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Biology

Isolamento di mRNA associati con mitocondri di lievito per studiare i meccanismi di traduzione localizzata

Published: March 14, 2014 doi: 10.3791/51265

Summary

Molti mRNA codificanti proteine ​​mitocondriali sono associate alla membrana esterna mitocondriale. Descriviamo una procedura di frazionamento subcellulare volta a isolamento dei mitocondri di lievito con i suoi mRNA e ribosomi associati. Questo protocollo può essere applicato a cellule cresciute in condizioni diverse per rivelare meccanismi di localizzazione mRNA e traduzione localizzata vicino ai mitocondri.

Abstract

La maggior parte delle proteine ​​mitocondriali sono codificati nel nucleo e devono essere importati nel organello. Import può verificarsi durante la proteina è sintetizzata nei pressi dei mitocondri. Il supporto per questa possibilità deriva da studi recenti, in cui molti mRNA codificanti proteine ​​mitocondriali hanno dimostrato di essere localizzato nei pressi mitocondri. Insieme con dimostrazioni precedenti di associazione ribosomi 'con la membrana esterna, questi risultati suggeriscono un processo di traduzione localizzata. Tale traduzione localizzata può migliorare l'efficienza di importazione, di fornire siti di regolazione unici e ridurre al minimo i casi di espressione ectopica. Diversi metodi sono stati utilizzati per caratterizzare i fattori ed elementi che mediano traduzione localizzata. Standard tra questi è frazionamento subcellulare mediante centrifugazione differenziale. Questo protocollo ha il vantaggio di isolamento di mRNA, ribosomi e proteine ​​in una singola procedura. Questi possono poi essere caratterizzata da diverse molecolare e biMetodi ochemical. Inoltre, trascrittomica e proteomica metodi possono essere applicati al materiale risultante, permettendo quindi intuizioni genoma di ampiezza. L'utilizzo di lievito come organismo modello per tali studi ha i vantaggi di velocità, costi e semplicità. Inoltre, gli strumenti genetici avanzati e ceppi di delezione disponibili agevolare la verifica dei fattori candidati.

Introduction

Le cellule eucariotiche sono organizzate in compartimenti distinti aventi funzioni specifiche. Per realizzare la sua funzione, ciascun compartimento contiene un insieme unico di proteine ​​che sono essenziali per la sua attività. Un possibile meccanismo attraverso il quale queste proteine ​​si avvicinano loro scompartimento è di 1,2 traduzione localizzata. In questo processo, la proteina è sintetizzata a destinazione ribosomi e mRNA che si trovano lì. Tra i probabili vantaggi di una versione localizzata sono aumentati efficienza della proteina targeting, ridotto bisogno di accompagnatori di proteine, e consentendo meccanismi di regolazione site-specific. Inoltre, mRNA e ribosomi in lingua possono essere un serbatoio appartata di macchinari traduzione in casi di stress cellulare, quando la traduzione generale è inibita.

I mitocondri è diventato negli ultimi anni un modello centrale per lo studio di traduzione localizzata. La maggior parte delle proteine ​​mitocondri sono codificate nel nucleo, tradotto nel citosol,e importati nel organello. Varie evidenze indicano che molte di queste proteine ​​sono prodotte attraverso un processo di traduzione locale. Inizialmente, gli studi di microscopia elettronica e di frazionamento biochimico rilevati ribosomi associati con i mitocondri 3-5. Questi studi dove poi corroborati in vivo dal lavoro su specifici mRNA, che sono stati trovati ad essere importati solo in modo 6,7 cotranslational. Studi genoma di ampiezza di mRNA associazione con mitocondri rivelato che una frazione significativa di mRNA sono localizzate ai mitocondri vicinanze 8-10. Alcuni di questi mRNA sono stati ulteriormente caratterizzati dal vivo fluorescenza metodi, come il pesce o MTAG 9,11. Un'interpretazione straight-forward di questa associazione è che questi mRNA servono come modelli per la traduzione localizzata.

I meccanismi con cui questi mRNA avvicinano i mitocondri sono sconosciute. Domini non codificanti (più significantly 3 'UTR) hanno dimostrato di essere coinvolti in mRNA associazione ai mitocondri 12. Questi domini sono suscettibili di servire come un sito di legame di RNA-binding proteins che mediano il loro trasporto. Gli studi in lievito hanno rivelato che un membro della famiglia PUM delle proteine ​​(Puf3) supporta mRNA associazione con mitocondri 8,13. Un ruolo plausibile per Puf3, che si basa su funzioni di altri membri della famiglia, è quello di inibire traduzione mentre il mRNA è rotta 14. Così, mRNA possono essere trasportati in uno stato nontranslated, da RNA proteine ​​leganti che interagiscono con le regioni non codificanti. In alternativa, un grande corpo di lavoro suggerisce che il trasporto avviene mentre la proteina viene sintetizzata. In particolare, gli inibitori di traduzione sono stati mostrati ad incidere mRNA associazione 8,13. Inoltre, caratteristiche tradotte come l'AUG, sequenza di targeting mitocondriale (MTS) o regioni ORF sono stati indicati come ausilio nella localizzazione 8,11,15. Hsp70-famiglia di proteine ​​chaperone e proteina recettore sulla membrana esterna mitocondriale anche stati mostrati per sostenere associazione mRNA, ulteriormente implicando che funzioni codificate proteine ​​sono importanti per la localizzazione mRNA 16. Questo è coerente con un modello in cui la proteina-ribosoma emergente serve come elemento di riconoscimento per il targeting complesso mRNA-ribosoma-proteina ai mitocondri 17.

Traduzione localizzata vicino mitocondri è stato studiato con vari metodi, tra cui la microscopia elettronica (per visualizzare ribosomi) 3, FISH 9, RNA verde (per rilevare specifici mRNA) 11, e frazionamento biochimico (a rilevare sia RNA e ribosomi) 10,18. Mentre i metodi precedenti rilevano localizzazione in vivo e può permettere la visualizzazione delle dinamiche di trasporto, quest'ultimo permette la rilevazione di molti mRNA differenti in un singolo esperimento. Inoltre, per i domini biochimica codifica frazionamento o non codificanti non hanno bisogno di essere alfiltranti quindi i loro ruoli specifici può essere valutato. Frazionamento biochimico è stato utilizzato con successo per molti anni, per l'isolamento di molti compartimenti cellulari diversi. I suoi principi e le limitazioni sono ben stabiliti, e si può facilmente modificare i protocolli esistenti per scopi diversi. La strumentazione necessaria è standard in molti laboratori, quindi di solito è il primo metodo di scelta per studiare la localizzazione intracellulare. Descriviamo un protocollo che è stato ottimizzato per l'isolamento di mRNA mentre ribosomi sono associati con i mitocondri. Questo protocollo è quindi ottimale per studiare fattori coinvolti in una versione localizzata vicino mitocondri.

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Protocol

1. I mitocondri Purificazione

Pesare il pellet di cellule. Circa 0,6 g si ottengono da cellule di 100 ml.

  1. Crescere 100-150 ml di cellule di lievito di OD 600 = 1-1.5 al 30 ° C su un terreno di crescita non fermentabili, come mezzo di crescita a base-galattosio, per arricchire di mitocondri.
  2. Centrifugare le cellule a 3.000 xg per 5 minuti a temperatura ambiente e scartare il surnatante.
  3. Lavare il pellet con acqua bidistillata e centrifugare di nuovo. Scartare il surnatante.
  4. Risospendere il pellet in 1 ml DTT tampone in 0,5 g di cellule. È importante trattare le cellule con un agente riducente per rompere i legami disolfuro all'interno della parete cellulare, migliorando così idrolisi.
  5. Incubare le cellule per 10 min a 30 ° C con un leggero scuotimento. Nel frattempo, pesare 6 mg zymolyase per 1 g di cellule e di sospendere in Zymolyase Buffer.
  6. Centrifugare le cellule a 3.000 xg per 5 min atemperatura t camera e scartare il surnatante.
  7. Risospendere il pellet in 1 ml di tampone per Zymolyase 0,15 g di cellule. Non vortex.
  8. Misurare OD 600 di 10 microlitri aliquota di cellule in 990 ml di acqua.
  9. Aggiungere Zymolyase (passo 1.5) alle cellule di idrolizzare polimeri del glucosio a β-1 ,3-glucano collegamenti e generare sferoplasti. Da questo punto, sferoplasti devono essere conservati in una soluzione isotonica per evitare lisi.
  10. Incubare le cellule per 15 min a 30 ° C (per attività ottimale di zymolyase) agitando delicatamente. Per verificare idrolisi della parete cellulare e sferoplasti generazione, mescolare 10 ml di cellule con 990 ml di acqua. Sferoplasti sono attesi per lisare dovuto la differenza osmotica, e la OD 600 devono essere almeno 10 volte inferiore al valore determinato nella fase 1.9. In caso contrario, continuare l'incubazione con zymolyase per altri 15 min.
  11. Cellule centrifugare a 3000 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. Dis cautelacarta il surnatante, il pellet come potrebbe essere instabile.
  12. Lavare sferoplasti con Zymolyase Buffer e scartare il surnatante.
  13. Risospendere sferoplasti con 100 ml di media Recovery. Trasferire sferoplasti ad una beuta e incubare per 1 ora a 30 ° C con agitazione. Questo passaggio di recupero è necessario in quanto durante la definizione Zymolyase trattamento viene arrestato e localizzazione mRNA viene interrotto (Figura 1B).
  14. Aggiungere 0,1 mg / ml CHX e trasferimento sferoplasti preraffreddato ad un tubo da 50 ml. CHX aggiunta è importante per congelare l'associazione ribosomi 'con mRNA. Così, ribosomi-dipendenti mRNA associazione con i mitocondri è mantenuta.
  15. Sferoplasti centrifugare a 3000 xg per 5 minuti a 4 ° C e scartare il surnatante.
  16. Lavare due volte con il freddo mannitolo Buffer.
  17. Risospendere sferoplasti con 4 ml di freddo mannitolo buffer e trasferirli in un omogeneizzatore Dounce di 15 ml, dotato di chiusura ermeticapestello. Rompere delicatamente sferoplasti con 15 colpi e trasferire il lisato in una provetta da 13 ml.
  18. Centrifugare il lisato a 1.500 xg per 6 minuti a 4 ° C a pellet nuclei e cellule intatte.
  19. Trasferire con attenzione il surnatante in una nuova provetta. Mettere da parte 1 ml (25%) del campione come un campione non frazionata (campione "Totale"). Trasferimento 50 ml di questo campione a un nuovo tubo e aggiungere 15 ml di 4X LSB per l'analisi western blot. RNA precipitato dal resto del campione "Totale" (Vedi protocollo 3, RNA precipitazione).
  20. Centrifugare il surnatante a 10.000 xg per 10 min a 4 ° C per far sedimentare i mitocondri.
  21. Trasferire il surnatante (~ 3 ml) in una nuova provetta e mantenere in ghiaccio. Questa è la frazione "citosolico". Trasferimento 50 ml di questo campione a un nuovo tubo e aggiungere 15 ml di 4x LSB per l'analisi western blot. RNA precipitato dal resto del campione "citosolico" (Vedi Protocol 3, RNA precipitazione).
  22. Lavare il pellet con 3 ml Mannitolo Buffer e centrifugare nuovamente a 10.000 xg per 10 min a 4 ° C.
  23. Risospendere il pellet con 3 ml di mannitolo Buffer. Questo esempio contiene i mitocondri, e indicato come frazione "mitocondri". Trasferimento 50 ml di questo campione a un nuovo tubo e aggiungere 15 ml di 4x LSB per l'analisi western blot.

2. RNA Estrazione

  1. Aggiungere a ciascun campione un volume di 8 M guanidina-HCl e due volumi di etanolo al 100%. Vortex e incubare per almeno 2 ore a -20 ° C.
  2. Centrifugare i campioni a 10.000 xg per 20 min a 4 ° C. Scartare il surnatante. Fare attenzione a come il pellet potrebbe essere instabile.
  3. Lavare il pellet con il 70% EtOH.
  4. Risospendere il pellet con 400 ml di acqua priva di RNasi e trasferire il campione in una nuova provetta Eppendorf.
  5. Precipitare nuovamente l'RNA aggiungendo 0,1 volume di 3 M acetato di sodioe pH 5.2 e due volumi di 100% EtOH. Vortex e incubare per almeno 2 ore a -20 ° C.
  6. Centrifugare i campioni a 20.000 xg per 20 min a 4 ° C. Eliminare il surnatante e lavare con il 70% EtOH.
  7. Far asciugare il pellet e risospendere con acqua RNase-free. Conservare i campioni di RNA a -80 ° C. I campioni possono essere usate per analisi Northern 19 o analisi microarray 18 (Vedi protocollo 3).

3. Preparazione del RNA per l'analisi Microarray

  1. Risospendere il mRNA dal punto 2.2 con 650 ml di acqua RNase-free.
  2. Per rimuovere eventuali residui di DNA o di proteine, aggiungere un volume uguale (650 ml) di acido fenolo: cloroformio (5:1, pH 4.7) e agitare vigorosamente. Centrifugare alla massima velocità per 2 min.
  3. Trasferire 500 ml della fase superiore (fase acquosa) in una nuova provetta. Evitare di prendere l'interfase, in quanto contiene il DNA. Fate anche attenzione di prendere fenolo, che può inibire la reazione di trascrizione inversa. </ Li>
  4. Il campione di RNA contiene una notevole quantità di eparina, che è un potente inibitore della trascrittasi inversa. Così, per RT-PCR o etichettatura microarray deve essere rimosso. Rimuovere eparina da LiCl precipitazioni: aggiungere LiCl ad una concentrazione finale di 2 M e incubare i campioni per tutta la notte a -20 ° C.
  5. Scongelare i campioni a 4 ° C e centrifugare a 20.000 xg per 20 min a 4 ° C.
  6. Scartare con cura il surnatante e lavare il pellet con l'80% di etanolo. Centrifuga di nuovo come descritto nel passaggio 3.5.
  7. Eliminare il surnatante, aria secca e risospendere il pellet in 150 ml di acqua RNase-free.
  8. Per rimuovere qualsiasi residuo LiCl, precipitare di nuovo con 0,1 volumi di acetato di sodio 3 M pH 5,3 e 3 volumi di etanolo al 100%. Incubare a -20 ° C per almeno 2 ore.
  9. Centrifugare alla massima velocità per 20 min a 4 ° C. Lavare accuratamente il pellet trasparente con 80% etanolo e asciugare all'aria.
  10. Risospendere ilpellet con acqua RNase-free 25 ml e conservare i campioni a -80 ° C.
  11. Seguire la procedura per l'etichettatura RNA e ibridazione descritto in 18,20.

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Representative Results

Questo protocollo permette la separazione di una frazione-mitocondri contenente da componenti citosolici. Il modo migliore per testare il suo successo è quello di eseguire l'analisi del nord e l'analisi occidentale (Figura 1) per i campioni delle diverse fasi di isolamento. Tre parametri per la qualità di isolamento sono derivati ​​da queste analisi. In primo luogo, se l'RNA o proteine ​​nei campioni sono intatti - questi saranno rilevati come bande distinte nelle analisi. Eventi di degradazione inducono la comparsa di ulteriori, bande più brevi o sbavature. In secondo luogo, confrontando i segnali da ciascuna fase con il segnale proveniente dall'ingresso (cioè totale) fornisce importanti informazioni relative perdite durante la preparazione. Gravi perdite saranno osservati come una differenza significativa tra la Total e la quantità relativa di segnale. Infine, cosa più importante, la qualità di separazione tra mitocondriale e componenti citosolici può essere determinato. Isolamento di mitochondri intattesi tradurrà in un segnale per trascrizione mitocondrialmente-trascritto solo nella frazione mitocondri e non nella frazione citosolica (Figura 1A). Inoltre, le proteine ​​che sono mitocondri-associati appariranno tramite western blot solo alla frazione mitocondri, e proteine ​​citosoliche nella frazione citosolica (Figura 1B).

La Figura 1 mostra due risultati supplementari che sono standard per questo protocollo: in primo luogo, associazione di mRNA nucleari codificati con mitocondri varia tra geni. Si può vedere che ACO1 mRNA, che codifica una proteina mitocondriale, appare principalmente nella frazione mitocondri, mentre l'mRNA codificante la proteina actina citosolica (A1) è principalmente nella frazione citosolica (Figura 1C). Analisi genoma di ampiezza di variazione rivelato tra molti geni 8,10,21,22 e la base di questa diversità è sotto approfondite ricerche. In secondo luogo, notevoli quantità di materia ER-correlatil sono coisolated nella frazione mitocondriale. L'mRNA codificante SEC61, che è ER-associata, viene rilevato mediante Northern blot (Figura 1A) e la proteina ER-membrana CUE1 viene rilevato mediante Western blot (Figura 1B). Questo può essere il risultato delle note contatti fisici tra ER e mitocondri. Mentre ulteriore purificazione dei mitocondri è possibile, si può introdurre alcune limitazioni, che vengono discussi nella discussione.

Figura 1
Figura 1. . Verifica della qualità di isolamento di qualità è testato per campioni prelevati in tre fasi rappresentative della procedura: Prima di frazionamento (totale [step 1.20], T; frazione citosolica [passo 1.22], C, e la frazione mitocondriale [passo 1.24], M). I campioni vengono sottoposti ad analisi Northern (. A, C) o analisi western (B) A) analisi Northern per le seguenti mRNA: COB è un RNA che viene trascritto all'interno dei mitocondri quindi il segnale dovrebbe essere esclusivamente nei mitocondri. La sua comparsa nella frazione C indicherà dei mitocondri lisi durante la preparazione. ACT1 è un mRNA che codifica per una proteina citoplasmatica, e quindi tradotto dai ribosomi citosolici e appare per lo più presso la frazione C. ACO1 è un mRNA che codifica per una proteina che viene importato ai mitocondri, e appare principalmente alla frazione mitocondri. SEC61 è un mRNA che codifica la proteina ER residente, la sua presenza nella frazione M indica la presenza di componenti di ER in questa frazione. Il pannello inferiore presenta una colorazione blu di metilene della membrana settentrionale, è che vengono rilevati due rRNA (18S e 25S). Questo pannello dimostra che notevole quantità di ribosomi appaiono nella frazione M. B) analisi Western per il following proteine: POR1 è una proteina di membrana esterna mitocondriale pertanto il relativo segnale viene previsto solo nella frazione M. Segnale nella frazione C proporrà dissociazione dei componenti mitocondriali durante la preparazione. Hxk1 è una proteina citosolica e CUE1 è una proteina ER. Sia relazione sulla copurification di queste frazioni con la frazione mitocondri. Rpl39 è una proteina ribosomale, dimostrando ancora la presenza di ribosomi in due frazioni. Il pannello "Rpl39 senza recupero", presenta il frazionamento dei ribosomi quando il protocollo è esclusa della fase di recupero (punto 1.14). C) Analisi Nord per CCP1, un mRNA che codifica per una proteina che viene importato ai mitocondri. L'intero gel viene presentato per dimostrare la mancanza di, bande di degradazione originati più brevi. Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Discussion

I progressi tecnologici nella diagnostica per immagini hanno dato strumenti ad alta risoluzione per studiare la localizzazione mRNA. Oggi, si può misurare il movimento di una singola molecola di mRNA a scala msec 23-26. Tuttavia, gli approcci tradizionali biochimici, come quello sopra descritto, sono anche informativo e sono preferibili in alcuni casi. Isolamento Biochemical permette la purificazione di un grande repertorio di mRNA e proteine, ed è quindi preferibile per studi genoma di ampiezza. In un singolo isolamento, si possono ottenere livelli di mRNA sufficienti per consentire caratterizzazione di migliaia di geni, sia da microarray di DNA o RNA-seq 18,27. In parallelo, si può isolare proteine ​​ed effettuare un'analisi proteomica per caratterizzare il proteoma sui mitocondri 28. Frazionamenti biochimici possono essere adattati per separare i mitocondri da altri organelli cellulari, in particolare l'ER 29. Ciò può essere vantaggioso in alcuni tipi di cellule erano l'elevato sovrapposizione spazialetra ER e mitocondri ostacola analisi localizzazione microscopica. Un importante vantaggio di frazionamenti biochimici è il loro basso costo, che permette l'analisi di molti campioni differenti. Un vantaggio relativo è la loro semplicità - frazionamento biochimico, come quello sopra descritto, non richiedono solitamente marcatura fluorescente laborioso di mRNA, come avviene in vivo in studi di imaging. Infine, molte insidie ​​e manufatti sono già diagnosticati per questi protocolli tradizionali, quindi i necessari controlli siano ben definiti.

Il protocollo presentato comporta una fase di recupero (passo 1.14) che segue il trattamento zymolyase. Questo passaggio è fondamentale perché lo stress indotto durante il trattamento zymolyase comporta quasi immediato arresto traslazionale e dissociazione ribosomi 'da mRNA. Il trigger effettivo per i ribosomi dissociazione può qualsiasi dei passi che inclusi in questo trattamento, ossia la rimozione della fonte di carbonio, manifestazioniure alta, g durante la centrifugazione, il trattamento con agenti riducenti (DTT), rimozione della parete cellulare da zymolyase o introduzione di elevate condizioni osmotiche, ciascuna delle quali è nota per indurre un arresto traslazionale. Questo arresto traslazionale influisce probabilmente l'associazione dei ribosomi con mitocondri. Di conseguenza, abbiamo scoperto che l'mRNA associazione con mitocondri è basso dopo il trattamento zymolyase, e aumenta durante il recupero (non mostrato).

La frazione mitocondriale che è isolato da questo protocollo contiene una quantità significativa di ER, come evidente dalla presenza di diversi marcatori ER (es Figura 1). Un evidente desiderio è quello di eliminare ulteriormente i componenti ER e per ottenere mitocondri puro, utilizzando uno dei numerosi protocolli standard che utilizzano gradienti 29-33. Tuttavia, questi protocolli richiedono strippaggio dei ribosomi dei mitocondri, sia a causa del trattamento zymolyase stressante (Figura 1B (cioè quando ribosomi Riassocia mitocondri), entrambi marcatori ER e mitocondri sedimentate ad una stessa frazione. Questo è probabilmente perché i ribosomi associati oscurare le differenze di densità (dati non mostrati). Così, per gli studi di associazione ribosoma, dovranno essere sviluppati metodi alternativi per l'isolamento dei mitocondri.

Per molti studi, tuttavia, la presenza di componenti ER non è necessariamente problematico. Associazione degli mRNA che codificano proteine ​​mitocondriali consolidate (ad esempioAconitasi, ATP2, Oxa1) è probabile che sia con i mitocondri, e non il componente ER in questa preparazione greggio. Si raccomanda pertanto di utilizzare uno di questi mRNA mitocondriali tipici come letture per l'impatto sui mitocondri. Le proteine ​​che non sono stati verificati mitocondriale non dovrebbero essere usate come giornalisti, questo è importante soprattutto quando studi mRNA genome-wide vengono eseguite (ad esempio analisi microarray), come mis-assegnati mRNA possono introdurre un errore.

La principale sfida tecnica di questo protocollo è ridurre al minimo la degradazione mRNA. Durante l'utilizzo di reagenti RNase-free è sempre consigliato, si dovrebbe ricordare che dopo la lisi delle cellule enormi quantità di RNasi si scatenano nella soluzione. L'eparina è un inibitore RNAsi molto efficace e viene aggiunto in quantità significative. Quando grandi quantità di estratto sono preparati, il suo costo relativamente basso fornisce ulteriore vantaggio rispetto ad altri inibitori RNasi. Eparina però, inibisce anche la trascrizione inversaase, e quindi dovrebbero essere rimossi per studi che coinvolgono tale attività enzimatica (es. RT-PCR o DNA microarray etichettatura). Qui vi presentiamo una procedura di rimozione che si basa su LiCl precipitazioni (passaggi 3,4-3,10). Questa precipitazione rimuove efficacemente eparina, ma a quanto pare anche gli importi significativi di mRNA sono persi. In alternativa, ci sono vari spin-colonne che si suppone per rimuovere eparina da campioni di RNA, ma abbiamo avuto un successo limitato con questi.

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Disclosures

Gli autori dichiarano interessi finanziari concorrenti.

Acknowledgments

Ringraziamo Drs. Erez Eliyahu, Daniel Melamed, Ophry Pini e Doron Rapaport aiuto e commenti durante la creazione di questo protocollo. Questo lavoro è finanziato dalla ISF (codice di autorizzazione 1193-1109).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Yeast Extract
BactoPeptone
Galactose Do not autoclave Galactose
Growth medium For mitochondrial enrichment, you should use any nonfermentable carbon source, such as Galactose-based growth medium sterilized 1% Yeast Extract, 2% BactoPeptone, 2% Galactose
0.1 M Tris-HCl, pH 9.4
30 mM Tris-HCl, pH 7.6
Dithiothreitol (DTT)
10 mM DTT Buffer 0.1 M TrisHCl pH 9.4, 10 mM Dithiothreitol (DTT). Make fresh every time
1.2 M Sorbitol
4 mM KH2PO4
16 mM K2HPO4
0.2 μm filter
Zymolyase Buffer 1.2 M Sorbitol, 4 mM KH2PO4 , 16 mM K2HPO4. Filter this buffer (0.2 μm) and keep at room temperature for future use
Zymolyase 20T 20,000 U/g
Recovery medium Galactose-based growth medium supplemented with 1 M Sorbitol
0.1 mg/ml Cycloheximide (CHX)
0.6 M Mannitol
5 mM MgAc
100 mM KCl
0.5 mg/ml Heparin
1 mM Phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF)
Mannitol Buffer 0.6 M Mannitol, 30 mM Tris-HCl pH7.6, 5 mM MgAc, 100 mM KCl. Add freshly: 0.5 mg/ml Heparin, 0.1 mg/ml CHX and 1mM (PMSF). Filter this buffer and use it ice-cold
8 M Guanidinium-HCl
100% and 70% Ethanol (EtOH)
3 M Sodium Acetate, pH 5.2
10 M LiCl stock solution
250 mM Tris HCl pH 6.8
SDS
Glycerol
β-Mercaptoethanol
Bromophenol blue
4x LSB 250 mM Tris HCl pH 6.8, 8% SDS, 40% Glycerol, 20% β-mercaptoethanol, and 0.02% Bromophenol blue
Dounce homogenizer of 15 ml capacity equipped with tight fitting pestle

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Biochimica mitocondri localizzazione mRNA lievito, Microarray traduzione localizzata frazionamento biochimico
Isolamento di mRNA associati con mitocondri di lievito per studiare i meccanismi di traduzione localizzata
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Lesnik, C., Arava, Y. Isolation ofMore

Lesnik, C., Arava, Y. Isolation of mRNAs Associated with Yeast Mitochondria to Study Mechanisms of Localized Translation. J. Vis. Exp. (85), e51265, doi:10.3791/51265 (2014).

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