Summary
Veel mRNAs coderend mitochondriale eiwitten zijn geassocieerd met de mitochondriën buitenmembraan. We beschrijven een subcellulaire fractionering procedure gericht op isolatie van gist mitochondriën met de bijbehorende mRNA en ribosomen. Dit protocol kan worden toegepast op cellen onder verschillende omstandigheden gekweekt om de mechanismen van mRNA lokalisatie en translatie gelokaliseerd nabij de mitochondriën onthullen.
Abstract
De meeste van mitochondriale eiwitten worden gecodeerd in de kern en moet in het organel te worden geïmporteerd. Import kunnen optreden tijdens het eiwit wordt gesynthetiseerd in de buurt van de mitochondriën. Steun voor deze mogelijkheid wordt afgeleid uit recente studies, waarin veel mRNAs coderend mitochondriale eiwitten bleken gelokaliseerd naar de mitochondriën omgeving. Samen met eerdere demonstraties van ribosomen worden betrokken bij de buitenste membraan, suggereren deze resultaten een gelokaliseerde vertaalproces. Dergelijke gelokaliseerde vertaling kan efficiëntie invoer te verbeteren, bieden unieke regelgeving sites en gevallen van ectopische expressie te minimaliseren. Diverse methoden zijn gebruikt om de factoren en elementen die gelokaliseerd vertaling bemiddelen karakteriseren. Standaard daarvan is subcellulaire fractionering door differentiële centrifugatie. Dit protocol heeft het voordeel van isolatie van mRNA, ribosomen en eiwitten in een enkele procedure. Deze kunnen dan worden gekarakteriseerd door verschillende moleculaire en biochemical methoden. Bovendien kunnen transcriptomics en proteomics methoden toegepast op de resulterende materiaal, waardoor genoom-brede inzichten mogelijk. Het gebruik van gist als modelorganisme voor dergelijke studies heeft de voordelen van snelheid, kosten en eenvoud. Bovendien is de geavanceerde genetische hulpmiddelen en beschikbare deletiestammen vergemakkelijken verificatie van kandidaat factoren.
Introduction
Eukaryote cellen zijn georganiseerd in verschillende compartimenten met specifieke functies. Om zijn functie te vervullen, elk compartiment bevat een unieke set van eiwitten die essentieel zijn voor de activiteit. Een mogelijk mechanisme waardoor deze eiwitten benaderen hun compartiment is door gelokaliseerde vertaling 1,2. In deze werkwijze wordt het eiwit gesynthetiseerd op zijn bestemming door ribosomen en mRNA dat er zich. Onder de waarschijnlijke voordelen van gelokaliseerde vertaling zijn toegenomen efficiëntie van eiwit targeting, verminderde behoefte aan eiwit begeleiders, en het mogelijk maken de site-specifieke regulatie mechanismen. Ook kunnen gelokaliseerde mRNA en ribosomen een afgelegen reservoir van de vertaling machines zijn in gevallen van cellulaire stress, wanneer de algemene vertaling wordt geremd.
Mitochondriën werd in de afgelopen jaren een centraal model om gelokaliseerde vertaling studeren. De meeste mitochondriën eiwitten worden gecodeerd in de kern vertaald in het cytosol,en geïmporteerd in het organel. Verschillende lijnen van bewijs geven aan dat veel van deze eiwitten worden via een lokale vertaalproces. Aanvankelijk elektronenmicroscopie en biochemische fractionering studies gedetecteerd ribosomen verbonden mitochondriën 3-5. Deze studies werden vervolgens bevestigd in vivo door het werk op specifieke mRNA's, die werden gevonden te worden ingevoerd in een cotranslational manier 6,7. Genoom-brede studies van mRNA associatie met mitochondria is gebleken dat een aanzienlijk deel van mRNA's zijn gelokaliseerd in de mitochondriën omgeving 8-10. Sommige van deze mRNA's werden verder gekarakteriseerd in vivo fluorescentie werkwijzen, zoals vissen of MTAG 9,11. Een straight-forward interpretatie van deze vereniging is dat deze mRNA's dienen als templates voor gelokaliseerde vertaling.
De mechanismen waarmee deze mRNAs benaderen mitochondria onbekend. Noncoding domeinen (meest significantly 3 'UTR's) bleken betrokken te zijn bij mRNA vereniging naar de mitochondriën 12. Deze domeinen zijn waarschijnlijk dienen als een bindingsplaats voor RNA-bindende eiwitten die het vervoer mediëren. Studies in gist bleek dat een lid van de PUM-familie van eiwitten (Puf3) ondersteunt mRNA associatie met mitochondriën 8,13. Een aannemelijke rol Puf3, die gebaseerd is op functies van andere familieleden, te remmen translatie terwijl de mRNA onderweg 14. Zo kan mRNA in een getranslateerde toestand worden vervoerd, door RNA bindende eiwitten die interageren met coderende regio. Als alternatief, een grote hoeveelheid werk suggereert dat het vervoer plaatsvindt, terwijl het eiwit wordt gesynthetiseerd. In het bijzonder werden remmers aangetoond dat ze mRNA vereniging 8,13. Bovendien vertaalde functies zoals het AUG mitochondriale targeting sequentie (MTS) of ORF's werden vermeld om lokalisatie 8,11,15. Hsp70-familie eiwit chaperone en proteïne receptor op de mitochondriën buitenmembraan bleken ook ondersteuning mRNA vereniging verder impliceert dat gecodeerde eiwitten zijn belangrijk voor mRNA lokalisatie 16. Dit is consistent met een model waarbij de ribosoom nieuwe eiwit dient als erkenning element voor het richten van mRNA-ribosoom-eiwitcomplex de mitochondriën 17.
Gelokaliseerde vertaling buurt van de mitochondria werd bestudeerd door verschillende methoden, met inbegrip van elektronenmicroscopie (naar ribosomen visualiseren) 3, FISH 9, groen RNA (specifieke mRNA's detecteren) 11, en biochemische fractionering (zowel RNA en ribosomen detecteren) 10,18. Terwijl de eerste werkwijzen detecteren lokalisatie in vivo en kunnen visualisatie van het dynamische mogelijk, deze maakt de ontdekking van verschillende mRNA in een enkel experiment. Verder is het voor biochemische fractionering codering of niet-coderende domeinen hoeven niet al zijntreerd, dus hun specifieke rollen kunnen worden geëvalueerd. Biochemische fractionering is met succes gebruikt voor vele jaren, voor het isoleren van verschillende cellulaire compartimenten. Haar opdrachtgevers en beperkingen zijn goed ingeburgerd, en men kan gemakkelijk bestaande protocollen voor verschillende doeleinden te wijzigen. De nodige instrumentatie is standaard in vele laboratoria, daarom is meestal de eerste methode van keuze voor het bestuderen intracellulaire lokalisatie. We beschrijven een protocol dat was geoptimaliseerd voor isolatie van mRNA terwijl ribosomen verbonden met mitochondria. Dit protocol is dus optimaal voor het bestuderen van factoren die betrokken zijn bij gelokaliseerde vertaling buurt mitochondriën.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Mitochondriën Zuivering
Weeg de pellet van de cellen. Ongeveer 0,6 g worden verkregen van 100 ml cellen.
- Groei 100-150 ml gistcellen OD 600 = 1-1,5 bij 30 ° C op een fermenteerbare groeimedium, zoals galactose gebaseerde groeimedium, teneinde verrijken mitochondriën.
- Centrifugeer cellen bij 3000 g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en de bovenstaande vloeistof.
- Was de pellet met dubbel gedestilleerd water en centrifuge opnieuw. Verwijder het supernatant.
- Resuspendeer de pellet in 1 ml DTT buffer per 0,5 g cellen. Het is belangrijk om de cellen te behandelen met een reductiemiddel om de disulfidebindingen in de celwand te breken, waardoor hydrolyse verbeteren.
- Incubeer de cellen gedurende 10 minuten bij 30 ° C onder zacht schudden. Ondertussen weeg 6 mg zymolyase per 1 g van cellen en hang deze in zymolyase Buffer.
- Centrifugeer cellen bij 3000 g gedurende 5 min eent kamertemperatuur en gooi het supernatant.
- Resuspendeer de pellet in 1 ml buffer per zymolyase 0,15 g cellen. Niet vortex.
- Meet OD 600 van 10 pi aliquot van de cellen in 990 pl water.
- Voeg zymolyase (stap 1.5) om de cellen te glucosepolymeren hydrolyseren bij de β-1 ,3-glucan koppelingen en genereren sferoplasten. Uit deze stap moet sferoplasten in een isotone oplossing gehouden om lysis voorkomen.
- Incubeer cellen gedurende 15 minuten bij 30 ° C (voor optimale activiteit van zymolyase) onder zacht schudden. Hydrolyse van de celwand en sferoplasten generatie verifiëren, meng 10 pl van de cellen met 990 pl water. Sferoplasten verwachting lyseren door osmotische verschillen, en de OD 600 worden ten minste 10-voudig lager dan de waarde bepaald in stap 1.9. Zo niet, verder incubatie met zymolyase nog 15 minuten.
- Centrifugeer cellen bij 3000 g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur geroerd. Zorgvuldig diskaart de supernatant als de pellet kan onstabiel.
- Was sferoplasten met zymolyase Buffer en gooi het supernatant.
- Resuspendeer sferoplasten met 100 ml Recovery medium. Transfer sferoplasten een erlenmeyer en incubeer 1 uur bij 30 ° C met schudden. Dit herstel stap is noodzakelijk omdat tijdens de zymolyase behandeling vertaling is gearresteerd en mRNA lokalisatie is verstoord (Figuur 1B).
- Voeg 0,1 mg / ml CHX en overdracht sferoplasten een voorgekoeld 50 ml conische buis. CHX toevoeging is belangrijk om ribosomen worden betrokken bij mRNA bevriezen. Aldus wordt ribosomen mRNA associatie met mitochondriën gehandhaafd.
- Centrifugeer sferoplasten bij 3000 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C en de bovenstaande vloeistof.
- Twee keer wassen met koud Mannitol Buffer.
- Resuspendeer sferoplasten met 4 ml koud Mannitol Buffer en overbrengen naar een Dounce homogenisator van 15 ml voorzien van strakke montagestamper. Zachtjes breken sferoplasten met 15 slagen en breng het lysaat om een 13 ml buis.
- Centrifugeer het lysaat bij 1500 xg gedurende 6 min bij 4 ° C om kernen en ongebroken cellen neer.
- Breng de bovenste zorgvuldig naar een nieuwe buis. Zet opzij 1 ml (25%) van het monster als een niet-gefractioneerde monster ("Totaal" sample). Breng 50 ml van deze monster naar een nieuwe buis en voeg 15 ml 4X LSB voor western blot analyse. Neerslag RNA van de rest van de "Total" sample (zie Protocol nr. 3, RNA neerslag).
- Centrifugeer het supernatant bij 10.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C naar de mitochondriën pellet.
- Breng de bovenstaande (~ 3 ml) naar een nieuwe buis en houd het op ijs. Dit is de fractie "cytosolische". Breng 50 ml van deze monster naar een nieuwe buis en voeg 15 ml 4x LSB voor western blot analyse. Precipitaat RNA van de rest van de "Cytosolic" sample (zie ProtOCOL 3, RNA neerslag).
- Was de pellet met 3 ml Mannitol buffer en centrifugeer opnieuw bij 10.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C.
- Resuspendeer de pellet met 3 ml Mannitol Buffer. Dit monster bevat de mitochondriën, en aangeduid als fractie "Mitochondriën". Breng 50 ml van deze monster naar een nieuwe buis en voeg 15 ml 4x LSB voor western blot analyse.
2. RNA-extractie
- In elk monster een volume 8 M guanidinium-HCI en twee volumes 100% ethanol. Vortex en incubeer gedurende tenminste 2 uur bij -20 ° C.
- Centrifugeer de monsters bij 10.000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C. Gooi supernatant. Wees voorzichtig als de pellet instabiel zou kunnen zijn.
- Was de pellet met 70% EtOH.
- Resuspendeer de pellet met 400 ml RNase-vrij water en breng het monster naar een nieuwe Eppendorf buis.
- Neerslag het RNA opnieuw door 0,1 volume 3 M natrium acetaate pH 5,2 en twee volumes 100% EtOH. Vortex en incubeer gedurende tenminste 2 uur bij -20 ° C.
- Centrifugeer de monsters bij 20.000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant en was met 70% EtOH.
- Air droog de pellet en resuspendeer met RNase-vrij water. Store RNA monsters bij -80 ° C. Monsters kunnen worden gebruikt voor Northern analyse 19 of microarray-analyse 18 (zie Protocol 3).
3. Voorbereiden van de RNA voor microarray analyse
- Resuspendeer het mRNA uit stap 2.2 met 650 ml RNase-vrij water.
- Om eventuele resten van DNA of eiwitten te verwijderen, toe te voegen gelijk volume (650 ml) van zure fenol: chloroform (05:01, pH 4,7) en vortex krachtig. Centrifugeer bij maximale snelheid gedurende 2 minuten.
- Breng 500 ml van de bovenste fase (de waterfase) naar een nieuwe buis. Vermijd de interfase, zoals DNA bevat. Wees ook voorzichtig met het nemen van fenol, die de reverse transcriptie reactie kan remmen. </ Li>
- Het RNA monster bevat een aanzienlijke hoeveelheid heparine, dat een krachtige remmer van reverse transcriptase. Zo RT-PCR of microarray etiket moet worden verwijderd. Verwijder heparine door LiCl neerslag: voeg LiCl tot een eindconcentratie van 2 M en incubeer de monsters gedurende de nacht bij -20 ° C.
- Ontdooi de monsters bij 4 ° C en centrifugeer bij 20.000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C.
- Gooi voorzichtig het supernatant en was het pellet met 80% ethanol. Centrifugeer opnieuw zoals beschreven in stap 3.5.
- Verwijder het supernatant, de lucht drogen en resuspendeer de pellet in 150 ml RNase-vrij water.
- Om eventuele LiCI te verwijderen, precipitaat opnieuw met 0,1 volume 3 M natriumacetaat pH 5,3 en 3 volumes 100% ethanol. Incubeer bij -20 ° C gedurende ten minste 2 uur.
- Centrifugeer op topsnelheid gedurende 20 minuten bij 4 ° C. Was zorgvuldig de transparante pellet met 80% ethanol en drogen aan de lucht.
- Resuspendeer depellet met 25 ml RNase-vrij water en houd de monsters bij -80 ° C.
- Volg de stappen voor RNA etikettering en hybridisatie in 18,20 beschreven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dit protocol maakt scheiding van een-mitochondriën bevattende fractie van cytosolische componenten. De beste manier om het succes ervan te testen is naar Noord-analyse-en West-analyse (figuur 1) uit te voeren om monsters uit de verschillende isolement stappen. Drie parameters voor de isolatie kwaliteit zijn uit deze analyses. Ten eerste, of het RNA of eiwitten in de monsters intact - deze kunnen gedetecteerd als afzonderlijke banden in de analyses. Degradatie gebeurtenissen zal de verschijning van extra, kortere banden of vlekken veroorzaken. Ten tweede, het vergelijken van de signalen van elke stap met het signaal van de ingang (dus totaal) levert belangrijke informatie over de verliezen tijdens de bereiding. Ernstige schade wordt waargenomen als een significant verschil tussen de totale en de relatieve hoeveelheid signaal. Ten slotte, en meest belangrijke, kan de kwaliteit van de scheiding tussen mitochondriale en cytosole bestanddelen bepaald. Isolatie van intacte mitochondrieen resulteert in signaal mitochondriën getranscribeerd transcript alleen in de mitochondria fractie en niet in de cytosolische fractie (Figuur 1A). Bovendien zal eiwitten die mitochondria geassocieerde weergegeven door western blot alleen de mitochondria fractie en cytosolische eiwitten in de cytosolische fractie (Figuur 1B).
Figuur 1 toont twee extra resultaten die standaard voor dit protocol zijn: ten eerste, vereniging van nucleair gecodeerde mRNA's met mitochondriën varieert tussen genen. Men kan zien dat ACO1 mRNA, dat een mitochondriaal eiwit codeert, wordt meestal in de mitochondriën fractie, terwijl het mRNA dat codeert voor het cytosolisch eiwit actine (A1) is meestal in de cytosolische fractie (figuur 1C). Genoom-brede analyses bleek variatie tussen vele genen 8,10,21,22 en de basis voor deze diversiteit is onder uitgebreid onderzoek. Ten tweede, aanzienlijke hoeveelheden-ER-gerelateerde material zijn coisolated in het mitochondriale fractie. De mRNA coderend SEC61, die ER-geassocieerde, wordt gedetecteerd door Northern blot (figuur 1A) en het ER-membraan eiwit CUE1 wordt gedetecteerd door western blot (Figuur 1B). Dit kan een uitkomst van de bekende fysieke contacten tussen ER en mitochondria zijn. Terwijl verdere zuivering van mitochondria mogelijk is, kan het enige beperkingen voeren, deze worden besproken in de discussie.
Figuur 1. . Kwaliteit controle van isolatie Kwaliteit wordt getest op monsters die zijn genomen in drie representatieve stappen van de procedure: Voordat fractionering (Totaal [stap 1,20], T; cytosolfractie [stap 1.22], C, en mitochondriale fractie [stap 1.24], M). De monsters worden onderworpen aan de noordelijke analyse (. A, C) of Western analyse (B) A) Northern-analyse voor de volgende mRNA: COB is een RNA dat wordt getranscribeerd in de mitochondriën derhalve het signaal moet uitsluitend de mitochondriën. Zijn verschijning in de C-fractie zal aangeven van de mitochondriën lysis tijdens de bereiding. WERKW1 is een mRNA dat een cytosolisch eiwit codeert, en derhalve vertaald door cytosolische ribosomen en wordt meestal op de C-fractie. ACO1 een mRNA dat een eiwit dat wordt ingevoerd naar de mitochondriën codeert en wordt meestal in de mitochondriën fractie. SEC61 is een mRNA dat ER inwoner eiwit codeert, zijn aanwezigheid in de M-fractie wijst op de aanwezigheid van ER componenten in deze fractie. Het onderste paneel toont een methyleenblauw kleuring van de noordelijke membraan, is die twee rRNA (18S en 25S) worden gedetecteerd. Dit paneel toont aan dat aanzienlijke hoeveelheid ribosomen verschijnen in de M-fractie. B) West-analyse voor de following eiwitten: Por1 is een mitochondriën buitenste membraan eiwit dus het signaal is naar verwachting alleen in de M-fractie. Signaal in de C-fractie zal voorstellen dissociatie van mitochondriale componenten tijdens de bereiding. Hxk1 is een cytosolisch eiwit en CUE1 een ER eiwit. Beide rapporteren over de copurification van deze fracties met de mitochondriën fractie. Rpl39 is een ribosomaal eiwit, opnieuw het aantonen van ribosomen in beide fracties. Het paneel "Rpl39 zonder herstel", presenteert de fractionering van ribosomen als het protocol wordt uitgesloten van het herstel stap (stap 1.14). C) Northern analyse voor CCP1, een mRNA dat een eiwit dat wordt geïmporteerd in de mitochondriën codeert. De gehele gel wordt voorgelegd aan het gebrek aan kortere, afbraak ontstaan bands tonen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Technologische ontwikkelingen in de beeldvorming had hoge resolutie instrumenten opgeleverd om mRNA lokalisatie studeren. Vandaag de dag kan men de beweging van zelfs een enkele mRNA-molecuul te meten op de msec tijdschaal 23-26. Toch traditionele biochemische benaderingen, als hierboven beschreven, zijn ook informatief en de voorkeur in sommige gevallen. Biochemische isolatie kan zuivering van een groot repertoire van mRNA en eiwitten, en verdient daarom de voorkeur voor genoom-breed onderzoek. In een isolatie kan men volstaan mRNA niveaus verkrijgen karakterisering van duizenden genen mogelijk maken, hetzij door DNA microarrays of RNA-seq 18,27. Tegelijkertijd kan men eiwitten te isoleren en het uitvoeren van een proteoom analyse naar het proteoom te karakteriseren op mitochondriën 28. Biochemische fractioneringen worden aangepast aan mitochondriën te scheiden van andere cellulaire organellen, met name de ER 29. Dit kan voordelig zijn bij bepaalde typen cellen de hoge ruimtelijke overlaptussen ER en mitochondria belemmert lokalisatie microscopische analyses. Een belangrijk voordeel van biochemische fractioneringen is hun lage kosten, die analyse van vele verschillende monsters mogelijk maakt. Een aanverwant voordeel is eenvoud - biochemische fractionering, zoals hierboven beschreven, meestal niet moeizaam fluorescerende tagging van mRNA nodig, zoals het geval is in in vivo studies. Tenslotte zijn vele valkuilen en artefacten al gediagnosticeerd voor deze traditionele protocollen, dus de nodige controles zijn goed bekend.
De gepresenteerde protocol houdt een herstel (stap 1.14) dat de zymolyase behandeling volgt. Deze stap is essentieel, omdat de stress veroorzaakt tijdens de zymolyase behandeling leidt tot bijna onmiddellijke translationele arrestatie en ribosomen 'dissociatie van mRNA's. De werkelijke trigger voor ribosomen dissociatie kan elke van de stappen die in deze behandeling, namelijk het verwijderen van de koolstofbron, expoure te hoge g tijdens het centrifugeren, de behandeling met reducerende stoffen (DTT), celwand verwijdering door zymolyase of invoering van high osmotische omstandigheden; wordt elk van deze bekende een translationeel induceren. Deze translationele arrestatie waarschijnlijk invloed op de associatie van ribosomen met mitochondriën. Daarom vonden we dat mRNA associatie met mitochondriën laag na zymolyase behandeling en stijgt tijdens herstel (niet getoond).
De mitochondriale fractie die wordt geïsoleerd door dit protocol bevat een aanzienlijke hoeveelheid ER, zoals blijkt uit de aanwezigheid van verschillende ER merkers (bijv. Figuur 1). Een duidelijke wens is om ER componenten verder te verwijderen en zuivere mitochondriën te krijgen, met behulp van een van de verschillende standaard protocollen die hellingen 29-33 benutten. Echter, deze protocollen vereisen strippen van ribosomen van de mitochondria, hetzij vanwege de stressvolle zymolyase behandeling (Figuur 1B (dwz wanneer ribosomen associëren met de mitochondriën), zowel ER en mitochondria markers bezonken om dezelfde fractie. Dit is waarschijnlijk omdat de bijbehorende ribosomen verhullen hun verschillende dichtheden (gegevens niet getoond). Zo ribosoom associatiestudies, alternatieve werkwijzen voor mitochondriën isolatie moeten worden ontwikkeld.
Vele studies hebben echter de aanwezigheid van ER onderdelen is niet noodzakelijk problematisch. Vereniging van mRNA's die gevestigde mitochondriale eiwitten (bijv. coderenAconitase, ATP2, Oxa1) is waarschijnlijk met de mitochondriën en niet de ER component in deze ruwe voorbereiding. Het wordt daarom aanbevolen om een van deze typische mitochondriale mRNA als uitlezingen voor impact op mitochondriën gebruiken. Eiwitten die niet werden gecontroleerd zoals mitochondriale mag niet worden gebruikt als reporters, dit is met name van belang wanneer genoom-brede mRNA studies worden uitgevoerd (bijv. microarray analyse) in de verkeerde toegewezen mRNAs een fout kan invoeren.
De belangrijkste technische uitdaging van dit protocol is het minimaliseren van mRNA degradatie. Tijdens het gebruik van-RNAse vrij reagentia is altijd aangeraden, moet men niet vergeten dat na lysis van cellen enorme hoeveelheden RNAses worden losgelaten in de oplossing. Heparine is een zeer effectieve RNAse-remmer en wordt toegevoegd significante hoeveelheden. Wanneer grote extract volumes worden bereid, de relatief lage kosten biedt extra voordeel ten opzichte van andere RNAse-remmers. Heparine echter remt ook omgekeerde transcriptase, en daarom moet worden verwijderd voor studies die dergelijke enzymatische activiteit te betrekken (bijvoorbeeld RT-PCR of DNA microarray etikettering). Hierin presenteren we een verwijderingsprocedure die is gebaseerd op LiCl Neerslag (stap 3,4-3,10). Deze neerslag verwijdert effectief heparine, maar blijkbaar ook aanzienlijke hoeveelheden mRNA's verloren. Als alternatief zijn er diverse spin-kolommen die worden verondersteld om heparine uit RNA monsters nemen, maar we hadden een beperkt succes met deze.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Wij danken Drs. Erez Eliyahu, Daniel Melamed, Ophry Pines en Doron Rapaport voor hulp en commentaar tijdens de oprichting van dit protocol. Dit werk wordt gefinancierd door de ISF (licentienummer 1193-1109).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yeast Extract | |||
| BactoPeptone | |||
| Galactose | Do not autoclave Galactose | ||
| Growth medium | For mitochondrial enrichment, you should use any nonfermentable carbon source, such as Galactose-based growth medium sterilized 1% Yeast Extract, 2% BactoPeptone, 2% Galactose | ||
| 0.1 M Tris-HCl, pH 9.4 | |||
| 30 mM Tris-HCl, pH 7.6 | |||
| Dithiothreitol (DTT) | |||
| 10 mM DTT Buffer | 0.1 M TrisHCl pH 9.4, 10 mM Dithiothreitol (DTT). Make fresh every time | ||
| 1.2 M Sorbitol | |||
| 4 mM KH2PO4 | |||
| 16 mM K2HPO4 | |||
| 0.2 μm filter | |||
| Zymolyase Buffer | 1.2 M Sorbitol, 4 mM KH2PO4 , 16 mM K2HPO4. Filter this buffer (0.2 μm) and keep at room temperature for future use | ||
| Zymolyase 20T | 20,000 U/g | ||
| Recovery medium | Galactose-based growth medium supplemented with 1 M Sorbitol | ||
| 0.1 mg/ml Cycloheximide (CHX) | |||
| 0.6 M Mannitol | |||
| 5 mM MgAc | |||
| 100 mM KCl | |||
| 0.5 mg/ml Heparin | |||
| 1 mM Phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) | |||
| Mannitol Buffer | 0.6 M Mannitol, 30 mM Tris-HCl pH7.6, 5 mM MgAc, 100 mM KCl. Add freshly: 0.5 mg/ml Heparin, 0.1 mg/ml CHX and 1mM (PMSF). Filter this buffer and use it ice-cold | ||
| 8 M Guanidinium-HCl | |||
| 100% and 70% Ethanol (EtOH) | |||
| 3 M Sodium Acetate, pH 5.2 | |||
| 10 M LiCl stock solution | |||
| 250 mM Tris HCl pH 6.8 | |||
| SDS | |||
| Glycerol | |||
| β-Mercaptoethanol | |||
| Bromophenol blue | |||
| 4x LSB | 250 mM Tris HCl pH 6.8, 8% SDS, 40% Glycerol, 20% β-mercaptoethanol, and 0.02% Bromophenol blue | ||
| Dounce homogenizer of 15 ml capacity equipped with tight fitting pestle |
References
- Holt, C. E., Bullock, S. L. Subcellular mRNA localization in animal cells and why it matters. Science. 326, 1212-1216 (2009).
- Donnelly, C. J., Fainzilber, M., Twiss, J. L. Subcellular communication through RNA transport and localized protein synthesis. Traffic. 11, 1498-1505 (2010).
- Kellems, R. E., Allison, V. F., Butow, R. A. Cytoplasmic type 80 S ribosomes associated with yeast mitochondria. II. Evidence for the association of cytoplasmic ribosomes with the outer mitochondrial membrane in situ. J. Biol. Chem. 249, 3297-3303 (1974).
- Kellems, R. E., Butow, R. A. Cytoplasmic type 80 S ribosomes associated with yeast mitochondria. 3. Changes in the amount of bound ribosomes in response to changes in metabolic state. J. Biol. Chem. 249, 3304-3310 (1974).
- Suissa, M., Schatz, G. Import of proteins into mitochondria. Translatable mRNAs for imported mitochondrial proteins are present in free as well as mitochondria-bound cytoplasmic polysomes. J. Biol. Chem. 257, 13048-13055 (1982).
- Fujiki, M., Verner, K. Coupling of cytosolic protein synthesis and mitochondrial protein import in yeast. Evidence for cotranslational import in vivo. J. Biol. Chem. 268, 1914-1920 (1993).
- Yogev, O., Karniely, S., Pines, O. Translation-coupled translocation of yeast fumarase into mitochondria in vivo. J. Biol. Chem. 282, 29222-29229 (2007).
- Eliyahu, E., et al. Tom20 mediates localization of mRNAs to mitochondria in a translation-dependent manner. Mol. Cell. Biol. 30, 284-294 (2010).
- Garcia, M., et al. Mitochondria-associated yeast mRNAs and the biogenesis of molecular complexes. Mol. Cell. Biol. 18, 362-368 (2007).
- Marc, P., et al. Genome-wide analysis of mRNAs targeted to yeast mitochondria. EMBO Rep. 3, 159-164 (2002).
- Gadir, N., Haim-Vilmovsky, L., Kraut-Cohen, J., Gerst, J. E. Localization of mRNAs coding for mitochondrial proteins in the yeast Saccharomyces cerevisiae. RNA. 17, 1551-1565 (2011).
- Margeot, A., et al. In Saccharomyces cerevisiae, ATP2 mRNA sorting to the vicinity of mitochondria is essential for respiratory function. J EMBO. 21, 6893-6904 (2002).
- Saint-Georges, Y., et al. Yeast mitochondrial biogenesis: a role for the PUF RNA-binding protein Puf3p in mRNA localization. PloS one. 3, (2008).
- Quenault, T., Lithgow, T., Traven, A. PUF proteins: repression, activation and mRNA localization. Trends Cell Biol. 21, 104-112 (2011).
- Garcia, M., Delaveau, T., Goussard, S., Jacq, C. Mitochondrial presequence and open reading frame mediate asymmetric localization of messenger RNA. EMBO Rep. 11, 285-291 (2010).
- Eliyahu, E., Lesnik, C., Arava, Y. The protein chaperone Ssa1 affects mRNA localization to the mitochondria. FEBS Lett. 586, 64-69 (2012).
- Ahmed, A. U., Fisher, P. R. Import of nuclear-encoded mitochondrial proteins: a cotranslational perspective. Int. Rev. Cell Biol. 273, 49-68 (2009).
- Eliyahu, E., Melamed, D., Arava, Y. Genome-wide analysis of RNA extracted from isolated mitochondria. Methods Mol. Biol. 714, 287-299 (2011).
- Eldad, N., Yosefzon, Y., Arava, Y. Identification and characterization of extensive intra-molecular associations between 3'-UTRs and their ORFs. Nucleic Acids RES. 36, 6728-6738 (2008).
- Melamed, D., Arava, Y. Genome-wide analysis of mRNA polysomal profiles with spotted DNA microarrays. Methods Enzymol. 431, 177-201 (2007).
- Margeot, A., et al. Why are many mRNAs translated to the vicinity of mitochondria: a role in protein complex assembly. Gene. 354, 64-71 (2005).
- Mathieu, L., Marsy, S., Saint-Georges, Y., Jacq, C., Dujardin, G. A transcriptome screen in yeast identifies a novel assembly factor for the mitochondrial complex III. Mitochondrion. 11, 391-396 (2011).
- Hocine, S., Raymond, P., Zenklusen, D., Chao, J. A., Singer, R. H. Single-molecule analysis of gene expression using two-color RNA labeling in live yeast. Nat. Methods. 10, 119-121 (2013).
- Park, H. Y., Buxbaum, A. R., Singer, R. H. Single mRNA tracking in live cells. Methods Enzymol. 472, 387-406 (2010).
- Thompson, M. A., Casolari, J. M., Badieirostami, M., Brown, P. O., Moerner, W. E. Three-dimensional tracking of single mRNA particles in Saccharomyces cerevisiae using a double-helix point spread function. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 17864-17871 (2010).
- Tyagi, S. Imaging intracellular RNA distribution and dynamics in living cells. Nat. Methods. 6, 331-338 (2009).
- Garcia, M., Darzacq, X., Devaux, F., Singer, R. H., Jacq, C. Yeast mitochondrial transcriptomics. Methods Mol. Biol. 372, 505-528 (2007).
- Reinders, J., Sickmann, A. Proteomics of yeast mitochondria. Methods Mol. Biol. 372, 543-557 (2007).
- Meisinger, C., Sommer, T., Pfanner, N. Purification of Saccharomcyes cerevisiae mitochondria devoid of microsomal and cytosolic contaminations. Anal. Biochem. 287, 339-342 (2000).
- Glick, B. S., Pon, L. A. Isolation of highly purified mitochondria from Saccharomyces cerevisiae. Methods Enzymol. 260, 213-223 (1995).
- Boldogh, I. R., Pon, L. A. Purification and subfractionation of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. Methods Cell Biol. 80, 45-64 (2007).
- Rieder, S. E., Emr, S. D., et al. Isolation of subcellular fractions from the yeast Saccharomyces cerevisiae. Current protocols in cell biology / editorial board. Bonifacino, J. S. 8, (2001).
- Diekert, K., de Kroon, A. I., Kispal, G., Lill, R. Isolation and subfractionation of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. Methods Cell Biol. 65, 37-51 (2001).
