 segundos entre las medidas de un ratón dado para evitar la adaptación o sesgo estrés. Reemplazar el ratón en su jaula y probar el siguiente animal hasta que el final de la serie (es decir, todos los ratones se prueban). El valor nociceptivo (gramos) para cada ratón se toma como el valor medio de tres mediciones (es decir, proximales, medios y distales de las partes de la cola de cada animal).
  3. Pruebas nociceptivo Repeat (todos los procedimientos descritos en el paso 2) en los días posteriores, d-3 a D-1.

. 3 Medición de la analgesia de la morfina (Etapa C; d0)

  1. Definir la mejor combinación de animales, que permite la selección de los dos grupos (n = 8 por grupo) de ratones con valores nociceptivas medias estables y comparables, de cualquier modalidad que nociceptivo (TIT o TPT) se considera. Este valor se toma como el basalrespuesta nociceptiva de referencia para futuros grupos 'Saline' y 'La morfina.
  2. Medir el peso corporal de cada animal.
  3. Preparar una solución de morfina (0,5 mg de morfina por ml) en solución salina fisiológica estéril (NaCl 0,9%) para la administración subcutánea (5 mg de morfina por kg de peso corporal de los animales).
  4. Medir la latencia de la respuesta nociceptiva (tomado como punto de tiempo 0) para cada ratón de tanto 'Saline' y los grupos de morfina 'en el TIT (todos los pasos del apartado 2.1 anterior). A continuación, medir la nocicepción en el TPT (todos los pasos del apartado 2.2 anterior).
  5. Inyectar la morfina por vía subcutánea (normalmente 0,25 ml de un 0,5 mg / ml solución de morfina por cada 25 g de peso del ratón) y solución salina (0,25 ml por 25 g de peso del ratón) para la "morfina" y grupos "salinas", respectivamente.
  6. Mida los valores nociceptivas en el TIT y TPT (todos los procedimientos descritos anteriormente en los pasos 2.1 y 2.2, respectivamente) durante un transcurso de tiempo (a 30 min intervla analgesia AL) para evaluar la morfina (5 mg / kg) inducida por:
    1. Después de 30 minutos después de la inyección, medir la respuesta nociceptiva (una sola determinación) para cada ratón de la "Saline" y grupos "Morfina", utilizando el TIT entonces el TPT.
    2. A continuación, medir los valores de respuesta nociceptivo (TIT y TPT) en todos los ratones en puntos de tiempo (en horas): 1-1.5-2-2.5-3 y 3,5 después de la inyección.

4 El tratamiento crónico de morfina - La morfina-inducida hiperalgesia. (Paso D; d1 a d6)

  1. En el Día: d1
    1. Medir valores de respuesta nociceptivas en la teta y TPT como se describió anteriormente (pasos 2.1 y 2.2). Anotar cuidadosamente las latencias de retirada y los límites de presión para cada animal.
    2. Prepare una solución de morfina fresco como se detalla en el paso 3.2.
    3. Inyectar la morfina por vía subcutánea (5 mg / kg de peso corporal) a todo el grupo 'Morfina' y solución salina fisiológica (0,25 ml por 25 g de peso del ratón) para el grupo 'Saline'. Deje ªe los animales descansan hasta el día siguiente.
  2. En días: d2, d3, d4, d5 y d6 repetir las operaciones descritas en la Sección 4.1

. 5 La evidencia de la tolerancia analgésica (Paso E; d7)

  1. Evaluar la analgesia inducida por la morfina de acuerdo con el paradigma del tiempo-por supuesto que ya se detalla en la Sección 3.

6. Adquisición de datos y análisis estadísticos

  1. Evaluación de los valores de respuesta basal nociceptivos (etapa b)
    1. Se calcula para cada día (el d-4 a D-1 punto) la media ± SEM valores (n = 8) para las respuestas nociceptivas basales como otorgada de TIT y TPT en el 'Saline' y los grupos de morfina '.
    2. Parcela significa valores basales nociceptivos como una función del tiempo (días) para ambos grupos Figura 2.
  2. Análisis de morfina analgesia Tiempo platos en Días d0 (Paso C) y d7 (paso E)
    1. Calcula, en cada punto de tiempo después de la morfinala inyección, la media ± SEM valores (n = 8) para las respuestas nociceptivas como proporcionó de TIT (en seg) y TPT (en g) en cada grupo.
    2. Parcela significa valores de respuesta nociceptivas como una función del tiempo para el 'Saline' y los grupos de morfina 'en el día 0 y día 3 Figura 7 Figura 5.
  3. Desarrollo de la hiperalgesia inducida por morfina (Etapa D)
    1. Se calcula para cada día (durante el período de tratamiento d0-d7) la media ± SEM valores (n = 8) para los valores de respuesta nociceptivas basales como otorgada de TIT y TPT en el 'tratado con solución salina "y los grupos de morfina tratados.
    2. Terreno valores medios de respuesta nociceptivas basales como una función del tiempo (días) para el 'tratado con solución salina "y grupos de morfina tratados' Figura 4.
  4. La evidencia de la tolerancia analgésica (Pasos C y E)
    1. Determinar a partir de la morfina que el curso temporal eXperiment lleva a cabo a D0 Figura 3 el valor de tiempo (o rango de tiempo) requerida para la morfina para inducir una respuesta analgésica máxima.
    2. Tome este valor (por lo general 30 min) como el tiempo de referencia para estimar en d7 Figura 5 el valor de línea de base nocicepción (grupo tratado con solución salina) y la respuesta analgésica real (grupo de morfina-tratado) a la morfina aguda.
    3. Valores nociceptivos tomadas en el punto de 30 minutos de tiempo curso experimentos realizados en morfina d0 y d7 para los grupos tratados con solución salina y tratado con morfina tiempo, se presentan como histogramas Figura 6.
    4. Estadísticas: Analizar los datos utilizando un solo sentido ANOVA de medidas repetidas. Los factores de variación fueron del tratamiento (entre sujetos) y la hora (en un mismo sujeto). Para comprobar diferencias por separado en cada grupo, se realizó ANOVA de medidas repetidas. Las comparaciones entre los dos grupos se realizaron mediante la prueba t no pareada o prueba t pareada cuando sea apropiado.
  5. El nivel de significación se fijó en p <0,05. Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software Statview.

Representative Results

Evaluación de los valores basales nociceptivos de ratones sin tratamiento previo (Etapa B)

TIT y TPT se aplicaron secuencialmente a toda la cohorte de ratones (n = 16), proporcionando valores medios de respuesta nociceptivas. La mejor combinación de animales permitió una una definición a posteriori de los dos grupos (n = 8) de los ratones, se hace referencia como la solución salina y la morfina, que muestra los valores basales nociceptivas similares y estables Figura 2. La equivalencia de ambos grupos es válida cualquiera que sea la prueba nociceptivo ( TIT: Figura 2A; TPT: Figura 2B) que fue seleccionado.

Tiempo de duración para la analgesia de la morfina en el día 0 (Etapa C)

La morfina se evaluó la analgesia después de una sola inyección (sc) de la morfina (5 mg / kg) en ratones no tratados previamente utilizando tanto TIT Figura 3A y la Figura 3B TPT. En ambas pruebas, análisis estadísticos con una forma de medidas repetidas ANOVA reveal que existe una interacción significativa entre el tratamiento y el tiempo para TIT (F (7, 98) = 72, p <0,001) y TPT (F (7, 98) = 31, p <0,001). TIT y datos TPT análisis utilizando ANOVA de medidas repetidas indican que no hay efecto de la inyección de solución salina (F (7, 49) = 0.49, p> 0.05) y F (7, 49) = 1.85, p> 0,05, respectivamente, para TIT y TPT pruebas), mientras que la inyección de morfina induce una fuerte analgesia en ratones (F (7, 49) = 92,46, p <0,001) y F (7, 49) = 34,37, p <0,001, respectivamente, para TIT y pruebas TPT). Se alcanzó el máximo efecto analgésico de la morfina después de 30 minutos en el TIT y después de 60 min de TPT, en comparación con los controles inyectados con solución salina (p <0,001, prueba t no pareada).

Las repetidas administraciones de morfina induce hiperalgesia en ratones (Paso D)

Valores nociceptivas basales se midieron todos los díasantes de solución salina o morfina administración (véase el protocolo). Como se muestra en la Figura 4, las administraciones de morfina una vez al día durante un período de 6 días de tratamiento indujo una reducción significativa y progresiva de térmica (F (7, 56) = 11,6, p <0,001, ANOVA de medidas repetidas; Figura 4A) y mecánica (F ( 7,56) = 15,55, p <0,001, ANOVA de medidas repetidas, la figura 4B) valores nociceptivas basales. La hiperalgesia se desarrolló rápidamente como empezó a ser significativa en el día 1 en TIT (p <0,01, prueba t no apareado, en comparación con los controles inyectados con solución salina) y en el día 2 en TPT (p <0,05, prueba t no apareado, en comparación con solución salina -inyectado controles).

Tiempo de duración para la analgesia de la morfina en el día 7, después de crónica de morfina tratamiento (paso E)

En el día 7, los ratones que recibieron morfina o de solución salina inyecciones diarias durante un período de 7 días (D0 a D6) se examinaron en TTI Figura 5A y la Figura 5B TPT primero por sus valores basales nociceptivas y luego por su respuesta analgésica a la morfina aguda (5 mg / kg, sc.). De acuerdo con el desarrollo de la hiperalgesia se muestra en la Figura 4, el valor nociceptivo basales (tiempo 0) de los ratones que fueron tratados crónicamente con morfina fue significativamente menor que la de los ratones de control inyectados con solución salina (p <0,001, prueba t no pareada). Después de la morfina aguda, la respuesta nociceptiva de la morfina grupo tratado con crónica aumentó significativamente, pero sólo supera ligeramente el valor nociceptivo basal de los ratones de control inyectados con solución salina medido a los 30 min en TIT y TPT (p <0,01 y p <0,05, t no apareado -test, respectivamente) ya 60 min en TIT (p <0,05; prueba t no pareada). De 2 horas después de tratamiento con morfina hasta el final del experimento, las respuestas nociceptivas volvieron a los valores más bajos que los de los ratones de control (p<0,001, unpaired t-test).

Comparativa de Máximo respuestas analgésicas de ratones a la morfina antes (día 0) y después de tratamiento crónico con morfina (día 7).

Valores de umbral nociceptivo presentados en la Figura 6 son de TIT (A) y TPT (B) llevan a cabo 30 minutos después de la solución salina o la morfina de inyección tal como se ilustra en las Figuras 3 (día 0) y 5 (día 7). Se observó una fuerte disminución de la analgesia de la morfina en ratones después del tratamiento crónico de morfina durante 7 días en comparación con su respuesta inicial analgesia en el día 0 en ambas pruebas nociceptivas (p <0.001 t de student). Estos datos demuestran que la tolerancia se desarrolló en el dolor animales hipersensibles.

Figura 1
Figura 1. Un profesional de cinco pasosprocedimiento para supervisar la morfina inducida por la hiperalgesia y la tolerancia. El protocolo se divide en cinco pasos secuenciales (AE) sobre una duración total de 15 días.

Figura 2
. Figura 2 Definición de los valores basales nociceptivo respuesta (etapa b, d-4 a D-1). La inmersión de la cola (TIT) (A) y la presión de la cola (TPT) (B) las pruebas se aplican a toda la serie de los animales con el fin de evaluar sus valores basales nociceptivas. A partir de entonces, dos grupos de ratones (n = 8), que se refiere como "Saline" y grupos "Morfina", se definen de manera que exhiben valores nociceptivas medias estables y comparables, cualquiera que sea la modalidad nociceptivo que se considera.

Figura 3 Figura 3. El curso temporal para analgesia de la morfina en el día 0 (Etapa C) en TIT (A) y TPT (B). El valor de la respuesta nociceptiva basal de los ratones se determinó cada 30 min después de la morfina sola (5 mg / kg, sc. ) o inyecciones de solución salina. Los datos se expresan como medias ± SEM, n = 8 ratones por grupo. * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001, prueba t no pareada en comparación con el grupo control.

Figura 4
. Figura 4 Desarrollo de la hiperalgesia después de la administración repetida de morfina (Etapa D; D1 a D6). El valor nociceptivo basal de los ratones se determinó por TIT (A) y TPT (B) una vez al día antes de la morfina (5 mg / kg,sc.) o la administración de solución salina. Los datos se expresan como valores medios ± SEM, n = 8 ratones por grupo. * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001 mediante la prueba t no pareada en comparación con el grupo de control tratado con solución salina.

La figura 5
Figura 5. El curso temporal para la analgesia por morfina en ratones tratados crónica a la morfina en el día 7 (Etapa E) en TIT (A) y TPT (B). Ratones que fueron tratados crónicamente con morfina (puntos negros) o solución salina (triángulos blancos) desde el día 0 al día 6, recibida el día 7 una sola inyección de morfina (5 mg / kg, sc.) o solución salina, respectivamente. La respuesta nociceptiva de los ratones se determinó cada 30 min después de la morfina o la inyección de solución salina. Los datos se expresan como medias ± SEM, n = 8 ratones por grupo. * P <0,05, ** # P &60; 0,01 por la prueba t no pareada en comparación con el grupo de control tratado con solución salina. Las barras de error que no superan el tamaño de los símbolos están ocultos.

La figura 6
Figura 6. Comparación de las respuestas analgésicas máximos de los ratones a la morfina (5 mg / kg, sc.) Antes (día 0) y después de Valores de tratamiento crónico con morfina (día 7). Reportados aquí son de experimentos se muestra en la Figura 3 y la Figura 5. valores nociceptivos se midieron utilizando TIT (A) y TPT (B) 30 minutos después de la morfina o la inyección de solución salina. Los datos se expresan como medias ± SEM, n = 8 ratones por grupo. *** P <0,001 por la prueba t pareada.

Discussion

Pasos críticos

Elección de la modelo animal para las mediciones de la nocicepción

La variabilidad en la sensibilidad nociceptiva y analgésico entre las cepas de ratones se ha examinado (opiniones 14-16) En el uso de diversos modelos de dolor que difieren en su etiología (nociceptivo, inflamatorio, neuropático), modalidad (térmica, química, mecánica), la duración (aguda, tónico, crónica) y sitio de administración (cutánea, subcutánea, visceral). En comparación con otras cepas, C57BL/6J ("J" de Jackson Laboratory) los ratones se convirtió en un modelo animal muy popular para los estudios del dolor, ya que muestran una alta sensibilidad nociceptiva basal 17,18 y una respuesta analgésica moderada a los opiáceos 14,19. Después del tratamiento crónico con morfina, también desarrollan tolerancia analgésica significativa 20,21, 21,22 hiperalgesia y la dependencia 20,23.

nt "> En este caso, los experimentos se realizaron en ratones C57BL/6N Tac (" N "para el Instituto Nacional de Salud y" Tac 'para Taconics granja) que pertenecen a una rama separada del linaje B6. Aunque C57BL / 6 ratones han sido durante mucho tiempo considerados como intercambiables, estudios recientes apuntan a diferencias de comportamiento significativas entre las cepas C57BL/6J y C57BL/6N 24. En particular, la menor sensibilidad de las tres subcepas C57BL/6N (incluyendo el Tac uno) a dolor agudo térmico puede ser considerado como un ventaja para las pruebas de este fenotipo.

Los ratones machos fueron seleccionados como la gran mayoría de los estudios del dolor, utilizando ratones como modelo animal, se realiza en varones menores de 25. En nuestras manos, que proporcionaron datos robusta y reproducible cuando se examina desde los analgesia o hiperalgesia puntos de vista. De vez en cuando, nos dimos cuenta de una tendencia a que las mujeres C57BL/6N para proporcionar respuestas más variables, tanto en el TIT y pruebas TPT. Aunque esta observación puedereflejan variaciones naturales vinculados a la condición hormonal de las mujeres, los mecanismos generales que subyacen diferencias de sexo en el dolor y la analgesia todavía siguen siendo motivo de controversia. Algunos aspectos de este debate caliente se presentarán brevemente en los próximos "Limitaciones de la técnica de la" sección.

Habituación Animal

Ratones primero se les permitió familiarizarse con las instalaciones de animales durante una semana. Similar a cualquier otro estudio de comportamiento, se realizó la prueba tras un período de 3 días de aclimatación-(Figura 1, etapa A). Como pruebas nociceptivas son sensibles al estrés, primero medidas pueden dar latencias más largas que las subsiguientes, especialmente en los ratones no habituado 26,27. El paso de la habituación permite también la obtención de valores de respuesta nociceptivas más estable dentro del mismo día y entre días Figuras 2 y 4. Para reducir los efectos circadianos en nociceptivo y analgésicosensibilidad 28,29, se llevaron a cabo todos los testeos 10 a.m.-04:00 h.

Selección de pruebas nociceptivas

Pruebas nociceptivas utilizan ya sea térmica, mecánica, química o estímulos eléctricos (revisión 26,27,30. Su elección es fundamental, ya diferentes modalidades nociceptivas pueden ser procesados ​​a través de diferentes nociceptores y fibras 18,31,32.

Seleccionamos la prueba de inmersión de la cola (TIT) 33, una versión modificada de la prueba de retirada de la cola clásica desarrollada por D'amour y Smith de 34 años, y la prueba de presión de la cola (TPT), una adaptación de Randall y Selitto 35, como ejemplos de térmica y modalidades mecánicas para estudiar la analgesia inducida por la morfina, la hiperalgesia y la tolerancia en ratones. Ambas pruebas se han utilizado ampliamente en ratas. Un tiempo de corte se definió sistemáticamente para evitar o limitar el riesgo de daños en los tejidos.

La morfina-induccióned la analgesia, la hiperalgesia y la tolerancia

La morfina, la-mu-opiáceos prototípico agonista, se seleccionó aquí, ya que es un potente analgésico y HIO-inductor, tanto en seres humanos y ratones 1,2,36. La morfina analgésico potencia se sabe que varían con cepas de ratones, vías de administración y las modalidades nociceptivas. En ratones C57BL / 6, la analgesia fiable se obtiene por lo general después de las inyecciones subcutáneas de morfina en el intervalo de 1-20 mg / kg de dosis 14,21. De acuerdo con ello, se optó por estudiar la analgesia aguda después de una sola administración (sc) de morfina a 5 mg / kg, cercano a su valor ED50 (7-20 mg / kg) evaluaron de nocicepción térmica 19,21.

La administración repetida de morfina se acompaña a menudo con la tolerancia analgésica (evidenciado ya sea desde un desplazamiento hacia la derecha de la curva dosis-respuesta o de una disminución de la amplitud de la respuesta analgésica o duración) y la hiperalgesia (una sensibilidad exacerbada a stimul dolorosai se evidencia de una disminución en el valor nociceptivo basal). Ambos fenómenos adversos dependen de cepas de roedores, de la naturaleza del compuesto que se selecciona de opiáceos y su dosificación, la duración del tratamiento y sobre las modalidades nociceptivas 21. Por ejemplo, los paradigmas experimentales para estudiar la tolerancia y la hiperalgesia consisten en la administración diaria de alta y constante (20 a 40 mg / kg por día) 22 o de la escalada (hasta 50 o incluso 200 mg / kg) 20,21 dosis de morfina. De acuerdo con ello, impulsamos el desarrollo de la hiperalgesia y la tolerancia en C57BL / 6 ratones a través de la administración de morfina diaria (5 mg / kg; sc) durante un período de 8 días. Se prefirió este dosis moderada de morfina durante más altos a una mejor utilización clínica de mímica.

Puesta en marcha de la ventana operativa TIT

Una posible escollo en TIT podría estar relacionado con el papel de la cola en la termorregulación de roedores 26,37. Cuando la temperatura ambiente es un factor clave en nociceptive variaciones en la respuesta, que debe mantenerse constante (aquí a 21 ° C) a lo largo de los experimentos 38. La intensidad del calor se suele crear para detectar una respuesta nociceptiva dentro de 5 a 10 seg 27. De hecho, las latencias mayores pueden aumentar el riesgo para el seguimiento de los movimientos de animales no relacionados con el estímulo nociceptivo, mientras que los más cortos pueden reducir la diferencia de poder de la prueba. Se realizó mediciones TIT a una temperatura fija de 48 ° C. Latencias de retirada de la cola estaban cerca de 9 segundos (valor basal nociceptivo) y varió de 4 seg (hiperalgesia) a 25 seg (analgesia máxima; cortado). Además de razones prácticas, las mediciones de valores de respuesta nociceptiva a una temperatura fija pueden implicar a priori el mismo repertorio de los nociceptores y circuitos, facilitando de este modo la interpretación de datos.

Modificaciones Posibles

Optimización de la ventana operativa TIT para la analgesia y la OIH MeasureMents

Al centrarse en una respuesta analgésica, los valores de referencia de baja (intensidad de calor superior) pueden favorecer la detección de un retraso en la respuesta. A su vez, para hacer frente a la consecuencia de un estímulo doloroso o el desarrollo de HIO, los valores de línea de base más altas (de intensidad de calor inferior; aquí 48 ° C) puede facilitar la detección de respuestas más rápidas Figura 4.

Aunque hemos encontrado morfina a 5 mg / kg una dosis conveniente para inducir una respuesta analgésica robusta Figura 3 y para promover (después de la administración repetida) hiperalgesia significativa la Figura 4, su dosificación se puede adaptar como se ha mencionado antes (paso crítico: la analgesia inducida por morfina-, hiperalgesia y la tolerancia). Por ejemplo, las dosis inferiores pueden ser utilizados para reducir la amplitud de la analgesia (evitando de este modo las limitaciones de corte), mientras que dosis más altas pueden ser elegidos para acelerar la aparición de hiperalgesia y aumentar su amplitud.

OveRall, la optimización de la "ventana nociceptivo 'debe adaptarse a los antecedentes genéticos de los ratones en estudio y tener en cuenta la posibilidad de que la participación de las matrices distintas de los nociceptores y circuitos.

Agonistas opiáceos alternativos (fentanilo, remifentanilo)

Aunque opiáceos utilizados clínicamente más dirigen a los receptores mu-opioide como agonistas, difieren considerablemente con respecto a sus propiedades farmacológicas, tanto in vitro como in vivo. Por ejemplo, el remifentanilo y el fentanilo, en contraste marcado con la morfina, se comportan como agonistas completos y promover la internalización de los receptores mu-opioides 39. Los analgésicos opiáceos, como la morfina y el fentanilo tiene una vida media en el rango de 40 horas, mientras que el remifentanilo tiene un ultra-corta vida media de varios minutos 41. En los seres humanos, la mejor evidencia para OIH es de los pacientes que recibieron opiáceos durante la cirugía, incluyendo acción corta compounds como remifentanilo 2,42. Por lo tanto, fentanilo y remifentanilo pueden ser herramientas valiosas también para estudiar el desarrollo de la hiperalgesia y la tolerancia en ratones, en virtud de teta y paradigmas TPT.

Modos alternativos de inducción de OIH (crónica vs administración aguda)

HIO se ve en los seres humanos y en modelos animales como consecuencia de la administración de opiáceos, ya sea en dosis muy bajas o extremadamente altas 1,2. Se presenta aquí en el desarrollo OIH tras el tratamiento crónico de los ratones con dosis moderadas de la morfina. Varios días de tratamiento de ratones C57BL/6N eran necesarias para evidenciar una hiperalgésico clara y reproducible Figura estado 4 inyecciones diarias de morfina podría ser sustituido adecuadamente con pellets de morfina implantados:. Sobre su eliminación, tanto de hiperalgesia térmica y alodinia mecánica han sido ya reportado en ratones 43. La infusión de opiáceos a través de una bomba de micro-osmótica es otra posibilidad 44. En roedores, la hiperalgesia de larga duración está también alcanzable después de la administración aguda de fentanilo utilizando un protocolo de imitar el uso de esta-agonista opioide mu en cirugía humana 36,45,46.

Limitaciones de la Técnica

Las especies animales y modelos para el dolor

Estudios comparativos de numerosas cepas de ratón aporta evidencia para grandes variaciones en las respuestas nociceptivas a estímulos dolorosos 17,31,47 y en los niveles de OIH después del tratamiento de 4 días morfina 22. Ya sea que los mecanismos subyacentes de procesamiento y modulación del dolor en modelos animales (ratones y ratas) son relevantes para los pacientes con dolor crónico sigue siendo una cuestión fundamental y se abrió. Por lo tanto, mucho cuidado debe prestarse a la interpretación de los datos de los animales y para su validez predictiva para los seres humanos 16.

Las diferencias de sexo en el dolor y la analgesia

ntent "> mayoría de los estudios preclínicos en modelos animales para el dolor han llevado a cabo en roedores machos 16,25,48. pesar de este sesgo de selección, la vista emergente fue considerar machos como mejores respondedores a analgésicos opiáceos 49,50, menos propensos a desarrollar opioide hiperalgesia 51,52 y más tolerantes a la morfina analgesia 53 que sus contrapartes femeninas (revisión 54)-inducida. Sin embargo, las diferencias entre sexos en cuanto a la nocicepción y fármacos analgésicos eficacia no se reanudan en tal "una talla única para todos" paradigma. De hecho, una gran cantidad de datos indica ahora que numerosas variables que pueden influir en la magnitud y dirección de las diferencias de sexo como la eficacia de opiáceos de drogas y la selectividad, ensayo nociceptivo, antecedentes genéticos, la edad, el estado-gonado hormonal o la interacción social 48,54. En los seres humanos, la clínica del dolor es más frecuente en las mujeres, pero si este hecho refleja las diferencias de sexo reales sigue siendo motivo de debate 48,55,56. For ejemplo, el análisis global de cincuenta ensayos clínicos, mostró que no hay diferencias significativas en las propiedades analgésicas entre géneros, mientras que el meta-análisis realizados en sujetos pacientes controlados señalado una eficacia significativamente mayor de opiáceos en mujeres 57. Esta última observación, lo que contrasta notablemente con lo que ha sido que se encuentra en los roedores, plantea de nuevo varias preguntas sobre el origen de tales divergencias 16,48,55,57. En total, existen diferencias de sexo en la analgesia y el mérito se centran más en los mecanismos subyacentes e implicaciones clínicas.

Acerca de las pruebas nociceptivas

La prueba de retirada de la cola es un reflejo espinal, pero puede estar sujeto a influencias supraespinales 58. TIT es relativamente fácil de realizar en ratas, pero requiere más experiencia en ratones. Una dificultad potencial es la de mantener el ratón en una postura correcta sin inducir estrés no deseado. El protocolo propuesto puede ser ajustado de acuerdo atamaño de la cohorte. 16 animales (8 de control y 8 tratadas) se manejan fácilmente en cuanto a la medición de sus valores de respuesta nociceptivas basales (utilizando TIT primero, a continuación, TPT para toda la serie de los ratones) se encuentra bajo preocupación. Monitoreo de cursos de tiempo de analgesia requiere el establecimiento de un horario de tiempo precisa y la evaluación del número máximo de animales que pueden ser probados (TIT primero, a continuación, TPT) dentro del intervalo de tiempo impartida (aquí 30 min). Toda la cohorte de animales puede así ser dividido en subgrupos para permitir que el experimentador de respetar las limitaciones cinéticas.

Importancia de la técnica con respecto a los métodos existentes / Alternative

HIO en ratas frente a ratón

Las ratas se han utilizado ampliamente para estudiar la analgesia opioide, la hiperalgesia y la tolerancia, después de la administración de opiáceos aguda o crónica 46,59-61. De hecho, por varias razones prácticas, se les puede considerar superior aratones como un modelo animal para los experimentos de dolor 16,61. Sin embargo, hasta hace poco, la generación de ratas modificadas genéticamente no era un procedimiento sencillo. Como numerosas cepas de ratones genéticamente modificados que ya están disponibles, el modelo ofrece la oportunidad de estudiar la contribución de numerosos genes individuales en OIH y el desarrollo de tolerancia en ratones.

TIT y TPT en comparación con otras pruebas nociceptivas

TIT es una variante de la prueba de retirada de la cola, la diferencia más evidente es la zona de estimulación. En contraste con el calor radiante, inmersión de la cola en agua caliente conduce a un aumento rápido y uniforme en su temperatura. En comparación con otras formas de pruebas nocicepción térmica (placa caliente o Hargreaves pruebas), TIT proporciona resultados bastante reproducibles tanto entre como dentro de los sujetos.

TPT es una prueba muy popular para el estudio de la nocicepción mecánica 26,27,35 lo que probablemente implicafibras nociceptivas distintas y transductores moleculares entonces TIT 32. Proporciona mediciones rápidas y fiables 59 pero requiere un poco de experiencia en el experimentador y grandes cohortes de animales. Como una alternativa a la analgesímetro utilizado en el presente estudio, otros procedimientos o aparatos depender de medidores de deformación no existe (revisión 27). TPT es el más adecuado para el estudio de la hiperalgesia mecánica mientras que los filamentos de von Frey se toman habitualmente para evaluar la alodinia mecánica (revisión 27).

Aplicaciones futuras o llegar después de dominar esta técnica

El modelo HIO / tolerancia experimental se presenta aquí se puede adaptar de manera similar a los ratones modificados genéticamente con el fin de evaluar el papel de los genes individuales en la modulación del dolor. También proporciona un sistema modelo para investigar la eficacia de agentes terapéuticos potenciales para aliviar el dolor crónico.

Disclosures

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Acknowledgments

Agradecemos al Dr. JL. Galzi (UMR7242 CNRS; Illkirch, Francia) por su apoyo.

Este trabajo fue apoyado por el CNRS, INSERM, Universidad de Estrasburgo, Alsacia BioValley y por subvenciones de Conectus, Agence National de la Recherche (ANR 08 EBIO 014,02) Conseil Régional d'Alsace (Pharmadol), Comunidad Urbana de Estrasburgo (Pharmadol), ICFRC (Pharmadol), OSEO (Pharmadol), Direction Générale des Entreprises (Pharmadol).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57BL/6N Tac mice Taconic, Ry, Denmark C57BL/6N Tac B6-M Male mice (25-30 g)
Morphine hydrochloride Francopia, Paris, France CAS no. 52-26-6 Delivered with special authorization
Syringes (Terumo) Dutscher, Brumath, France 050000 Polypropylene, sterile, volume: 1 ml
Needles (Terumo) Dutscher, Brumath, France 050101 26 G ½ (Terumo reference : NN2613RO1)
Mouse restrainer Home-made Two metallic grids (5 x 11 cm) assembled with adhesive tape and staples
Thermostated water bath GR150 Grant Instruments, Cambridge, UK GP 0540003
Analgesimeter Panlab, Barcelona, Spain LE 7306
Kaleidagraph software Synergy software, Reading, PA, USA Kaleidagraph 4.03  Scientific graphing
STATview software Free download, statistics

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Evaluación de la hiperalgesia inducida por la morfina y analgésicos Tolerancia en ratones utilizando térmicas y mecánicas Modalidades nociceptivos
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Elhabazi, K., Ayachi, S., Ilien, B., Simonin, F. Assessment of Morphine-induced Hyperalgesia and Analgesic Tolerance in Mice Using Thermal and Mechanical Nociceptive Modalities. J. Vis. Exp. (89), e51264, doi:10.3791/51264 (2014).

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