Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Bedömning av morfin-inducerad hyperalgesi och smärtstillande tolerans hos möss Använda Termiska och mekaniska Nociceptiva Modalities

Published: July 29, 2014 doi: 10.3791/51264
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Biotechnology and Cellular Signalling, UMR 7242 CNRS, Université de Strasbourg

Summary

Vi beskriver ett protokoll för att undersöka utvecklingen av opioid-inducerad hyperalgesi och tolerans hos möss. Baserat på mätningar av termiska och mekaniska nociceptiva svar naiva och morfinbehandlade djur, gör det möjligt att kvantifiera den ökade smärtkänslighet (hyperalgesi) och minskning av smärtlindring (tolerans) associerad med kronisk opiat administration.

Abstract

Opioid-inducerad hyperalgesi och tolerans allvarligt påverka den kliniska effekten av opiater som smärtstillande i djur och människor. De molekylära mekanismer som ligger bakom de båda fenomenen är inte väl förstådd och deras klargörande bör dra nytta av studier av djurmodeller och från utformningen av lämpliga försöksprotokoll.

Vi beskriver här ett metodiskt tillvägagångssätt för att framkalla, inspelning och kvantifiera morfin-inducerad hyperalgesi samt styrker analgetisk tolerans, med hjälp av svans-dopp och svans tryckprovning i vildtyp möss. Som visas i videon, är det protokoll som delas in i fem sekventiella steg. Hantering och tillvänjningsfasen tillåter en säker bestämning av basala nociceptiv respons hos djuren. Kronisk morfinadministrering inducerar signifikant hyperalgesi såsom visas genom en ökning av både termiska och mekaniska känslighet, medan jämförelse av analgesi tidsbanor efter akut eller repeated morfinbehandling tydligt visar utvecklingen av tolerans visar sig i en minskad analgetisk respons amplitud. Detta protokoll kan på liknande sätt anpassas till genetiskt modifierade möss för att utvärdera betydelsen av enskilda gener i moduleringen av nociception och morfin analgesi. Det ger också ett modellsystem för att undersöka effekten av potentiella terapeutiska medel för att förbättra opiat smärtstillande effekt.

Introduction

Opioid-inducerad hyperalgesi (OIH) och smärtstillande tolerans begränsar den kliniska effekten av opiater i djur och människor 1-3. Medverkan av pro-inflammatoriska 4,5 eller av pro-nociceptiva (anti-opioid) 6,7 system är för närvarande utforskas hypoteser. Att klarlägga mekanismerna bakom OIH och tolerans kräver en kombination av in vivo och in vitro-metoder, med hjälp av lämpliga djurmodeller, experimentella protokoll och molekylära verktyg.

Behavioral farmakologi är det dominerande paradigmet för att övervaka och kvantifiera smärtstillande och hyperalgetiska stater i försöksdjur (råttor, möss). Tillämpning av en skadlig retning (termisk, mekanisk eller kemisk) till en lämplig del av kroppen (baktassen, svans) hos djuret leder till en nocifensiva indragning som lätt kan scored.

Vi föreslår här ett metodiskt tillvägagångssätt för att framkalla, inspelning och kvantifiera OIH ochtolerans i möss av vildtyp, med användning av svans-dopp och svanstrycktest. Förfarandet möjliggör en enkel, känslig och reproducerbar bestämning av termiska och mekaniska nociceptiva larmvärden i möss. Som framgår i videon protokollet, C57BL / 6 möss upplever betydande hyperalgesi efter kronisk morfin administration och upprätthålla detta i flera dagar. Både termiska och mekaniska nociceptiva värden minskas betydligt, jämfört med baslinjen mätningar på naiva djur. Dessutom tillåter vår försöksuppställningen för att övervaka, utöver utvecklingen av OIH, nedgången av den smärtstillande respons på morfin (tolerans). Presenterade data stöder uppfattningen att hyperalgesi och tolerans kan innebära gemensamma cellulära och molekylära mekanismer 8,9, även om detta är omtvistat i litteraturen 1,10-12. Slutligen kan detta protokoll på liknande sätt anpassas till genetiskt modifierade möss för att utvärdera betydelsen av enskilda gener i modulaning av smärta. Det ger också ett modellsystem för att utvärdera effektiviteten av potentiella terapeutiska medel för att förbättra opiat smärtstillande effekter.

Protocol

Alla experiment utfördes i strikt överensstämmelse med de europeiska riktlinjerna för vård av försöksdjur (Europeiska gemenskapernas rådets direktiv 86/609/ECC) och de etiska riktlinjer för utredning av experimentell smärta i medvetna djur 13. Man C57BL6 / N Tac möss (10 veckor, 25 - 30 g) inhystes i en institutionell djuranläggning med en vårdpersonal som ansvarar för driften av anläggningen i enlighet med miljönormer. Djuren hålls i grupper (högst fem möss per bur) under en 12 tim / 12 tim ljus / mörker vid en konstant temperatur (21 ± 1 ° C) med fri tillgång till mat och vatten. Alla experiment utfördes vid samma tid på dagen (från 10:00 till 16:00) med användning av en kohort av 16 möss. Specifika material och utrustning är indikerade i tabellen Materials.

Ett förfarande i fem steg för att övervaka morfin inducerade-hyperalgesi och tolerans

Protokollet äruppdelad i fem sekventiella steg (AE) över en period av 15 dagar Figur 1.

. 1 Möss Handling (steg A, d-7 till d-5)

  1. Handtag möss och vänja dem att fritt komma in i som hindrar. Detta första steg minskar stress - på så sätt minimera förväxling med stress-induced smärtlindring - och låter djuren vara vana vid att utredaren, hantering och manipulation i musen rainer. Varje mus försiktigt hanteras under 5 minuter varje dag.

. Två Basal Nociceptiv svar (steg B, d-4-d-1)

  1. Mät svans abstinens latenser använder Tail Immersion Test (TIT):
    1. Ställ in termostaten på 48 ° C.
    2. Försiktigt införa musen in i som hindrar. Doppa den utskjutande 2/3 änden av svansen i vattenbad och börja kronometern.
    3. Stoppa kronometern så fort musen drar tillbaka sin svans från det varma vattnet och registrera latenstiden (i sek). I the avsaknad av nociceptiv reaktion, är en 25 sek cut-off används för att förhindra vävnadsskada.
    4. Ersätt mus i sin bur och testa nästa en till och med slutet av serien.
    5. Upprepa nociceptiva mätningar svars två gånger, med mätningar från djuren i samma ordning. Den nociceptiv respons latens (sek) för varje mus bestäms som medelvärdet för tre på varandra följande bestämningar.
  2. Mät mekaniska svar med hjälp av Tail Pressure Test (TPT)
    1. Försiktigt införa musen i rainer och placera svansen under koniska spets analgesimeter.
    2. Tryck på fot-switch för att tillämpa jämnt ökande tryck på den proximala delen av svansen tills den första nociceptiv reaktion (kämpar, gnissel) inträffar. Just nu djuret reagerar, spela in aktuellt kraft (i gram) som framkallar den nociceptiv respons. I avsaknad av någon reaktion, är en 600 g gränsvärde som används för att undvika tutfärda skador.
    3. Upprepa denna åtgärd på median och distala delar av svansen hos samma mus. Ett intervall på minst 30 sekunder observeras mellan åtgärder på en viss mus för att undvika anpassning eller stress bias. Ersätt mus i sin bur och testa nästa djur fram till slutet av serien (dvs. alla testas möss). Det nociceptiv värde (gram) för varje mus tas som medelvärde för tre mätningar (dvs proximala, median och distala delar av svansen på varje djur).
  3. Upprepa nociceptiv testning (alla procedurer som beskrivs i steg 2) på senare dagar, d-3 till d-1.

. 3 Mätning av morfin analgesi (steg C, d0)

  1. Definiera den bästa kombinationen av djur, som möjliggör val av två grupper (n = 8 per grupp) av möss med stabila och jämförbara genomsnittliga nociceptiva värden, beroende på vilket som nociceptiv modalitet (TIT eller TPT) övervägs. Detta värde kommer att tas som den basalanociceptiv respons av referens för framtida "Saline" och "Morfin" grupper.
  2. Mät kroppsvikt av varje djur.
  3. Bered en morfinlösning (0,5 mg morfin per ml) i steril fysiologisk saltlösning (NaCl 0,9%) för subkutan administrering (5 mg morfin per kg av djurets kroppsvikt).
  4. Mät nociceptiv respons latens (tas som tidpunkt 0) för varje mus för både "Saline" och "Morfin" grupper i TIT (alla stegen under 2.1 ovan). Mät sedan nociception i TPT (alla steg under 2.2 ovan).
  5. Injicera subkutant morfin (typiskt 0,25 ml av en 0,5 mg / ml morfinlösning per 25 g mus vikt) och koksaltlösning (0,25 ml per 25 g mus vikt) till "morfin" och "saltgrupper, respektive.
  6. Mät nociceptiva värden på TIT och TPT (alla procedurer som beskrivs ovan under steg 2,1 och 2,2, respektive) under en tid-kurs (30 min interval) för att bedöma morfin (5 mg / kg)-inducerad analgesi:
    1. Efter 30 min efter injektion, mät nociceptiv respons (enkelbestämning) för varje mus i "Saline" och "Morphine-grupper, med användning av TIT därefter TPT.
    2. Mät sedan nociceptiva responsvärden (TIT och TPT) i alla möss vid tidpunkter (i tim): 1-1.5-2-2.5-3 och 3,5 efter injektion.

4 Kronisk morfinbehandling - Morfin-inducerad hyperalgesi. (Steg D, d1 till d6)

  1. På dag: d1
    1. Mät nociceptiva responsvärden på TIT och TPT som beskrivits ovan (steg 2.1 och 2.2). Noggrant kommentera abstinens latenser och tryckgränser för varje djur.
    2. Bered en färsk morfinlösning som beskrivs i steg 3.2.
    3. Injicera subkutant morfin (5 mg / kg kroppsvikt) till hela "Morfin" grupp och fysiologisk saltlösning (0,25 ml per 25 g mus vikt) till "Saline"-gruppen. Låt the djur vila till nästa dag.
  2. På Dagar: D2, D3, D4, D5 och D6 upprepa de åtgärder som beskrivs i avsnitt 4.1

. 5 Bevis för smärtstillande tolerans (steg E, d7)

  1. Utvärdera morfin-inducerad smärtlindring efter den tid-kursen paradigm redan beskrivs i avsnitt 3.

6. Datainsamling och statistiska analyser

  1. Bedömning av Basal Nociceptiva svarsvärde (steg B)
    1. Beräkna för varje dag (över d-4 till d-1 period) medelvärdet ± SEM-värden (n = 8) för basala nociceptiva svar som ges från TIT och TPT inom "Saline" och "Morfin" grupper.
    2. Plot betyda basala nociceptiva värden som en funktion av tid (dag) för båda grupperna Figur 2.
  2. Analys av morfinanalgesi Time-kurs på dagarna d0 (steg C) och d7 (steg E)
    1. Beräkna, vid varje tidpunkt efter morfininjektion, medelvärde ± SEM-värden (n = 8) för nociceptiva svaren som ges från TIT (i sek) och TPT (ig) i varje grupp.
    2. Plot betyda nociceptiva gensvarvärdena som en funktion av tid för den "Saline" och "Morphine-grupperna på dag 0 Figur 3 och dag 7 Figur 5.
  3. Utveckling av morfin-inducerad hyperalgesi (steg D)
    1. Beräkna för varje dag (över d0-d7 behandlingsperioden) medelvärdet ± SEM-värden (n = 8) för basala nociceptiva larmvärden som ges från TIT och TPT inom "Saline behandlade" och "Morfin behandlade grupper.
    2. Plot betyda basala nociceptiva gensvarvärdena som en funktion av tid (dag) för den "saltlösningsbehandlade" och "Morphine-behandlade grupper Figur 4.
  4. Bevis för Analgetikum Tolerans (steg C och E)
    1. Bestäm ur morfin tidsförloppet eXperiment utförs vid d0 Figur 3 tidsvärdet (eller tidsintervall) som krävs för morfin för att framkalla en maximal analgetisk respons.
    2. Ta detta värde (vanligtvis 30 min) som referenstiden för att uppskatta åtmin d7 Figur 5 den nociception baslinjevärde (saltlösning-behandlade gruppen) och den faktiska analgetisk respons (morfin-behandlade gruppen) för att akut morfin.
    3. Nociceptiva värden vid tidpunkten 30 min från morfintidskurs experiment utförda vid d0 och d7 för koksaltbehandlade och morfin-behandlade grupperna, presenteras som histogram Figur 6.
    4. Statistik: Analysera data med hjälp av envägs upprepade mätningar ANOVA. De faktorer som variation var behandling (mellan individer) och tid (inom ämnet). För att kontrollera skillnader separat i varje grupp fick upprepade mätningar ANOVA utförs. Jämförelser mellan två grupper utfördes med användning av oparat t-test eller parat t-test, när så är lämpligt.
  5. Signifikansnivån är satt till P <0,05. Alla statistiska analyser utförs med hjälp av Statview Software.

Representative Results

Bedömning av Basal Nociceptiva Värden för naiva möss (steg B)

TIT och TPT sekventiellt appliceras på hela kohorten av möss (n = 16), vilket ger medel nociceptiva larmvärden. Bästa kombinationen av djur får en efterhands definition av två grupper (n = 8) av möss, kallas Saline och morfin, som visar likartade och stabila basala nociceptiva värden Figur 2. Likvärdigheten av de båda grupperna är giltiga oavsett nociceptiv testet ( TIT: Figur 2A; TPT: Figur 2B) som valdes.

Tidsförloppet för morfinanalgesi vid dag 0 (Steg C)

Morfin analgesi utvärderades efter en enda injektion (sc) för morfin (5 mg / kg) i naiva möss med användning av både TIT Figur 3A och TPT figur 3B. I båda testerna, statistiska analyser med ett sätt upprepade mätningar ANOVA reveal att det finns en signifikant interaktion mellan behandling och tid för TIT (F (7, 98) = 72, p <0,001) och TPT (F (7, 98) = 31, p <0,001). TIT och TPT dataanalyser med användning av upprepade mätningar ANOVA visar att det inte finns någon effekt av injektion av koksaltlösning (F (7, 49) = 0,49, p> 0,05) och F (7, 49) = 1,85, p> 0,05 respektive för TIT och TPT tester), medan morfin injektion inducerar en stark analgesi hos möss (F (7, 49) = 92,46, p <0,001) och F (7, 49) = 34,37, p <0,001 respektive för TIT och TPT tester). Den maximala analgetiska effekten av morfin uppnåddes efter 30 min i TIT och efter 60 min i TPT, jämfört med saltlösning injicerade kontroller (p <0,001, oparat t-test).

Upprepade Morfinadministrationer inducerar hyperalgesi i möss (Steg D)

Basal nociceptiva värden mättes varje dagföre saltlösning eller morfin administration (se protokollet). Såsom visas i fig. 4, en gång dagligen morfin administrationer över en 6 dagars behandlingsperiod inducerade en signifikant och progressiv sänkning av termiska (F (7, 56) = 11,6, p <0,001, upprepade mätningar ANOVA, fig 4A) och den mekaniska (f ( 7,56) = 15,55, p <0,001, upprepade mätningar ANOVA; figur 4B) basala nociceptiva värden. Hyperalgesi utvecklades snabbt som det började bli signifikant på dag 1 i TIT (p <0,01, oparade t-test, jämfört med saltlösning injicerade kontroller) och på dag 2 i TPT (p <0,05, oparade t-test, jämfört med koksaltlösning -injicerade kontroller).

Tidsförloppet för morfinanalgesi vid dag 7, efter kronisk morfinbehandling (Steg E)

På dag 7, var möss som fick dagliga morfin eller salthaltigt injektioner över en period 7-dagars (d0 till D6) undersöktes i TIT Figur 5A och TPT Figur 5B första för att de basala nociceptiva värden och sedan för deras analgetiska svaret på akut morfin (5 mg / kg, se.). I överensstämmelse med utvecklingen av hyperalgesi som visas i figur 4, den basala nociceptiv värdet (tid 0) hos möss, som under lång tid behandlades med morfin var signifikant lägre än den för saltlösning injicerade kontrollmöss (p <0,001, oparat t-test). Efter akut morfin, det nociceptiva svaret av kronisk morfin-behandlade gruppen signifikant, men endast något över den basala nociceptiv värde saltlösning injicerade kontrollmöss mättes vid 30 min i TIT och TPT (p <0,01 och p <0,05, oparat t -test, respektive) och vid 60 min i TIT (p <0,05, oparat t-test). Från 2 h efter morfinbehandling till slutet av experimentet, nociceptiva svaren returneras till lägre värden än de i kontrollmöss (p<0,001, oparat t-test).

Jämförelse av maximala analgetiska svar från möss till morfin före (dag 0) och efter kronisk morfinbehandling (Dag 7).

Nociceptiva tröskelvärden som presenteras i Figur 6 är från TIT (A) och TPT (B) utfördes 30 min efter salin eller morfininjektion såsom illustreras i figurerna 3 (dag 0) och 5 (dag 7). En kraftig minskning av morfin smärtlindring observerades hos möss efter kronisk morfinbehandling för 7 dagar jämfört med sin ursprungliga smärtlindring svar vid dag 0 i båda nociceptiva test (p <0,001 parat t-test). Dessa data visar att toleransen fick utvecklas i smärta överkänsliga djur.

Figur 1
Figur 1. En fem steg proförfarande för att övervaka morfin inducerade-hyperalgesi och tolerans. Protokollet är indelad i fem sekventiella steg (AE) under sammanlagt 15 dagar.

Figur 2
. Figur 2 Definition av de basala nociceptiva responsvärden (Steg B, d-4 till d-1). Svansen nedsänkning (TIT) (A) och svans tryck (TPT) (B) tester utförs på hela serien av djur för att utvärdera sina basala nociceptiva värden. Därefter två grupper av möss (n = 8), kallad "Saline" och "Morfin" grupper, definieras så att de uppvisar stabila och jämförbara genomsnitts nociceptiva värden, oavsett nociceptiv modalitet som bedöms.

Figur 3 Figur 3. Tidsförloppet för morfinanalgesi på dag 0 (steg C) i TIT (A) och TPT (B). Det basala nociceptiv respons värdet av möss bestämdes varje 30 min efter enkel morfin (5 mg / kg, se. ) eller injektioner av saltlösning. Data uttrycks som medelvärden ± SEM, n = 8 möss per grupp. * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001, oparat t-test i jämförelse med kontrollgruppen.

Figur 4
. Figur 4 Utveckling av hyperalgesi efter upprepad morfin administration (steg D, d1 till d6). Den basala nociceptiv värdet av möss bestämdes genom TIT (A) och TPT (B) en gång per dag före morfin (5 mg / kg,fm.) eller saltlösning administration. Data uttrycks som medelvärden ± SEM, n = 8 möss per grupp. * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001 genom oparat t-test i jämförelse med den saltlösningsbehandlade kontrollgruppen.

Figur 5
Figur 5. Tidsförloppet för morfin analgesi av kronisk-morfin-behandlade möss vid dag 7 (steg E) i TIT (A) och TPT (B). Möss som var kroniskt behandlas med morfin (svarta prickar) eller saltlösning (vita trianglar) från dag 0 till dag 6, fick på dag 7 en enda injektion av morfin (5 mg / kg, sc.) eller saltlösning, respektive. Den nociceptiv respons hos möss bestämdes var 30 min efter morfin eller saltlösning injektion. Data uttrycks som medelvärden ± SEM, n = 8 möss per grupp. * P <0,05, ** P & #60; 0,01 genom oparat t-test i jämförelse med den saltlösningsbehandlade kontrollgruppen. Felstaplar som inte överstiger symboler storlek är dolda.

Figur 6
Figur 6. Jämförelse av maximala analgetiska svaren från möss till morfin (5 mg / kg, sc.) Före (dag 0) och efter kronisk morfinbehandling (dag 7). Värdena som redovisas här är från experiment som visas i Figur 3 och Figur 5. Nociceptiva värden mättes med användning av TIT (A) och TPT (B) 30 min efter morfin eller saltlösning injektion. Data uttrycks som medelvärden ± SEM, n = 8 möss per grupp. *** P <0,001 genom parat t-test.

Discussion

Kritiska steg

Val av djurmodell för nociception mätningar

Variationen i nociceptiv och smärtstillande känslighet hos möss stammar har undersökts (recensioner 14-16) Omdömen använder olika smärtmodeller skiljer sig i deras etiologi (nociceptiva, inflammatorisk, neuropatisk), modalitet (termisk, kemisk, mekanisk), längd (akut, tonic, kronisk) och administrerings (kutan, subkutan, visceral). Jämfört med andra stammar, C57BL/6J ("J" för Jackson Laboratory) möss blev en populär djurmodell för smärta studier som de uppvisar en hög basal nociceptiv känslighet 17,18 och en måttlig smärtstillande respons på opiater 14,19. Efter kronisk morfinbehandling, de också utveckla betydande analgetisk tolerans 20,21, hyperalgesi 21,22 och beroende 20,23.

nt "> Här utfördes experiment på C57BL/6N Tac möss (" N "för National Institute of Health och" Tac "för Taconics gård), som hör till en separat gren av B6 härstamning. Även C57BL / 6 möss har varit långa betraktas som utbytbara, senare studier pekade på betydande beteendemässiga skillnader mellan C57BL/6J och C57BL/6N stammar 24. Särskilt den undre känsligheten hos de tre C57BL/6N substrains (inklusive Tac en) till akut termisk smärta kan betraktas som en fördel för att testa denna fenotyp.

Hanmöss valdes ut som den stora majoriteten av smärtstudier, med användning av möss som djurmodell, utförs på juvenila hanar 25. I våra händer, de som robust och reproducerbar uppgifter vid undersökning från smärtlindring eller hyperalgesi synpunkter. Ibland märkte vi en tendens till C57BL/6N honor för att ge fler rörliga svar, både i TIT och TPT tester. Även denna observation kanspegla naturliga variationer som är kopplade till den hormonella statusen av kvinnor, övergripande mekanismerna bakom könsskillnader i smärta och smärtlindring fortfarande en kontroversiell fråga. Vissa aspekter av denna heta debatt ska redovisas kortfattat i nästa "Begränsningar av tekniken" avsnittet.

Animal tillvänjning

Möss först får vänja sig vid djuranläggningen under en vecka. I likhet med alla andra beteende studie tester utförs efter en 3 dag-anpassningsperioden (figur 1, steg A). Som nociceptiva tester är känsliga för stress, får första åtgärderna ge längre latenser än senare sådana, särskilt i icke-vana möss 26,27. Den tillvänjning steg låter också erhållandet av stabilare nociceptiva larmvärden inom samma dag och mellan dagarna Figurerna 2 och 4. För att minska dygnsrytm effekter på nociceptiv och smärtstillandekänslighet 28,29 var alla provningar genomförts från 10:00 till 04:00.

Val av nociceptiva tester

Nociceptiva tester använder antingen termiska, mekaniska, kemiska eller elektriska stimuli. (Översyn 26,27,30 Deras val är viktigt eftersom olika nociceptiva modaliteter kan behandlas genom olika nociceptorerna och fibrer 18,31,32.

Vi valde svansen nedsänkningstest (TIT) 33, en modifierad version av den klassiska svans flick test som utvecklats av D'amour och Smith 34, och svansen trycktest (TPT), anpassat från Randall och Selitto 35, som exempel på termisk och mekaniska metoder för att studera morfin-inducerad smärtlindring, hyperalgesi och tolerans hos möss. Båda testerna har ofta använts i råttor. En avskuren tid definierades systematiskt för att undvika eller begränsa risken för vävnadsskada.

Morfin-induktionsed smärtlindring, hyperalgesi och tolerans

Morfin, den proto mu-opiatagonist, valdes här eftersom det är en potent analgetisk och OIH-inducerare, både i människor och möss 1,2,36. Morfin analgetisk potens är känd för att variera med möss stammar, administreringsvägar och nociceptiva modaliteter. I C57BL / 6 möss, är pålitlig smärtlindring erhålls vanligtvis efter subkutana injektioner av morfin på 1-20 mg / kg dosintervallet 14,21. Därför valde vi att studera akut smärtlindring efter en enstaka behandling (sc) av morfin på 5 mg / kg, nära dess ED50-värde (7-20 mg / kg) bedöms från termisk nociception 19,21.

Upprepad morfin administration är ofta tillsammans med smärtstillande tolerans (bevisas antingen från en högerförskjutning av dos-respons kurva eller från en minskning av smärtstillande respons amplitud eller varaktighet) och hyperalgesi (ett förvärrat känslighet för smärtsamma stimulJag framgår från en minskning i basal nociceptiv värde). Både negativa fenomen beror på gnagare stammar, på vilken typ av opiat förening som väljs och dess dosering, om behandlingstid och på nociceptiva modaliteter 21. Till exempel, experimentella paradigm för att studera tolerans och hyperalgesi består i daglig administrering av höga och konstanta (20 till 40 mg / kg per dag) 22 eller av eskalerande (upp till 50 eller till och med 200 mg / kg) 20,21 morfindoser. Därmed främjas vi utvecklingen av hyperalgesi och tolerans i C57BL / 6 möss genom daglig morfin administration (5 mg / kg, sc) under en 8-dagars period. Denna måttliga morfindos drogs framför högre dem till bättre härma klinik användning.

Ställ in av TIT operativa fönster

En möjlig fallgrop i TIT kan vara relaterat till den roll som svansen på värmereglering av gnagare 26,37. Eftersom omgivningstemperatur är en nyckelfaktor i nociceptive svarsvariationer, bör det hållas konstant (här vid 21 ° C) under hela experimenten 38. Värmeintensiteten vanligtvis inrättas för att upptäcka en nociceptiv svar inom 5-10 sek 27. I själva verket kan större latenser öka risken för övervakning av djurförflyttningar som saknar samband med den nociceptiv stimulans, medan kortare kan minska differential kraften av testet. Vi utförde TIT mätningar vid en fast temperatur av 48 ° C. Tail abstinens latenser var nära 9 sek (basal nociceptiv värde) och varierade från 4 sek (hyperalgesi) till 25 sek (maximal smärtlindring, avbröt). Förutom praktiska skäl, mätningar av nociceptiva responsvärden vid en fast temperatur kan a priori innebära samma repertoar av nociceptorer och kretsar, vilket underlättar tolkning av data.

Möjliga ändringar

Optimering av TIT operativa fönstret för smärtlindring och OIH MeasureMents

När vi fokuserar på ett smärtstillande respons, kan låga utgångsvärden (högre värmeintensitet) gynnar upptäckten av en fördröjning i svaret. I sin tur, att ta itu med följderna av en smärtsam stimulus eller utveckling av OIH, högre utgångsvärden (lägre värmeintensitet, här 48 ° C) kan underlätta upptäckten av snabbare svar Figur 4.

Även om vi hittade morfin på 5 mg / kg en lämplig dos för att framkalla en stark smärtstillande respons Figur 3 och främja (vid upprepad administrering) signifikant hyperalgesi Figur 4, kan dess dosen anpassas som tidigare nämnts (Critical steg: Morfin-inducerad smärtlindring, hyperalgesi och tolerans). Till exempel kan lägre doser användas för att minska analgesi amplitud (och därmed undvika cut-off begränsningar), medan högre doser kan väljas för att accelerera hyperalgesi insättande och öka dess amplitud.

OveRall, optimering av "nociceptiv fönstret" bör anpassas till den genetiska bakgrunden av möss som studeras och ta hänsyn till möjligheten för medverkan av olika matriser av nociceptors och kretsar.

Alternativa opiatagonister (fentanyl, remifentanyl)

Även om de flesta kliniskt använt opiater rikta mu-opioid receptor som agonister, skiljer de sig väsentligt med avseende på deras farmakologiska egenskaper både in vitro och in vivo. Exempelvis remifentanyl och fentanyl, i skarp kontrast med morfin, beter sig som fullständiga agonister och främja internalisering av my-opioida receptorer 39. Opiatanalgetika såsom morfin och fentanyl har halveringstider i storleksordningen timmar 40 medan remifentanyl har en ultra-kort halveringstid på flera minuter 41. Hos människa är bästa beviset för OIH från patienter som fick opiater under operation, inklusive kortverkande compounds såsom remifentanyl 2,42. Således kan fentanyl och remifentanyl vara värdefulla verktyg för att studera utvecklingen av hyperalgesi och tolerans hos möss under TIT och TPT paradigm.

Alternativa former av induktion av OIH (kronisk vs akut administrering)

OIH ses hos människor och djurmodeller som en följd av opiat administration, vare sig vid mycket låga eller extremt höga doser 1,2. Vi rapporterar här om OIH utveckling efter kronisk behandling av möss med måttliga doser av morfin. Flera dagars behandling av C57BL/6N möss var nödvändiga för att de tillför ett tydligt och reproducerbar hyperalgesiska statliga Figur 4 Dagliga morfininjektioner skulle vara tillräckligt ersättas med implanterade morfin pellets:. På deras avlägsnande, både termisk hyperalgesi och mekanisk allodyni har redan rapporterats i möss 43. Infusion av opiater genom en mikro-osmotiska pumpen är en annan möjlighet 44. Hos gnagare långvarig hyperalgesi är också möjligt efter akut administrering av fentanyl med hjälp av ett protokoll härma användningen av denna mu-opioid agonist i mänsklig kirurgi 36,45,46.

Begränsningar av Technique

Djurarter och modeller för smärta

Jämförande studier av många musstammar lagt fram bevis för att stora variationer i nociceptiva svar på smärtsamma stimuli 17,31,47 och i OIH nivåer efter 4-dagars morfinbehandling 22. Oavsett om mekanismerna bakom smärta bearbetning och modulering i djurmodeller (möss och råttor) är relevanta för patienter med kronisk smärta är fortfarande en grundläggande och öppen fråga. Därför bör stor försiktighet ägnas åt tolkningen av djurdata och deras prediktiva validitet för människor 16.

Könsskillnader i smärta och smärtlindring

ntent "> De flesta prekliniska studier på djurmodeller för smärta har genomförts på manliga gnagare 16,25,48. Trots denna selektionsfel, den framväxande uppfattning var att betrakta män som bättre svarade på opiatanalgetika 49,50, mindre benägna att utveckla opioid -inducerad hyperalgesi 51,52 och mer tolerant mot morfinanalgesi 53 än sina kvinnliga motsvarigheter (av 54). Men könsskillnader när det gäller nociception och smärtstillande läkemedel effekt inte återupptas i en sådan "en en storlek passar alla" paradigm. Faktum en rikedom av data visar nu att många variabler kan påverka storleken och riktningen av könsskillnader såsom opioid drog effektivitet och selektivitet, nociceptiv analys, genetisk bakgrund, ålder, gonado-hormonell status eller social interaktion 48,54. Hos människa klinisk smärta är vanligare hos kvinnor, men om detta faktum avspeglar faktiska könsskillnader förblir en fråga för debatt 48,55,56. For exempel global analys av femtio kliniska studier visade inga signifikanta skillnader i smärtstillande egenskaper mellan könen medan metaanalyser utförs på patienter-kontrollerade ämnen pekade på en betydligt större opioid effekt hos kvinnor 57. Den senare observationen, vilket markant kontrast till vad som varit finns i gnagare, väcker igen flera frågor om ursprunget för sådana avvikelser 16,48,55,57. Sammantaget existerar könsskillnader i smärtlindring och meriter ytterligare fokusera på bakomliggande mekanismer och kliniska implikationer.

Om nociceptiva tester

Svansen uttag testet är en spinal reflex, men det kan vara föremål för supraspinala influenser 58. TIT är relativt lätt att utföra på råttor men kräver mer kunskap hos möss. En potentiell svårighet är att hålla musen i en korrekt hållning utan att inducera oönskade stress. Den föreslagna protokollet kan justeras enligtkohort storlek. 16 djur (8 kontroll och 8 behandlas) hanteras enkelt så långt som mått på deras basala nociceptiva responsvärden (med TIT först, sedan TPT för hela serien av möss) är i oro. Övervakning smärtlindring tidsförlopp kräver inrättandet av en exakt tidsplan och utvärdering av det maximala antal djur som kan testas (TIT först, sedan TPT) inom den förmedlade tidsintervallet (här 30 min). Hela kohorten av djur kan således delas in i undergrupper för att låta försöksledaren att respektera kinetiska begränsningar.

Betydelsen av teknik med avseende på befintliga / alternativa metoder

OIH hos råttor kontra mus

Råttor har i stor utsträckning använts för att studera opioidanalgetika, hyperalgesi och tolerans efter akut eller kronisk opiat administration 46,59-61. Faktum är att för ett flertal praktiska skäl de kan anses överlägsenmöss som en djurmodell för smärta experiment 16,61. Men fram till nyligen var den generation av genetiskt modifierade råttor inte en enkel procedur. Eftersom ett stort antal genetiskt modifierade musstammar finns redan tillgängliga, erbjuder vår modell möjlighet att studera bidraget av ett stort antal enskilda gener i OIH och toleransutveckling hos möss.

TIT och TPT kontra andra nociceptiva tester

TIT är en variant av svansen flick test, är den mest uppenbara skillnaden är området för stimulering. I kontrast med strålningsvärme, leder neddoppning av svansen i varmt vatten till en snabb och likformig ökning av dess temperatur. Jämfört med andra former av termisk nociception testning (varmplatta eller Hargreaves test), ger TIT ganska reproducerbara resultat, både mellan och inom ämnen.

TPT är en mycket populär test för studiet av mekaniska nociception 26,27,35 vilket sannolikt innebärdistinkta nociceptiva fibrer och molekylära givare sedan TIT 32. Det ger snabba och pålitliga mätningar 59 men kräver viss expertis från försöksledaren och stora djur årskullar. Som ett alternativ till den analgesimeter som används i föreliggande studie, andra förfaranden eller anordning förlitar sig på töjningsgivare existerar (översyn 27). TPT är bäst lämpad för att studera mekanisk hyperalgesi medan von Frey filament tas normalt för att utvärdera mekanisk allodyni (recension 27).

Framtida tillämpningar eller Vägbeskrivning efter Maste denna teknik

Den experimentella OIH / tolerans modell vi presenterar här kan på liknande sätt anpassas till genetiskt modifierade möss för att utvärdera betydelsen av enskilda gener i modulering av smärta. Det ger också ett modellsystem för att undersöka effekten av potentiella terapeutiska medel för att lindra kronisk smärta.

Disclosures

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.

Acknowledgments

Vi tackar Dr JL. Galzi (UMR7242 CNRS, Illkirch, Frankrike) för hans stöd.

Detta arbete stöddes av CNRS, INSERM, Université de Strasbourg, Alsace BioValley och genom anslag från Conectus, Agence National de la Recherche (ANR 08 EBIO 014.02) Conseil Regional d'Alsace (Pharmadol), Communauté Urbaine de Strasbourg (Pharmadol), ICFRC (Pharmadol), OSEO (Pharmadol), Direction Générale des Entreprises (Pharmadol).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57BL/6N Tac mice Taconic, Ry, Denmark C57BL/6N Tac B6-M Male mice (25-30 g)
Morphine hydrochloride Francopia, Paris, France CAS no. 52-26-6 Delivered with special authorization
Syringes (Terumo) Dutscher, Brumath, France 050000 Polypropylene, sterile, volume: 1 ml
Needles (Terumo) Dutscher, Brumath, France 050101 26 G ½ (Terumo reference : NN2613RO1)
Mouse restrainer Home-made Two metallic grids (5 x 11 cm) assembled with adhesive tape and staples
Thermostated water bath GR150 Grant Instruments, Cambridge, UK GP 0540003
Analgesimeter Panlab, Barcelona, Spain LE 7306
Kaleidagraph software Synergy software, Reading, PA, USA Kaleidagraph 4.03  Scientific graphing
STATview software Free download, statistics

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Angst, M. S., Clark, J. D. Opioid-induced hyperalgesia. A qualitative systematic review. Anesthesiology. 104, 570-587 (2006).
  2. Chu, L. F., Angst, M. S., Clark, D. Opioid-induced hyperalgesia in humans. Molecular mechanisms and clinical considerations. Clin. J. Pain. 24, 479-496 (2008).
  3. Lee, M., Silverman, S., Hansen, H., Patel, V., Manchikanti, L. A comprehensive review of opioid-induced hyperalgesia. Pain Physician. 14, 145-161 (2011).
  4. Hutchinson, M. R., Shavit, Y., Grace, P. M., Rice, K. C., Maier, S. F., Watkins, L. R. Exploring the neuroimmunopharmacology of opioids: An integrative review of mechanisms of central immune signaling and their implications for opioid analgesia. Pharmacol. Rev. 63, 772-810 (2011).
  5. Wang, X., et al. Morphine activates neuroinflammation in a manner parallel to endotoxin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109, 6325-6330 (2012).
  6. Colpaert, F. C. System theory of pain and of opiate analgesia: No tolerance to opiates. Pharmacol. Rev. 48, 355-402 (1996).
  7. Simonnet, G., Rivat, C. Opioid-induced hyperalgesia: abnormal or normal pain. NeuroReport. 14, 1-7 (2003).
  8. Mao, J., Sung, B., Ji, R. R., Lim, G. Chronic morphine induces downregulation of spinal glutamate transporters: implications in morphine tolerance and abnormal pain sensitivity. J. Neurosci. 22, 8312-8323 (2002).
  9. King, T., Ossipov, M. H., Vanderah, T. W., Porreca, F., Lai, J. Is paradoxical pain induced by sustained opioid exposure an underlying mechanism of opioid antinociceptive tolerance. Neurosignals. 14, 194-205 (2005).
  10. DuPen, A., Shen, D., Ersek, M. Mechanisms of opioid-induced tolerance and hyperalgesia. Pain Management Nursing. 8, 113-121 (2007).
  11. Chu, L. F., et al. Analgesic tolerance without demonstrable opioid-induced hyperalgesia : A double-blinded, randomized, placebo-controlled trial of sustained-release morphine for treatment of chronic nonradicular low-back. 153, 1583-1592 (2012).
  12. Ferrini, F., et al. Morphine hyperalgesia gated through microglia-mediated disruption of neuronal Cl- homeostasis. Nature Neurosci. 16, 183-192 (2013).
  13. Zimmermann, M. Ethical guidelines for investigation of experimental pain in conscious animals. Pain. 16, 109-110 (1983).
  14. Mogil, J. S. The genetic mediation of individual differences in sensitivity to pain and its inhibition. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96, 7744-7751 (1999).
  15. Mogil, J. S., et al. Screening for pain phenotypes : Analysis of three congenic mouse strains on a battery of nine nociceptive tests. Pain. 126, 24-34 (2006).
  16. Mogil, J. S. Animal models of pain : progress and challenges. Nature Rev. Neurosci. 10, 283-294 (2009).
  17. Mogil, J. S., et al. Heritability of nociception I : Responses of 11 inbred mouse strains on 12 measures of nociception. Pain. 80, 67-82 (1999).
  18. Larivière, W. R., et al. Heritability of nociception. III. Genetic relationships among commonly used assays of nociception and hypersensitivity. Pain. 97, 75-86 (2002).
  19. Elmer, G. I., Pieper, J. O., Negus, S. S., Woods, J. H. Genetic variance in nociception and its relationship to the potency of morphine-induced analgesia in thermal and chemical tests. Pain. 75, 129-140 (1998).
  20. Eidelberg, E., Erspamer, R., Kreinick, C. J., Harris, J. Genetically determined differences in the effects of morphine on mice. Eur. J. Pharmacol. 32, 329-336 (1975).
  21. Kest, B., Hopkins, E., Palmese, C. A., Adler, M., Mogil, J. S. Genetic variation in morphine analgesic tolerance: A survey of 11 inbred mouse strains. Pharmacol. Biochem. Behav. 73, 821-828 (2002).
  22. Liang, D. -Y., Liao, G., Wang, J., Usuka, J., Guo, Y., Peltz, G., Clark, J. D. A genetic analysis of opioid-induced hyperalgesia in mice. Anesthesiology. 104, 1054-1062 (2006).
  23. Kest, B., Palmese, C. A., Hopkins, E., Adler, M., Juni, A., Mogil, J. S. Naloxone-precipitated withdrawal jumping in 11 inbred mouse strains : Evidence for common genetic mechanisms in acute and chronic morphine physical dependence. Neurosci. 115, 463-469 (2002).
  24. Bryant, C. D., et al. Behavioral differences among C57BL/6 substrains: Implications for transgenic and knockout studies. J. Neurogenet. 22, 315-331 (2008).
  25. Mogil, J. S., Chanda, M. L. The case for the inclusion of female subjects in basic science studies of pain. Pain. 117, 1-5 (2005).
  26. Le Bars, D., Gozariu, M., Cadden, S. W. Animal models of nociception. Pharm. Rev. 53, 597-652 (2001).
  27. Barrot, M. Tests and models of nociception and pain in rodents. Neurosci. 211, 39-50 (2012).
  28. Kavaliers, M., Hirst, M. Daily rythms of analgesia in mice: effects of age and photoperiod. Brain Res. 279, 387-393 (1983).
  29. Castellano, C., Puglisi-Allegra, S., Renzi, P., Oliverio, A. Genetic differences in daily rhythms of pain sensivity in mice. Pharmacol. Biochem., and Behavior. 23, 91-92 (1985).
  30. Sandkühler, J. Models and mechanisms of hyperalgesia and allodynia. Physiol. Rev. 89, 707-758 (2009).
  31. Mogil, J. S., et al. Heritability of nociception II. ‘Types’ of nociception revealed by genetic correlation analysis. Pain. 80, 83-93 (1999).
  32. Scherrer, G., et al. Dissociation of the opioid receptor mechanisms that control mechanical and heat. 137, 1148-1159 (2009).
  33. Janssen, P. A. J., Niemegeers, C. J. E., Dony, J. G. H. The inhibitory effect of fentanyl and other morphine-like analgesics on the warm water induced tail withdrawal reflex. Arzneimittelforsch. 13, 502-507 (1963).
  34. Amour, F. E., Smith, D. L. A method for determining loss of pain sensation. J. Pharmacol. Exp. Ther. 72, 74-79 (1941).
  35. Randall, L. O., Selitto, J. J. A method for measurement of analgesic activity on inflamed tissue. Arch. Int. Pharmacodyn. Ther. 111, 409-419 (1957).
  36. Elhabazi, K., et al. Involvement of neuropeptides FF receptors in neuroadaptative responses to acute and chronic opiate treatments. Br. J. Pharmacol. 165, 424-435 (2012).
  37. Berge, O. -G., Garcia-Cabrera, I., Hole, K. Response latencies in the tail-flick test depend on tail skin temperature. Neurosci. Lett. 86, 284-288 (1988).
  38. Benoist, J. -M., Pincedé, I., Ballantyne, K., Plaghi, L., Le Bars, D. Peripheral and central determinants of a nociceptive reaction: An approach to psychophysics in the rat. PLoS ONE. 3, e3125 (2008).
  39. Morgan, M. M., Christie, M. J. Analysis of opioid efficacy, tolerance, addiction and dependence from cell culture to human. Br. J. Pharmacol. 164, 1322-1334 (2011).
  40. Trescot, A. M., Datta, S., Lee, M., Hansen, H. Opioid pharmacology. Pain Physician. 11, S133-S153 (2008).
  41. Egan, T. D., et al. The pharmacokinetics of the new short-acting opioid remifentanil (GI87084B) in healthy adult male volunteers. Anesthesiology. 79, 881-892 (1993).
  42. Hansen, E. G., Duedahl, T. H., Rømsing, J., Hilsted, K. L., Dahl, J. B. Intra-operative remifentanil might influence pain levels in the immediate post-operative period after major abdominal surgery. Acta Anaesthesiol Scand. 49, 1464-1470 (2005).
  43. Li, X., Angst, M. S., Clark, J. D. A murine model of opioid-induced hyperalgesia. Mol. Brain Res. 86, 56-62 (2001).
  44. Varnado-Rhodes, Y., Gunther, J., Terman, G. W., Chavkin, C. Mu opioid analgesia and analgesic tolerance in two mouse strains. C57BL/6 and 129/SvJ. Proc. West Pharmacol. Soc. 43, 15-17 (2000).
  45. Celerier, E., et al. Long-lasting hyperalgesia induced by fentanyl in rats: preventive effect of ketamine. Anesthesiology. 92, 465-472 (2000).
  46. Celerier, E., Simonnet, G., Maldonado, R. Prevention of fentanyl-induced delayed pronociceptive effects in mice lacking the protein kinase C gamma gene. Neuropharmacol. 46, 264-272 (2004).
  47. Larivière, W. R., Chesler, E. J., Mogil, J. S. Transgenic studies of pain and analgesia: Mutation or background phenotype. J. Pharmacol. Exp. Ther. 297, 467-473 (2001).
  48. Mogil, J. S. Sex differences in pain and pain inhibition: multiple explanations of a controversial phenomenon. Nature Rev. Neurosci. 13, 859-866 (2012).
  49. Kest, B., Wilson, S. G., Mogil, J. S. Sex differences in supraspinal morphine analgesia are dependent on genotype. J. Pharmacol. Exp. Ther. 289, 1370-1375 (1999).
  50. Kest, B., Sarton, E., Dahan, A. Gender differences in opioid-mediated analgesia. Anesthesiology. 93, 539-547 (2000).
  51. Holtman, J. R., Wala, E. P. Characterization of morphine-induced hyperalgesia in male and female rats. Pain. 114, 62-70 (2005).
  52. Juni, A., et al. Sex differences in hyperalgesia during morphine infusion: effect of gonadectomy and estrogen treatment. Neuropharmacol. 54, 1264-1270 (2008).
  53. Craft, R. M., et al. Sex differences in development of morphine tolerance and dependence in the rat. Psychopharmacol. 143, 1-7 (1999).
  54. Bodnar, R. J., Kest, B. Sex differences in opioid analgesia, hyperalgesia, tolerance and withdrawal: central mechanisms of action and roles of gonadal hormones. Hormones Behav. 58, 72-81 (2010).
  55. Greenspan, J. D., et al. Studying sex and gender differences in pain and analgesia: A consensus report. Pain. 132, S26-S45 (2007).
  56. Fillingim, R. B., Ness, T. J. Sex-related hormonal influences on pain and analgesic responses. Neurosci. Biobehav. Rev. 24, 485-501 (2000).
  57. Niesters, M., et al. Do sex differences exist in opioid analgesia? A systematic review and meta-analysis of human experimental and clinical studies. Pain. 151, 61-68 (2010).
  58. Millan, M. J. Descending control of pain. Prog. Neurobiol. 66, 355-474 (2002).
  59. Celerier, E., Laulin, J. -P., Corcuff, J. -B., Le Moal, M., Simonnet, G. Progressive enhancement of delayed hyperalgesia induced by repeated heroin administration : A sensitization process. J. Neurosci. 21, 4074-4080 (2001).
  60. Simonin, F., et al. RF9, a potent and selective neuropeptide FF receptor antagonist, prevents opioid-induced tolerance associated with hyperalgesia. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 466-471 (2006).
  61. Wilson, S. G., Mogil, J. S. Measuring pain in the (knockout) mouse: big challenges in a small mammal. Behav. Brain Res. 125, 65-73 (2001).

Tags

Neurovetenskap möss nociception svans nedsänkningstest svans trycktest morfin smärtlindring opioid-inducerad hyperalgesi tolerans
Bedömning av morfin-inducerad hyperalgesi och smärtstillande tolerans hos möss Använda Termiska och mekaniska Nociceptiva Modalities
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Elhabazi, K., Ayachi, S., Ilien, B., … More

Elhabazi, K., Ayachi, S., Ilien, B., Simonin, F. Assessment of Morphine-induced Hyperalgesia and Analgesic Tolerance in Mice Using Thermal and Mechanical Nociceptive Modalities. J. Vis. Exp. (89), e51264, doi:10.3791/51264 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter