Summary
Många mRNA som kodar mitokondriella proteiner är associerade med mitokondrierna yttre membran. Vi beskriver en subcellulär fraktioneförfarande som syftar till isolering av jäst mitokondrier med tillhörande mRNA och ribosomer. Detta protokoll kan tillämpas på celler som odlas under olika förhållanden för att avslöja mekanismer för mRNA-lokalisering och lokal översättning nära mitokondrierna.
Abstract
De flesta av mitokondriella proteiner kodas i kärnan och måste importeras till organell. Import kan inträffa när proteinet syntetiseras nära mitokondrierna. Stöd för denna möjlighet kommer från nya studier, där många mRNA som kodar mitokondriella proteiner som visats vara lokaliserad till mitokondrierna närhet. Tillsammans med tidigare demonstrationer av ribosomer associering till yttermembranet, dessa resultat tyder på en lokaliserad process översättning. Sådan lokal översättning kan förbättra import effektivitet, ger unika reglerplatser och minimera fall av ektopisk uttryck. Olika metoder har använts för att karaktärisera de faktorer och faktorer som medierar lokaliserad översättning. Standard bland dessa är subcellulär fraktionering med differentiell centrifugering. Detta protokoll har fördelen att isolering av mRNA, ribosomer och proteiner i ett enda förfarande. Dessa kan sedan karakteriseras genom olika molekylära och biochemical metoder. Vidare kan transkriptomik och proteomik metoder appliceras på det resulterande materialet, och därigenom tillåta genomvida insikter. Användningen av jäst som modellorganism för sådana studier har fördelarna med hastighet, kostnader och enkelhet. Dessutom avancerade genetiska verktyg och tillgängliga stammar radering underlätta kontrollen av kandidatfaktorer.
Introduction
Eukaryota celler är organiserade i olika fack som har specifika funktioner. För att uppnå sin funktion, varje fack innehåller en unik uppsättning proteiner som är avgörande för dess verksamhet. En möjlig mekanism genom vilken dessa proteiner närmar sitt fack är av lokal översättnings 1,2. I denna process är det protein som syntetiseras vid slutpunkten med ribosomer och mRNA som finns där. Bland de sannolika fördelarna med lokaliserad översättning är ökad effektivitet av protein inriktning, minskat behov av protein följeslagare, och möjliggör platsspecifika regleringsmekanismer. Dessutom kan lokala mRNA och ribosomer vara en avskild reservoar av översättnings maskiner vid cellulär stress, då allmän översättning hämmas.
Mitokondrier blev under senare år en central modell för att studera lokaliserad översättning. De flesta mitokondrier proteiner kodas i kärnan, översatt i cytosolen,och importeras till organell. Olika bevislinjer tyder på att många av dessa proteiner produceras genom en lokal översättningsprocessen. Inledningsvis elektronmikroskopi och biokemisk fraktionestudier upptäcktes ribosomer förknippade med mitokondrier 3-5. Dessa studier var då som bekräftas in vivo genom arbetet med specifika mRNA, som befanns importeras endast på ett cotranslational sätt 6,7. Genome-omfattande studier av mRNA association med mitokondrier visade att en större del av mRNA är lokaliserade till mitokondrierna närhet 8-10. En del av dessa mRNA kännetecknas vidare av in vivo fluorescens metoder, såsom fisk eller mtag 9,11. En rättfram tolkning av denna förening är att dessa mRNA tjäna som mallar för lokal översättning.
De mekanismer genom vilka dessa mRNA närmar mitokondrierna är okända. Icke-kodande domäner (mest significantly 3 'UTR) visade sig vara inblandade i mRNA association till mitokondrierna 12. Dessa domäner är sannolikt att tjäna som ett bindningsställe för RNA-bindande proteiner som medierar deras transport. Studier i jäst visade att en medlem av PUM familj av proteiner (Puf3) stöder mRNA förening med mitokondrier 8,13. En trolig roll för Puf3, som är baserad på funktioner hos andra familjemedlemmar, är att hämma translation medan mRNA är på väg 14. Således kan mRNA transporteras i en icke-translaterad status, av RNA-bindande proteiner som växelverkar med icke-kodande regionerna. Alternativt föreslår en stor mängd arbete att transporter sker när proteinet syntetiseras. Framför allt var översättningshämmare visats påverka mRNA förening 8,13. Dessutom översatta funktioner som AUG, var mitokondriell målssekvens (MTS) eller ORF regioner visat att hjälpa till lokalisering 8,11,15. Hsp70-familjen protein chaperone och protein-receptor på mitokondrierna yttre membranet har också visat sig stödja mRNA association, vidare antyder att kodad protein funktioner är viktiga för mRNA-lokalisering 16. Detta överensstämmer med en modell där ribosomen-växande protein fungerar som igenkänningselement för att rikta mRNA-ribosom-proteinkomplexet till mitokondrierna 17.
Lokaliserad översättning nära mitokondrierna studerades genom olika metoder, inklusive elektronmikroskop (visualisera ribosomer) 3, FISH-9, grön-RNA (för att detektera specifika mRNA-sekvenser) 11, och biokemisk fraktionering (för att detektera både RNA och ribosomer) 10,18. Medan de tidigare metoderna upptäcker lokalisering in vivo och kan tillåta visualisering av transportdynamik, gör det senare upptäcka många olika mRNA i ett enda experiment. Dessutom, för biokemisk fraktione kodning eller icke-kodande domäner behöver inte vara alrade, därför kan utvärderas deras specifika roller. Biochemical fraktione har framgångsrikt använts under många år, för isolering av många olika cellulära avdelningar. Dess principer och begränsningar är väl etablerade, och man kan lätt ändra befintliga protokoll för olika ändamål. Den nödvändiga instrumenteringen är standard i många laboratorier, därför är det vanligtvis den första metoden för att studera intracellulära lokalisering. Vi beskriver ett protokoll som var optimerad för isolering av mRNA medan ribosomer är förknippade med mitokondrier. Detta protokoll är därför optimal för att studera faktorer som lokaliserad översättning nära mitokondrier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Mitokondrier Rening
Väg den pellet av cellerna. Ungefär 0,6 g erhålls från 100 ml celler.
- Odla 100-150 ml jästceller till OD 600 = 1-1,5 vid 30 ° C på en nonfermentable tillväxtmedium, såsom galaktos-baserade tillväxtmedium, för att anrika för mitokondrier.
- Centrifugera cellerna vid 3000 xg under 5 min vid rumstemperatur och häll bort supernatanten.
- Tvätta pelleten med dubbeldestillerat vatten och centrifugera igen. Kasta bort supernatanten.
- Återsuspendera pelleten i 1 ml DTT Buffert per 0,5 g celler. Det är viktigt att behandla cellerna med ett reduktionsmedel för att bryta disulfidbindningarna i cellväggen, vilket förbättrar hydrolys.
- Inkubera cellerna i 10 minuter vid 30 ° C med varsam skakning. Samtidigt väger 6 mg zymolyas per 1 g celler och avbryta den i Zymolyase buffert.
- Centrifugera cellerna vid 3000 xg under 5 minuter ent rumstemperatur och kassera supernatanten.
- Återsuspendera pelleten i 1 ml Zymolyase Buffer per 0,15 g celler. Inte virvel.
- Mät OD 600 av 10 | il alikvot av cellerna i 990 | il vatten.
- Lägg Zymolyase (steg 1,5) till cellerna för att hydrolysera glukospolymerer vid β-1 ,3-glukan-kopplingar och generera sfäroplaster. Från detta steg bör sfäroplaster hållas i en isoton lösning för att undvika lys.
- Inkubera cellerna under 15 min vid 30 ° C (för optimal aktivitet av zymolyas) med försiktig skakning. För att verifiera hydrolys av cellväggen och sfäroplaster generation, blanda 10 | il av cellerna med 990 | il vatten. Sfäroplaster förväntas lysera grund av osmotisk skillnad, och OD 600 bör åtminstone 10 gånger mindre än det värde som bestäms i steg 1,9. Om inte, fortsätt inkubation med zymolyas för en annan 15 minuter.
- Centrifugera cellerna vid 3000 xg under 5 min vid rumstemperatur. Noggrant diskort supernatanten, som pelleten kan vara instabil.
- Tvätta sfäroplasterna med Zymolyase buffert och kassera supernatanten.
- Resuspendera sfäroplasterna med 100 ml Recovery medium. Överför sfäroplaster till en Erlenmeyer-kolv och inkubera i 1 timme vid 30 ° C med skakning. Denna återhämtning steg är nödvändigt eftersom under Zymolyase behandlingen översättningen är arresterad och mRNA-lokalisering är störd (Figur 1B).
- Lägg till 0,1 mg / ml CHX och överförings sfäroplasterna till en förkyld 50 ml koniska rör. CHX Dessutom är viktigt att frysa ribosomer förening med mRNA. Således är ribosomer beroende mRNA association med mitokondrier bibehålls.
- Centrifugera sfäroplasterna vid 3000 xg under 5 minuter vid 4 ° C och kassera supernatanten.
- Tvätta två gånger med kall Mannitol buffert.
- Resuspendera sfäroplasterna med 4 ml kall Mannitol buffra och överföra dem till en Dounce homogenisator av 15 ml kapacitet utrustad med åtsittandemortelstöt. Bryta försiktigt sfäroplasterna med 15 slag och överföra lysatet till en 13 ml tub.
- Centrifugera lysatet vid 1500 x g under 6 min vid 4 ° C för att pelletera kärnor och obrutna celler.
- Försiktigt överföra supernatanten till ett nytt rör. Avsätt 1 ml (25%) av provet som ett ofraktionerat prov ("totalt" prov). Överför 50 ml av detta prov till ett nytt rör och tillsätt 15 ml av 4X LSB för western blot-analys. Fällning RNA från resten av den "totala" prov (Se protokoll 3, RNA-fällning).
- Centrifugera supernatanten vid 10000 x g under 10 min vid 4 ° C för att pelle mitokondrierna.
- Överför supernatanten (~ 3 ml) till ett nytt rör och hålla den på is. Detta är den "cytosoliska" fraktionen. Överför 50 ml av detta prov till ett nytt rör och tillsätt 15 ml 4x LSB för western blot-analys. Fällning RNA från resten av "cytosoliska" prov (Se Protocol 3, RNA-fällning).
- Tvätta pelleten med 3 ml mannitol buffert och centrifugera igen vid 10000 x g under 10 min vid 4 ° C.
- Resuspendera pelleten med 3 ml mannitol buffert. Detta prov innehåller mitokondrierna, och kallas "Mitokondrier" fraktionen. Överför 50 ml av detta prov till ett nytt rör och tillsätt 15 ml 4x LSB för western blot-analys.
2. RNA-extraktion
- Lägg till varje prov en volym av 8 M guanidinium-HCl och två volymer av 100% etanol. Vortexa och inkubera under åtminstone 2 timmar vid -20 ° C.
- Centrifugera proverna vid 10000 x g under 20 min vid 4 ° C. Kassera supernatanten. Var försiktig så att pellets kan vara instabil.
- Tvätta pelleten med 70% EtOH.
- Resuspendera pelleten med 400 ml RNas-fritt vatten och överföra provet till ett nytt Eppendorf-rör.
- Fällning RNA igen genom att tillsätta 0,1 volym av 3 M natrium-acetate pH 5,2 och två volymer av 100% EtOH. Vortexa och inkubera under åtminstone 2 timmar vid -20 ° C.
- Centrifugera proverna vid 20.000 xg under 20 minuter vid 4 ° C. Avlägsna supernatanten och tvätta med 70% EtOH.
- Lufttorka pelleten och resuspendera med RNas-fritt vatten. Affär RNA-prover vid -80 ° C. Prover kan användas för Northern-analys 19 eller microarray analys 18 (Se protokoll 3).
3. Förbereda RNA för microarray analys
- Resuspendera mRNA från steg 2,2 med 650 ml RNas-fritt vatten.
- För att avlägsna eventuellt kvarvarande DNA eller proteiner, tillsätt lika stor volym (650 ml) av surt fenol: kloroform (05:01, pH 4,7) och skaka kraftigt. Centrifugera vid maximal hastighet i 2 min.
- Överför 500 ml av den övre fasen (vattenfasen) till ett nytt rör. Undvik att ta på interfasen, eftersom det innehåller DNA. Också vara försiktig med att ta fenol, vilket kan hämma den omvända transkriptionsreaktionen. </ Li>
- RNA-provet innehåller en betydande mängd av heparin, som är en potent hämmare av omvänt transkriptas. Sålunda för RT-PCR eller microarray märkning det behöver tas bort. Avlägsna heparin genom LiCl utfällning: add LiCl till en slutlig koncentration av 2 M och inkubera proverna över natten vid -20 ° C.
- Tina proverna vid 4 ° C och centrifugera vid 20.000 xg under 20 minuter vid 4 ° C.
- Försiktigt kasta supernatanten och tvätta pelleten med 80% etanol. Centrifugera igen såsom beskrivs i steg 3,5.
- Kasta bort supernatanten, lufttorka och återsuspendera pelleten i 150 ml RNas-fritt vatten.
- För att avlägsna eventuellt kvarvarande LiCl, utfällas igen med 0,1 volym av 3 M natriumacetat, pH 5,3 och 3 volymer av 100% etanol. Inkubera vid -20 ° C i minst 2 timmar.
- Centrifugera vid högsta hastighet under 20 min vid 4 ° C. Tvätta noga den genomskinliga pellets med 80% etanol och lufttorka.
- Resuspenderapellets med 25 ml RNas-fritt vatten och hålla proverna vid -80 ° C.
- Följ stegen för RNA-märkning och hybridisering beskrivs i 18,20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Detta protokoll möjliggör separation av en mitokondrier fraktion från cytosoliska komponenter. Det bästa sättet att testa dess framgång är att göra norra analys och västra analys (figur 1) på prover från de olika isoleringssteg. Tre parametrar för isolering kvalitet härleds från dessa analyser. För det första, om RNA eller proteiner i proverna är intakta - dessa kommer att upptäckas som distinkta band i analyserna. Nedbrytnings händelser kommer att framkalla utseendet på kortare extra band eller fläckar. För det andra, att jämföra signalerna från varje steg med signalen från ingången (dvs total) ger viktig information om förluster under beredning. Svåra förluster iakttas som en betydande skillnad mellan den totala och den relativa mängden av signal. Slutligen, och viktigast, kan kvaliteten på separationen mellan mitokondrie och cytosoliska ämnena bestämmas. Isolering av intakta mitochondrien kommer att resultera i signal för mitokondriellt-transkriberade transkript endast i mitokondrierna fraktion och inte i den cytosoliska fraktionen (Figur 1A). Vidare kommer proteiner som är mitochondria-associerade synas genom western blot endast på mitokondrier fraktionen och cytosoliska proteiner i den cytosoliska fraktionen (Figur 1B).
Figur 1 visar ytterligare två utfall som är standard för detta protokoll: första, sammanslutning av kärn-kodade mRNA med mitokondrier varierar mellan gener. Man kan se att ACO1 mRNA, som kodar för en mitokondrie-proteinet förefaller mestadels i mitokondrierna fraktionen, medan den mRNA som kodar det cytosoliska aktin-proteinet (ÄRV1) är till största delen i den cytosoliska fraktionen (Figur 1C). Genome-omfattande analyser avslöjade variation bland många gener 8,10,21,22 och grunden för denna mångfald är under omfattande forskning. Andra, betydande mängder av ER relaterad material är coisolated i mitokondriella fraktionen. Det mRNA som kodar SEC61, som är ER-associerad, detekteras genom northern blöt (Figur 1A) och ER-membranproteinet Cue1 detekteras genom western blöt (Figur 1B). Detta kan vara ett resultat av de kända fysiska kontakter mellan ER och mitokondrier. Medan ytterligare rening av mitokondrier är möjlig, får den införa vissa begränsningar, dessa diskuteras i diskussionen.
Figur 1. . Kvalitet verifiering av isolering Kvalitet testas för prover som tagits i tre representativa steg i förfarandet: Före fraktionering (Total [steg 1,20], T; cytosolfraktionen [steg 1,22], C, och mitokondriella fraktionen [steg 1.24], M). Proverna utsattes för Northern-analys (. A, C) eller western-analys (B) A) Northern analys för följande mRNA: COB är ett RNA som transkriberas inuti mitokondrierna därför sin signal bör endast vara i mitokondrierna. Dess utseende i C-fraktionen indikerar mitokondrier lys under beredning. ÄRV1 är en mRNA som kodar för ett cytosoliskt protein, och därför översatt av cytosoliska ribosomer och verkar främst på C-fraktionen. ACO1 är en mRNA som kodar för ett protein som importeras till mitokondrierna, och verkar huvudsakligen på mitokondrierna fraktionen. SEC61 är en mRNA som kodar för ER bosatt protein, dess närvaro i M-fraktionen indikerar förekomst av ER-komponenter i denna fraktion. Den nedre panelen presenterar en metylenblått färgning av norra membranet, är som två rRNA (18S och 25S) upptäcks. Denna panel visar att betydande mängd ribosomer visas i M-fraktionen. B) Western analys för following proteiner: Por1 är en mitokondrier yttermembranprotein därför sin signal förväntas endast i M-fraktionen. Signal i C-fraktionen kommer att föreslå dissociation av mitokondriella komponenter under beredning. Hxk1 är ett cytosoliskt protein och Cue1 är en ER-protein. Båda rapporterar om copurification av dessa fraktioner med mitokondrierna fraktionen. Rpl39 är ett ribosomalt protein, återigen visar förekomsten av ribosomer i båda fraktioner. Panelen "Rpl39 utan återvinning", presenfraktionering av ribosomer när protokollet är utesluten av återvinningssteget (steg 1,14). C) Northern analys för CCP1, ett mRNA som kodar för ett protein som importeras till mitokondrierna. Hela gel presenteras för att påvisa avsaknaden av kortare, nedbrytnings-härstammar band. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tekniska framsteg inom bildbehandling hade gett högupplösta verktyg för att studera mRNA lokalisering. Idag kan man mäta rörelsen av en enda mRNA-molekylen vid ms tidsskalan 23-26. Ändå traditionella biokemiska metoder, såsom den som beskrivits ovan, också är informativ och är att föredra i vissa fall. Biokemisk isolering möjliggör rening av en stor repertoar av mRNA och proteiner, och är därför att föredra för genomet hela studier. I en enda isolering kan man erhålla tillräckliga mRNA-nivåer för att medge karaktärisering av tusentals gener, antingen genom DNA microarrays eller RNA-seq 18,27. Samtidigt kan man isolera proteiner och utföra en proteomik analys för att karakterisera proteomet på mitokondrier 28. Biokemiska fraktioneringar kan anpassas för att separera mitokondrier från andra cellulära organeller, särskilt ER 29. Detta kan vara fördelaktigt i vissa typer av celler var hög spatial överlappningmellan ER och mitokondrier hindrar mikroskopisk lokaliseringsanalyser. En viktig fördel av biokemiska fraktioneringar är deras låga kostnad, vilket möjliggör analys av många olika prover. En relaterad fördel är deras enkelhet - biokemiska fraktionering, som den som beskrivs ovan, brukar inte kräver mödosam fluorescerande märkning av mRNA, vilket är fallet i in vivo imaging studier. Slutligen finns många fallgropar och artefakter redan diagnostiserats för dessa traditionella protokoll, alltså de nödvändiga kontrollerna väletablerade.
Den presenterade protokollet innebär en utvinningssteget (steg 1,14) som följer zymolyas behandling. Detta steg är avgörande eftersom den stress under zymolyas behandling leder till nästan omedelbar translationell gripandet och ribosomer "avståndstagande från mRNA. Själva utlösande faktorn för ribosomer dissociation kan någon av de åtgärder som ingår i denna behandling, det vill säga avlägsnande av kolkälla, exposure till höga g under centrifugering, behandling med reduktionsmedel (DTT), cellväggs borttagning av zymolyas eller införandet av höga osmotiska förhållanden, är var och en av dessa kända för att framkalla en translationell gripandet. Denna translationell gripandet påverkar förmodligen den sammanslutning av ribosomer med mitokondrier. Därför fann vi att mRNA association med mitokondrier är låg efter zymolyas behandling, och ökar under återhämtning (visas ej).
Den mitokondriella fraktionen som isoleras med detta protokoll innehåller en betydande mängd ER, som framgår av förekomsten av olika ER markörer (t.ex. figur 1). En självklar önskan är att ytterligare avlägsna ER komponenter och för att erhålla rena mitokondrier, med hjälp av en av flera standardprotokoll som använder övertoningar 29-33. Men dessa protokoll nödvändigt strippa av ribosomer i mitokondrierna, antingen på grund av den stressiga zymolyas behandling (Figur 1B (dvs när ribosomer associera med mitokondrier), både ER och mitokondrier markörer sedimenterade till samma fraktion. Detta beror förmodligen på att de tillhörande ribosomer döljer skillnaderna i deras densiteter (data visas ej). Således kan till ribosomen associationsstudier, kommer alternativa metoder för mitokondrier isolering behöver utvecklas.
För många studier är dock förekomsten av ER-komponenter inte nödvändigtvis problematiskt. Föreningen av mRNA som kodar för väletablerade mitokondriella proteiner (t.ex.Aconitase är ATP2, Oxa1) sannolikt med mitokondrierna och inte ER-komponenten i denna råa beredning. Det rekommenderas därför att använda en av dessa typiska mitokondriella mRNA som avläsningar för effekt på mitokondrier. Proteiner som inte verifierats som mitokondrie bör inte användas som reportrar, detta är särskilt viktigt när genomet hela mRNA-studier utförs (t.ex. microarray analys), som mis-tilldelade mRNA kan införa ett fel.
Den största tekniska utmaningen i detta protokoll är att minimera mRNA nedbrytning. När du använder RNas-fri reagens är alltid rekommenderas, bör man komma ihåg att vid lys av celler enorma mängder RNAs är loss i lösningen. Heparin är en mycket effektiv RNas hämmare och läggs på betydande belopp. När stora extraktvolymer är beredda, ger sin relativt låg kostnad ytterligare fördel jämfört med andra RNAs hämmare. Heparin men hämmar också omvänt avskriftase, och därför bör tas bort för studier som involverar sådan enzymatisk aktivitet (t.ex. RT-PCR eller DNA microarray märkning). Häri presenterar vi ett borttagande förfarande som grundar sig på LiCl utfällning (steg från 3,4 till 3,10). Denna fällning avlägsnar effektivt heparin, men tydligen också betydande mängder mRNA går förlorade. Alternativt, finns det olika spin-kolonner som är tänkta att avlägsna heparin från RNA-prover, men vi hade en begränsad framgång med dessa.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Vi tackar Dr. Erez Eliyahu, Daniel Melamed, Ophry tallar och Doron Rapaport för hjälp och synpunkter under upprättandet av detta protokoll. Detta arbete finansieras av ISF (licensnummer 1193-1109).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yeast Extract | |||
| BactoPeptone | |||
| Galactose | Do not autoclave Galactose | ||
| Growth medium | For mitochondrial enrichment, you should use any nonfermentable carbon source, such as Galactose-based growth medium sterilized 1% Yeast Extract, 2% BactoPeptone, 2% Galactose | ||
| 0.1 M Tris-HCl, pH 9.4 | |||
| 30 mM Tris-HCl, pH 7.6 | |||
| Dithiothreitol (DTT) | |||
| 10 mM DTT Buffer | 0.1 M TrisHCl pH 9.4, 10 mM Dithiothreitol (DTT). Make fresh every time | ||
| 1.2 M Sorbitol | |||
| 4 mM KH2PO4 | |||
| 16 mM K2HPO4 | |||
| 0.2 μm filter | |||
| Zymolyase Buffer | 1.2 M Sorbitol, 4 mM KH2PO4 , 16 mM K2HPO4. Filter this buffer (0.2 μm) and keep at room temperature for future use | ||
| Zymolyase 20T | 20,000 U/g | ||
| Recovery medium | Galactose-based growth medium supplemented with 1 M Sorbitol | ||
| 0.1 mg/ml Cycloheximide (CHX) | |||
| 0.6 M Mannitol | |||
| 5 mM MgAc | |||
| 100 mM KCl | |||
| 0.5 mg/ml Heparin | |||
| 1 mM Phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) | |||
| Mannitol Buffer | 0.6 M Mannitol, 30 mM Tris-HCl pH7.6, 5 mM MgAc, 100 mM KCl. Add freshly: 0.5 mg/ml Heparin, 0.1 mg/ml CHX and 1mM (PMSF). Filter this buffer and use it ice-cold | ||
| 8 M Guanidinium-HCl | |||
| 100% and 70% Ethanol (EtOH) | |||
| 3 M Sodium Acetate, pH 5.2 | |||
| 10 M LiCl stock solution | |||
| 250 mM Tris HCl pH 6.8 | |||
| SDS | |||
| Glycerol | |||
| β-Mercaptoethanol | |||
| Bromophenol blue | |||
| 4x LSB | 250 mM Tris HCl pH 6.8, 8% SDS, 40% Glycerol, 20% β-mercaptoethanol, and 0.02% Bromophenol blue | ||
| Dounce homogenizer of 15 ml capacity equipped with tight fitting pestle |
References
- Holt, C. E., Bullock, S. L. Subcellular mRNA localization in animal cells and why it matters. Science. 326, 1212-1216 (2009).
- Donnelly, C. J., Fainzilber, M., Twiss, J. L. Subcellular communication through RNA transport and localized protein synthesis. Traffic. 11, 1498-1505 (2010).
- Kellems, R. E., Allison, V. F., Butow, R. A. Cytoplasmic type 80 S ribosomes associated with yeast mitochondria. II. Evidence for the association of cytoplasmic ribosomes with the outer mitochondrial membrane in situ. J. Biol. Chem. 249, 3297-3303 (1974).
- Kellems, R. E., Butow, R. A. Cytoplasmic type 80 S ribosomes associated with yeast mitochondria. 3. Changes in the amount of bound ribosomes in response to changes in metabolic state. J. Biol. Chem. 249, 3304-3310 (1974).
- Suissa, M., Schatz, G. Import of proteins into mitochondria. Translatable mRNAs for imported mitochondrial proteins are present in free as well as mitochondria-bound cytoplasmic polysomes. J. Biol. Chem. 257, 13048-13055 (1982).
- Fujiki, M., Verner, K. Coupling of cytosolic protein synthesis and mitochondrial protein import in yeast. Evidence for cotranslational import in vivo. J. Biol. Chem. 268, 1914-1920 (1993).
- Yogev, O., Karniely, S., Pines, O. Translation-coupled translocation of yeast fumarase into mitochondria in vivo. J. Biol. Chem. 282, 29222-29229 (2007).
- Eliyahu, E., et al. Tom20 mediates localization of mRNAs to mitochondria in a translation-dependent manner. Mol. Cell. Biol. 30, 284-294 (2010).
- Garcia, M., et al. Mitochondria-associated yeast mRNAs and the biogenesis of molecular complexes. Mol. Cell. Biol. 18, 362-368 (2007).
- Marc, P., et al. Genome-wide analysis of mRNAs targeted to yeast mitochondria. EMBO Rep. 3, 159-164 (2002).
- Gadir, N., Haim-Vilmovsky, L., Kraut-Cohen, J., Gerst, J. E. Localization of mRNAs coding for mitochondrial proteins in the yeast Saccharomyces cerevisiae. RNA. 17, 1551-1565 (2011).
- Margeot, A., et al. In Saccharomyces cerevisiae, ATP2 mRNA sorting to the vicinity of mitochondria is essential for respiratory function. J EMBO. 21, 6893-6904 (2002).
- Saint-Georges, Y., et al. Yeast mitochondrial biogenesis: a role for the PUF RNA-binding protein Puf3p in mRNA localization. PloS one. 3, (2008).
- Quenault, T., Lithgow, T., Traven, A. PUF proteins: repression, activation and mRNA localization. Trends Cell Biol. 21, 104-112 (2011).
- Garcia, M., Delaveau, T., Goussard, S., Jacq, C. Mitochondrial presequence and open reading frame mediate asymmetric localization of messenger RNA. EMBO Rep. 11, 285-291 (2010).
- Eliyahu, E., Lesnik, C., Arava, Y. The protein chaperone Ssa1 affects mRNA localization to the mitochondria. FEBS Lett. 586, 64-69 (2012).
- Ahmed, A. U., Fisher, P. R. Import of nuclear-encoded mitochondrial proteins: a cotranslational perspective. Int. Rev. Cell Biol. 273, 49-68 (2009).
- Eliyahu, E., Melamed, D., Arava, Y. Genome-wide analysis of RNA extracted from isolated mitochondria. Methods Mol. Biol. 714, 287-299 (2011).
- Eldad, N., Yosefzon, Y., Arava, Y. Identification and characterization of extensive intra-molecular associations between 3'-UTRs and their ORFs. Nucleic Acids RES. 36, 6728-6738 (2008).
- Melamed, D., Arava, Y. Genome-wide analysis of mRNA polysomal profiles with spotted DNA microarrays. Methods Enzymol. 431, 177-201 (2007).
- Margeot, A., et al. Why are many mRNAs translated to the vicinity of mitochondria: a role in protein complex assembly. Gene. 354, 64-71 (2005).
- Mathieu, L., Marsy, S., Saint-Georges, Y., Jacq, C., Dujardin, G. A transcriptome screen in yeast identifies a novel assembly factor for the mitochondrial complex III. Mitochondrion. 11, 391-396 (2011).
- Hocine, S., Raymond, P., Zenklusen, D., Chao, J. A., Singer, R. H. Single-molecule analysis of gene expression using two-color RNA labeling in live yeast. Nat. Methods. 10, 119-121 (2013).
- Park, H. Y., Buxbaum, A. R., Singer, R. H. Single mRNA tracking in live cells. Methods Enzymol. 472, 387-406 (2010).
- Thompson, M. A., Casolari, J. M., Badieirostami, M., Brown, P. O., Moerner, W. E. Three-dimensional tracking of single mRNA particles in Saccharomyces cerevisiae using a double-helix point spread function. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 17864-17871 (2010).
- Tyagi, S. Imaging intracellular RNA distribution and dynamics in living cells. Nat. Methods. 6, 331-338 (2009).
- Garcia, M., Darzacq, X., Devaux, F., Singer, R. H., Jacq, C. Yeast mitochondrial transcriptomics. Methods Mol. Biol. 372, 505-528 (2007).
- Reinders, J., Sickmann, A. Proteomics of yeast mitochondria. Methods Mol. Biol. 372, 543-557 (2007).
- Meisinger, C., Sommer, T., Pfanner, N. Purification of Saccharomcyes cerevisiae mitochondria devoid of microsomal and cytosolic contaminations. Anal. Biochem. 287, 339-342 (2000).
- Glick, B. S., Pon, L. A. Isolation of highly purified mitochondria from Saccharomyces cerevisiae. Methods Enzymol. 260, 213-223 (1995).
- Boldogh, I. R., Pon, L. A. Purification and subfractionation of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. Methods Cell Biol. 80, 45-64 (2007).
- Rieder, S. E., Emr, S. D., et al. Isolation of subcellular fractions from the yeast Saccharomyces cerevisiae. Current protocols in cell biology / editorial board. Bonifacino, J. S. 8, (2001).
- Diekert, K., de Kroon, A. I., Kispal, G., Lill, R. Isolation and subfractionation of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. Methods Cell Biol. 65, 37-51 (2001).
