Summary
وترتبط العديد من mRNAs وترميز البروتينات الميتوكوندريا مع الغشاء الخارجي الميتوكوندريا. نحن تصف الإجراء تجزيء التحت خلوية تهدف إلى عزل الميتوكوندريا الخميرة مع mRNAs والمرتبطة به وريبوسوم. ويمكن تطبيق هذا البروتوكول إلى الخلايا المزروعة تحت ظروف متنوعة من أجل الكشف عن آليات مرنا التعريب والترجمة المترجمة بالقرب من الميتوكوندريا.
Abstract
يتم ترميز معظم البروتينات الميتوكوندريا في النواة وتحتاج إلى استيرادها إلى عضية. قد تحدث الاستيراد في حين يتم تصنيع البروتين بالقرب من الميتوكوندريا. ويستمد الدعم لهذا الاحتمال من الدراسات التي أجريت مؤخرا، والتي عرضت العديد من mRNAs وترميز البروتينات الميتوكوندريا إلى أن تكون مترجمة إلى جوار الميتوكوندريا. جنبا إلى جنب مع المظاهرات السابقة من جمعية ريبوسوم 'مع الغشاء الخارجي، وتشير هذه النتائج إلى عملية الترجمة المترجمة. هذه الترجمة المترجمة قد تحسين كفاءة الاستيراد وتوفير مواقع التنظيم فريدة من نوعها وتقليل حالات التعبير خارج الرحم. وقد استخدمت أساليب متنوعة لتوصيف العوامل والعناصر التي تتوسط الترجمة المترجمة. المعيار بين هذه هو تجزيء التحت خلوية بواسطة الطرد المركزي التفاضلي. هذا البروتوكول له ميزة عزل mRNAs و، ريبوسوم والبروتينات في إجراء واحد. ويمكن بعد ذلك تتميز هذه من قبل مختلف الجزيئية وثنائيةطرق ochemical. علاوة على ذلك، transcriptomics والبروتينات أساليب يمكن تطبيقها على المواد الناتجة، وبالتالي تسمح رؤى على نطاق الجينوم. استخدام الخميرة كما كائن نموذج لمثل هذه الدراسات لديها مزايا السرعة والتكاليف والبساطة. وعلاوة على ذلك، فإن الأدوات الجينية المتقدمة وسلالات حذف متاحة تسهيل التحقق من العوامل مرشح.
Introduction
ويتم تنظيم الخلايا حقيقية النواة في مقصورات متميزة ذات وظائف محددة. لإنجاز مهمتها، كل مقصورة تحتوي على مجموعة فريدة من البروتينات الضرورية لنشاطها. آلية يمكن من خلال هذه البروتينات التي تقترب المقصورة الخاصة بهم هي مترجمة 1،2 الترجمة. في هذه العملية، ويتم تصنيع البروتين في وجهتها من قبل ريبوسوم وmRNAs والتي تقع هناك. من بين المزايا المحتملة للترجمة المترجمة وزيادة كفاءة استهداف البروتين، انخفضت الحاجة الى المحرمين البروتين، وتمكين آليات التنظيم للموقع المحدد. أيضا، mRNAs والمترجمة وريبوسوم يمكن أن يكون خزان منعزل الآلات الترجمة في حالات الإجهاد الخلوية، عندما يتم تثبيط الترجمة العامة.
أصبح الميتوكوندريا في السنوات الأخيرة نموذجا المركزية لدراسة الترجمة المترجمة. يتم ترميز معظم البروتينات الميتوكوندريا في النواة، وترجم في العصارة الخلوية،والمستوردة إلى عضية. خطوط مختلفة من الأدلة تشير إلى أن العديد من هذه البروتينات يتم إنتاجها من خلال عملية الترجمة المحلية. في البداية، الكشف عن المجهر الإلكتروني وتجزئة البيوكيميائية الدراسات ريبوسوم المرتبطة الميتوكوندريا 3-5. هذه الدراسات حيث ثم تؤكده في الجسم الحي بواسطة العمل على mRNAs ومحددة، التي وجدت لتكون مستوردة فقط بطريقة 6،7 cotranslational. كشفت دراسات الجينوم على نطاق من mRNAs وبالتعاون مع الميتوكوندريا أن جزءا كبيرا من mRNAs وتكون مترجمة إلى جوار الميتوكوندريا 8-10. وتميزت بعض هذه mRNAs ومزيدا من التألق في الجسم الحي الأساليب، مثل الأسماك أو mTAG 9،11. تفسير مستقيم إلى الأمام من هذا الارتباط هو أن هذه mRNAs وتكون بمثابة نماذج لترجمة المترجمة.
الآليات التي هذه mRNAs والاقتراب من الميتوكوندريا غير معروفة. المجالات غير المكودة (معظم significantlعرضت ذ 3 'UTRs) أن تشارك في تكوين الجمعيات مرنا إلى الميتوكوندريا 12. من المرجح أن يكون بمثابة موقع ملزم للبروتينات ملزمة الحمض النووي الريبي الذي توسط نقلها هذه المجالات. كشفت الدراسات في الخميرة أن عضوا من عائلة PUM من البروتينات (Puf3) تدعم جمعية مرنا مع الميتوكوندريا 8،13. دور معقول لPuf3، الذي يقوم على أساس وظائف من أفراد الأسرة الآخرين، هو أن تمنع الترجمة بينما هو في طريقه مرنا 14. وبالتالي، يمكن نقلها من mRNAs في حالة nontranslated، من خلال البروتينات ملزمة الحمض النووي الريبي التي تتفاعل مع المناطق غير المكودة. بدلا من ذلك، مجموعة كبيرة من العمل تشير إلى أن يحدث النقل في الوقت الذي يجري تصنيعه البروتين. على وجه الخصوص، وقد أظهرت مثبطات ترجمة تؤثر mRNAs وجمعية 8،13. وعلاوة على ذلك، وميزات ترجمة مثل أغسطس، عرضت الميتوكوندريا تسلسل الاستهداف (MTS) أو المناطق ORF للمساعدة في توطين 8،11،15. HSP70 الأسرة الفصل البروتينعرضت aperone ومستقبلات البروتين على الغشاء الخارجي الميتوكوندريا أيضا لدعم الجمعيات مرنا، مما يعني أن المزيد من الميزات المشفرة البروتين مهمة لتوطين مرنا 16. وهذا يتفق مع نموذج الذي البروتين الناشئة الريبوسوم بمثابة عنصر الاعتراف لاستهداف مجمع مرنا-الريبوسوم البروتين إلى 17 الميتوكوندريا.
وقد درست الترجمة المترجمة بالقرب من الميتوكوندريا عن طريق وسائل مختلفة، بما في ذلك المجهر الإلكتروني (لتصور ريبوسوم) 3، FISH 9، RNA الخضراء (للكشف عن mRNAs ومحددة) 11، وتجزئة البيوكيميائية (للكشف عن كل من الحمض النووي الريبي وريبوسوم) 10،18. في حين أن وسائل التعريب السابق كشف في الجسم الحي، وربما يسمح التصور من ديناميات النقل، وهذا الأخير يسمح الكشف عن العديد من المختلف في mRNA في تجربة واحدة. علاوة على ذلك، لالبيوكيميائية الترميز تجزئة أو غير المكودة المجالات لا تحتاج إلى أن تكون آلtered، وبالتالي يمكن تقييم الأدوار الخاصة بهم. وقد استخدمت تجزئة البيوكيميائية بنجاح لسنوات عديدة، لعزل العديد من المقصورات الخلوية المختلفة. وراسخة ومبادئها والقيود، ويمكن للمرء بسهولة تعديل البروتوكولات القائمة لأغراض مختلفة. والأجهزة اللازمة هو المعيار في العديد من المختبرات، لذلك فإنه عادة ما يكون الأسلوب الأول من خيار للدراسة توطين داخل الخلايا. نحن تصف البروتوكول الذي تم الأمثل لعزل mRNAs وبينما ترتبط ريبوسوم مع الميتوكوندريا. بالتالي فإن هذا البروتوكول هو الأمثل لدراسة العوامل التي تدخل في الترجمة المترجمة قرب الميتوكوندريا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. الميتوكوندريا تنقية
تزن بيليه من الخلايا. ويتم الحصول على ما يقرب من 0.6 غرام من 100 مل الخلايا.
- تنمو 100-150 مل من خلايا الخميرة إلى OD 600 = 1-1.5 في 30 ° C على وسيط النمو nonfermentable، مثل القائم على اللبن المتوسطة النمو، من أجل إثراء للالميتوكوندريا.
- خلايا الطرد المركزي في 3000 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة وتجاهل طاف.
- غسل بيليه مع الماء المقطر مزدوجة وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى. تجاهل طاف.
- resuspend الكرية في 1 مل العازلة DTT في 0.5 غرام من الخلايا. فمن المهم لعلاج الخلايا مع وكيل الحد من أجل كسر السندات ثاني كبريتيد داخل جدار الخلية، وبالتالي تحسين التحلل.
- احتضان الخلايا لمدة 10 دقيقة في 30 ° C مع الهز لطيف. وفي الوقت نفسه، تزن 6 ملغ zymolyase في 1 غرام من الخلايا وتعليقه في Zymolyase العازلة.
- خلايا الطرد المركزي في 3000 x ج لمدة 5 دقائق لدرجة حرارة الغرفة طن وتجاهل طاف.
- resuspend الكرية في 1 مل Zymolyase العازلة في 0.15 غرام من الخلايا. لا الدوامة.
- قياس OD 600 من 10 ميكرولتر قسامة من الخلايا في 990 ميكرولتر من الماء.
- إضافة Zymolyase (الخطوة 1.5) إلى الخلايا ليتحلل الجلوكوز البوليمرات في β-1 ،3-جلوكان الروابط وتوليد spheroplasts. من هذه الخطوة، يجب أن تبقى spheroplasts في محلول متساوي التوتر من أجل تجنب تحلل.
- احتضان الخلايا لمدة 15 دقيقة عند 30 درجة مئوية (للنشاط الأمثل للzymolyase) مع الهز لطيف. للتحقق من التحلل من جدار الخلية وتوليد spheroplasts، مزيج 10 ميكرولتر من الخلايا مع 990 ميكرولتر من الماء. ومن المتوقع Spheroplasts إلى ليز نظرا لفارق ناضح، والتطوير التنظيمي 600 وينبغي على الأقل 10 أضعاف أقل من القيمة المحددة في الخطوة 1.9. إذا لم يكن كذلك، تستمر الحضانة مع zymolyase لمدة 15 دقيقة أخرى.
- خلايا الطرد المركزي في 3000 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. ديس بعنايةبطاقة طاف، وبيليه قد تكون غير مستقرة.
- غسل spheroplasts مع Zymolyase العازلة وتجاهل طاف.
- في resuspend spheroplasts مع 100 مل استعادة المتوسطة. نقل spheroplasts إلى دورق مخروطي واحتضان لمدة 1 ساعة على 30 ° مئوية مع الهز. هذه الخطوة التعافي من الضروري منذ خلال الترجمة العلاج Zymolyase يتم القبض عليهم وتعطل توطين مرنا (الشكل 1B).
- إضافة 0.1 ملغ / مل فروج وspheroplasts نقل إلى precooled أنبوب 50 مل المخروطية. بالإضافة فروج المهم أن تجمد جمعية ريبوسوم 'مع mRNAs و. وبالتالي، يتم الاحتفاظ الجمعية تعتمد ريبوسوم مرنا مع الميتوكوندريا.
- spheroplasts أجهزة الطرد المركزي في 3000 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية، وتجاهل طاف.
- يغسل مرتين مع المانيتول الباردة العازلة.
- في resuspend spheroplasts مع 4 مل الباردة العازلة المانيتول ونقلها إلى الخالط Dounce من 15 مل قدرة مجهزة ضيقةمدقة. كسر بلطف spheroplasts مع 15 السكتات الدماغية ونقل المحللة إلى أنبوب 13 مل.
- أجهزة الطرد المركزي لالمحللة في 1،500 x ج لمدة 6 دقائق في 4 درجات مئوية لتكوير نوى الخلايا ودون انقطاع.
- نقل بعناية طاف لأنبوب جديد. جانبا 1 مل (25٪) من العينة كعينة غير المجزأ ("إجمالي" عينة). نقل 50 مل من هذه العينة لأنبوب جديد وإضافة 15 مل من 4X LSB للتحليل لطخة غربية. راسب الحمض النووي الريبي من بقية "توتال" العينة (انظر البروتوكول 3، هطول RNA).
- أجهزة الطرد المركزي لطاف في 10،000 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 ° C لتكوير الميتوكوندريا.
- نقل طاف (~ 3 مل) إلى أنبوب جديد ويبقيه على الجليد. وهذا هو "عصاري خلوي" الكسر. نقل 50 مل من هذه العينة لأنبوب جديد وإضافة 15 مل من 4X LSB للتحليل لطخة غربية. راسب الحمض النووي الريبي من بقية "عصاري خلوي" عينة (انظر بروتocol 3، هطول RNA).
- غسل بيليه مع 3 مل المانيتول العازلة وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى في 10،000 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية.
- resuspend الكرية مع 3 مل المانيتول العازلة. يحتوي هذا النموذج الميتوكوندريا، ويشار إليها باسم "الميتوكوندريا" الكسر. نقل 50 مل من هذه العينة لأنبوب جديد وإضافة 15 مل من 4X LSB للتحليل لطخة غربية.
2. استخراج الحمض النووي الريبي
- إضافة إلى كل عينة مجلد واحد من 8 M guanidinium حمض الهيدروكلوريك ومجلدين من الإيثانول بنسبة 100٪. دوامة واحتضان لمدة 2 ساعة على الأقل في -20 ° C.
- عينات الطرد المركزي في 10،000 x ج لمدة 20 دقيقة على 4 ° C. تجاهل طاف. كن حذرا كما بيليه قد تكون غير مستقرة.
- غسل بيليه مع 70٪ ETOH.
- resuspend الكرية مع 400 مل من الماء الخالي من ريبونوكلياز ونقل العينة إلى أنبوب إيبندورف جديدة.
- ترسيب الحمض النووي الريبي مرة أخرى بإضافة 0.1 حجم 3 acetat M الصوديومه الرقم الهيدروجيني 5.2 ومجلدين من 100٪ ETOH. دوامة واحتضان لمدة 2 ساعة على الأقل في -20 ° C.
- عينات الطرد المركزي في 20،000 x ج لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية. تجاهل طاف وتغسل مع 70٪ ETOH.
- الهواء الجاف بيليه و resuspend مع ريبونوكلياز خالية من المياه. عينات الحمض النووي الريبي في مخزن -80 ° C. عينات يمكن استخدامها لتحليل الشمالية 19 أو تحليل ميكروأري 18 (انظر البروتوكول 3).
3. إعداد الحمض النووي الريبي لتحليل ميكروأري
- resuspend ومرنا من الخطوة 2.2 مع 650 مل من الماء ريبونوكلياز خالية.
- لإزالة أي الحمض النووي أو البروتينات المتبقية، إضافة حجم مساو (650 مل) من الفينول الحمضية: الكلوروفورم (5:1، ودرجة الحموضة 4.7) ودوامة بقوة. أجهزة الطرد المركزي في أقصى سرعة لمدة 2 دقيقة.
- نقل 500 مل من المرحلة العليا (المرحلة المائية) إلى أنبوب جديد. تجنب اتخاذ البيني، كما أنه يحتوي على الحمض النووي. يكون حذرا أيضا من أخذ الفينول، والتي يمكن أن تمنع رد فعل عكس النسخ. </ لى>
- يحتوي على عينة الحمض النووي الريبي كمية كبيرة من الهيبارين، والذي هو المانع من امكانات الناسخ العكسي. وبالتالي، لRT-PCR أو ميكروأري وضع العلامات لا بد من إزالتها. إزالة الهيبارين عن طريق LiCl هطول: LiCl إضافة إلى تركيز النهائي من 2 م واحتضان عينات أكثر من ليلة في -20 ° C.
- ذوبان الجليد العينات عند 4 درجة مئوية، وأجهزة الطرد المركزي في 20،000 x ج لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية.
- تجاهل بعناية طاف ويغسل بيليه مع الايثانول 80٪. الطرد المركزي مرة أخرى كما هو موضح في الخطوة 3.5.
- تجاهل طاف، والهواء الجاف و resuspend بيليه في 150 مل من الماء ريبونوكلياز خالية.
- لإزالة أي LiCl المتبقية، تترسب مرة أخرى مع 0.1 حجم 3 M الصوديوم خلات درجة الحموضة 5.3 و 3 مجلدات من الإيثانول بنسبة 100٪. احتضان عند -20 ° مئوية لمدة 2 ساعة على الأقل.
- أجهزة الطرد المركزي في سرعة قصوى لمدة 20 دقيقة على 4 ° C. تغسل بعناية بيليه شفافة مع 80٪ من الإيثانول والهواء الجاف.
- resuspend وبيليه مع 25 مل ريبونوكلياز خالية المياه والحفاظ على العينات في -80 ° C.
- اتبع الخطوات لوضع العلامات والتهجين الحمض النووي الريبي وصفها في 18،20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
هذا البروتوكول يسمح فصل جزء من الميتوكوندريا التي تحتوي على مكونات عصاري خلوي. أفضل طريقة لاختبار نجاحها هو إجراء تحليل الشمالية والتحليل الغربي (الشكل 1) لعينات من الخطوات عزل مختلفة. وتستمد ثلاثة معايير لجودة بمعزل عن هذه التحليلات. أولا، ما إذا كان الحمض النووي الريبي أو البروتينات في عينات سليمة - سوف يتم الكشف عن هذه العصابات كما واضح في التحليلات. سوف الأحداث تدهور لحث على ظهور إضافية، والعصابات أقصر أو مسحات. الثاني، مقارنة الإشارات من كل خطوة مع إشارة من المدخلات (أي إجمالي) يوفر معلومات هامة تتعلق الخسائر خلال التحضير. وسيراعى في خسائر فادحة كما فرق كبير بين توتال وكمية النسبية للإشارة. أخيرا، والأهم من ذلك، يمكن تحديد نوعية الفصل بين الميتوكوندريا والمكونات عصاري خلوي. عزل mitochondri سليمةوسوف يؤدي في إشارة للحصول على النسخة كتب mitochondrially فقط في جزء الميتوكوندريا وليس في جزء عصاري خلوي (الشكل 1A). وعلاوة على ذلك، فإن البروتينات التي يتم المرتبطة الميتوكوندريا تظهر من قبل لطخة غربية فقط في جزء الميتوكوندريا، والبروتينات عصاري خلوي في جزء عصاري خلوي (الشكل 1B).
يوضح الشكل 1 نتيجتين الإضافية التي هي المعيار لهذا البروتوكول: أولا، جمعية mRNAs والمشفرة النووية مع الميتوكوندريا تختلف بين الجينات. يمكن للمرء أن يرى أن ACO1 مرنا، الذي يشفر بروتين الميتوكوندريا، يظهر في الغالب في جزء الميتوكوندريا، في حين ترميز مرنا البروتين الأكتين عصاري خلوي (ACT1) هي في معظمها في جزء عصاري خلوي (الشكل 1C). التحليلات الجينوم على نطاق الاختلاف بين كشف العديد من الجينات 8،10،21،22 والأساس لهذا التنوع هو قيد البحث واسعة النطاق. الثانية، كميات كبيرة من المواد ذات الصلة ERوcoisolated لتر في جزء الميتوكوندريا. يتم الكشف عن مرنا ترميز SEC61، وهو المرتبط ER، من خلال لطخة الشمالية (الشكل 1A) ويتم الكشف عن البروتين غشاء ER Cue1 بواسطة لطخة غربية (الشكل 1B). وهذا قد يكون نتيجة للاتصالات الفيزيائية المعروفة بين ER والميتوكوندريا. مع مواصلة تنقية الميتوكوندريا هو ممكن، وأنه قد يعرض بعض القيود، ويتم مناقشتها في هذه المناقشة.
الشكل 1. يتم اختبار جودة التحقق من العزلة الجودة لعينات أخذت في ثلاث خطوات ممثل الإجراء: قبل تجزئة (إجمالي [خطوة 1.20]، T؛ جزء عصاري خلوي [خطوة 1.22]، C، وجزء الميتوكوندريا [خطوة 1.24]، M). تخضع العينات للتحليل الشمالية (. A، C) أو تحليل الغربية (B) A) تحليل الشمالية لmRNAs والتالية: البوليفيين هو الحمض النووي الريبي التي يتم نسخها داخل الميتوكوندريا لذا ينبغي أن تكون اشارة حصرا في الميتوكوندريا. سوف مظهره في جزء C من الميتوكوندريا تشير إلى تحلل أثناء التحضير. ACT1 هو مرنا الذي يشفر بروتين عصاري خلوي، وبالتالي ترجم من قبل ريبوسوم عصاري خلوي ويبدو معظمهم في جزء C. ACO1 هو مرنا الذي يشفر بروتين التي يتم استيرادها إلى الميتوكوندريا، ويظهر في الغالب في جزء الميتوكوندريا. SEC61 هو الذي يشفر بروتين مرنا ER المقيمين؛ وجودها في M جزء يدل على وجود مكونات ER في هذا الكسر. ويعرض لوحة أسفل لتلطيخ الأزرق الميثيلين من الغشاء الشمالية، هي التي يتم الكشف عن اثنين rRNAs (18S 25S و). يوضح هذا الفريق أن كمية كبيرة من ريبوسوم تظهر في جزء M. B) التحليل الغربي لfollowiنانوغرام البروتينات: Por1 هو الميتوكوندريا البروتين الغشاء الخارجي وبالتالي من المتوقع اشارة فقط في M الكسر. سوف إشارة في جزء C تشير تفكك مكونات الميتوكوندريا أثناء التحضير. Hxk1 هو بروتين عصاري خلوي وCue1 هو البروتين ER. كلا تقريرا عن copurification هذه الكسور مع جزء الميتوكوندريا. Rpl39 هو بروتين الريباسي، مرة أخرى مما يدل على وجود ريبوسوم في كل من الكسور. لوحة "Rpl39 دون الانتعاش"، ويعرض تجزئة من ريبوسوم عندما يتم استبعاد لبروتوكول الخطوة الانتعاش (الخطوة 1.14). C) تحليل الشمالية لCCP1، مرنا الذي يشفر بروتين التي يتم استيرادها إلى الميتوكوندريا. ويرد الجل بأكمله لإثبات عدم وجود أقصر، والعصابات نشأت تدهور. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وكان التقدم التكنولوجي في مجال التصوير أسفرت أدوات عالية الدقة لدراسة توطين مرنا. اليوم، يمكن للمرء أن قياس حركة حتى جزيء واحد مرنا في النطاق الزمني ميللي ثانية 23-26. حتى الآن، والنهج البيوكيميائية التقليدية، كما هو موضح أعلاه، هي أيضا غنية بالمعلومات وهي الأفضل في بعض الحالات. العزلة البيوكيميائية يسمح تنقية ذخيرة كبيرة من mRNAs والبروتينات و، ولذا فمن الأفضل للدراسات الجينوم على نطاق. في عزلة واحدة، يمكن للمرء الحصول على مستويات مرنا كافية للسماح توصيف الآلاف من الجينات، إما عن طريق ميكروأرس الحمض النووي RNA أو يليها 18،27. في موازاة ذلك، يمكن للمرء أن عزل البروتينات وإجراء تحليل البروتين لتوصيف بروتيوم على الميتوكوندريا 28. fractionations البيوكيميائية يمكن تكييفها لفصل الميتوكوندريا من العضيات الخلوية الأخرى، ولا سيما ER 29. قد يكون هذا مفيدا في بعض أنواع الخلايا والتداخل المكاني عاليةبين ER والميتوكوندريا يعوق يحلل توطين المجهرية. ميزة هامة من fractionations البيوكيميائية هو تكلفتها المنخفضة، والذي يسمح تحليل العديد من عينات مختلفة. وهناك ميزة ذات الصلة هو بساطتها - تجزئة الكيمياء الحيوية، وكما هو موضح أعلاه، وعادة لا تتطلب شاقة علامات الفلورسنت من mRNAs و، كما هو الحال في الدراسات المجراة في التصوير. أخيرا، يتم تشخيص كثير من المزالق والتحف بالفعل لهذه البروتوكولات التقليدية، وبالتالي يتم راسخة الضوابط اللازمة.
يستتبع بروتوكول المعروضة خطوة الانتعاش (الخطوة 1.14) الذي يتبع العلاج zymolyase. هذه الخطوة أمر بالغ الأهمية لأن الاجهاد الناجم أثناء العلاج zymolyase يؤدي إلى اعتقال متعدية على الفور تقريبا، والتفكك ريبوسوم 'من mRNAs و. على الزناد الفعلية للريبوسوم تفارق يمكن لأي من الخطوات التي شملت في هذا العلاج، وهي إزالة مصدر الكربون، المعارضلدى عودتهم إلى الأعلى ز أثناء الطرد المركزي، والمعاملة مع الحد من وكلاء (DTT)، وإزالة جدار الخلية بواسطة zymolyase أو إدخال شروط الأوسمي؛ كل من هذه هو معروف للحث على اعتقال متعدية. هذا الاعتقال متعدية ربما يؤثر رابطة ريبوسوم مع الميتوكوندريا. وفقا لذلك، وجدنا أن جمعية مرنا مع الميتوكوندريا منخفضة بعد العلاج zymolyase، وزيادات خلال الانتعاش (لا يظهر).
الكسر الميتوكوندريا التي يتم عزلها بواسطة هذا البروتوكول يحتوي على كمية كبيرة من ER، كما يتضح من وجود علامات ER المختلفة (مثل الشكل 1). رغبة واضحة هو مواصلة إزالة مكونات ER والحصول على الميتوكوندريا نقية، وذلك باستخدام واحدة من العديد من البروتوكولات القياسية التي تستخدم التدرجات 29-33. ومع ذلك، هذه البروتوكولات يستلزم تجريد ريبوسوم من الميتوكوندريا، إما بسبب إحتكاك zymolyase المجهدة (الشكل 1B (أي عندما reassociate ريبوسوم مع الميتوكوندريا)، وكلاهما ER والميتوكوندريا علامات الرسوبية لنفس الكسر. وربما هذا هو لأن الريبوسومات المرتبطة تحجب اختلافات في كثافتها (لا تظهر البيانات). وبالتالي، لجمعية دراسات الريبوسوم، وطرق بديلة لعزل الميتوكوندريا تحتاج إلى تطوير.
بالنسبة للعديد من الدراسات، ومع ذلك، فإن وجود مكونات ER ليس بالضرورة إشكالية. جمعية mRNAs والتي تكود بروتينات الميتوكوندريا راسخة (مثلأكونيتاز، ATP2، Oxa1) من المرجح أن يكون مع الميتوكوندريا وليس المكون ER في هذا الإعداد الخام. لذا فمن المستحسن استخدام أحد هذه mRNAs والميتوكوندريا نموذجية كما قراءات للتأثير على الميتوكوندريا. البروتينات التي لم يتم التحقق من الميتوكوندريا لا ينبغي أن تستخدم للصحفيين، وهذا أمر مهم خاصة عندما يتم تنفيذ دراسات الجينوم على نطاق مرنا (مثل التحليل ميكروأري)، كما تم تعيينها سوء mRNAs وقد يعرض خطأ.
التحدي التقني الرئيسي من هذا البروتوكول هو تقليل تدهور مرنا. أثناء استخدام الكواشف خالية من ريبونوكلياز ينصح دائما، ينبغي للمرء أن يتذكر أنه عند تحلل الخلايا وأطلق كميات هائلة من RNAses إلى الحل. الهيبارين هو المانع ريبونوكلياز فعالة جدا، ويضاف في كميات كبيرة. عندما يتم إعداد كميات كبيرة استخراج، انخفاض تكلفته نسبيا يوفر ميزة إضافية مقارنة مثبطات ريبونوكلياز الأخرى. الهيبارين ومع ذلك، كما يمنع النص العكسيبورصة عمان، وبالتالي يجب إزالة للدراسات التي تنطوي على مثل هذا النشاط الأنزيمي (على سبيل المثال RT-PCR أو الحمض النووي ميكروأري وضع العلامات). هنا نقدم إجراء إزالة يستند LiCl هطول (الخطوات 3،4 حتي 3،10). هذه هطول فعال يزيل الهيبارين، ولكن يتم فقدان كميات كبيرة على ما يبدو أيضا من mRNAs و. بدلا من ذلك، هناك العديد من الأعمدة، تدور التي من المفترض أن إزالة الهيبارين من عينات الحمض النووي الريبي، ولكن كان لدينا نجاحا محدودا مع هؤلاء.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب تعلن أي المصالح المالية المتنافسة.
Acknowledgments
نشكر الدكاترة. إيرز إلياهو، دانيال ميلاميد، Ophry بينس ودورون رابابورت للمساعدة والتعليقات أثناء إنشاء هذا البروتوكول. ويتم تمويل هذا العمل من قبل قوى الأمن الداخلي (منحة رقم 1193-1109).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yeast Extract | |||
| BactoPeptone | |||
| Galactose | Do not autoclave Galactose | ||
| Growth medium | For mitochondrial enrichment, you should use any nonfermentable carbon source, such as Galactose-based growth medium sterilized 1% Yeast Extract, 2% BactoPeptone, 2% Galactose | ||
| 0.1 M Tris-HCl, pH 9.4 | |||
| 30 mM Tris-HCl, pH 7.6 | |||
| Dithiothreitol (DTT) | |||
| 10 mM DTT Buffer | 0.1 M TrisHCl pH 9.4, 10 mM Dithiothreitol (DTT). Make fresh every time | ||
| 1.2 M Sorbitol | |||
| 4 mM KH2PO4 | |||
| 16 mM K2HPO4 | |||
| 0.2 μm filter | |||
| Zymolyase Buffer | 1.2 M Sorbitol, 4 mM KH2PO4 , 16 mM K2HPO4. Filter this buffer (0.2 μm) and keep at room temperature for future use | ||
| Zymolyase 20T | 20,000 U/g | ||
| Recovery medium | Galactose-based growth medium supplemented with 1 M Sorbitol | ||
| 0.1 mg/ml Cycloheximide (CHX) | |||
| 0.6 M Mannitol | |||
| 5 mM MgAc | |||
| 100 mM KCl | |||
| 0.5 mg/ml Heparin | |||
| 1 mM Phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) | |||
| Mannitol Buffer | 0.6 M Mannitol, 30 mM Tris-HCl pH7.6, 5 mM MgAc, 100 mM KCl. Add freshly: 0.5 mg/ml Heparin, 0.1 mg/ml CHX and 1mM (PMSF). Filter this buffer and use it ice-cold | ||
| 8 M Guanidinium-HCl | |||
| 100% and 70% Ethanol (EtOH) | |||
| 3 M Sodium Acetate, pH 5.2 | |||
| 10 M LiCl stock solution | |||
| 250 mM Tris HCl pH 6.8 | |||
| SDS | |||
| Glycerol | |||
| β-Mercaptoethanol | |||
| Bromophenol blue | |||
| 4x LSB | 250 mM Tris HCl pH 6.8, 8% SDS, 40% Glycerol, 20% β-mercaptoethanol, and 0.02% Bromophenol blue | ||
| Dounce homogenizer of 15 ml capacity equipped with tight fitting pestle |
References
- Holt, C. E., Bullock, S. L. Subcellular mRNA localization in animal cells and why it matters. Science. 326, 1212-1216 (2009).
- Donnelly, C. J., Fainzilber, M., Twiss, J. L. Subcellular communication through RNA transport and localized protein synthesis. Traffic. 11, 1498-1505 (2010).
- Kellems, R. E., Allison, V. F., Butow, R. A. Cytoplasmic type 80 S ribosomes associated with yeast mitochondria. II. Evidence for the association of cytoplasmic ribosomes with the outer mitochondrial membrane in situ. J. Biol. Chem. 249, 3297-3303 (1974).
- Kellems, R. E., Butow, R. A. Cytoplasmic type 80 S ribosomes associated with yeast mitochondria. 3. Changes in the amount of bound ribosomes in response to changes in metabolic state. J. Biol. Chem. 249, 3304-3310 (1974).
- Suissa, M., Schatz, G. Import of proteins into mitochondria. Translatable mRNAs for imported mitochondrial proteins are present in free as well as mitochondria-bound cytoplasmic polysomes. J. Biol. Chem. 257, 13048-13055 (1982).
- Fujiki, M., Verner, K. Coupling of cytosolic protein synthesis and mitochondrial protein import in yeast. Evidence for cotranslational import in vivo. J. Biol. Chem. 268, 1914-1920 (1993).
- Yogev, O., Karniely, S., Pines, O. Translation-coupled translocation of yeast fumarase into mitochondria in vivo. J. Biol. Chem. 282, 29222-29229 (2007).
- Eliyahu, E., et al. Tom20 mediates localization of mRNAs to mitochondria in a translation-dependent manner. Mol. Cell. Biol. 30, 284-294 (2010).
- Garcia, M., et al. Mitochondria-associated yeast mRNAs and the biogenesis of molecular complexes. Mol. Cell. Biol. 18, 362-368 (2007).
- Marc, P., et al. Genome-wide analysis of mRNAs targeted to yeast mitochondria. EMBO Rep. 3, 159-164 (2002).
- Gadir, N., Haim-Vilmovsky, L., Kraut-Cohen, J., Gerst, J. E. Localization of mRNAs coding for mitochondrial proteins in the yeast Saccharomyces cerevisiae. RNA. 17, 1551-1565 (2011).
- Margeot, A., et al. In Saccharomyces cerevisiae, ATP2 mRNA sorting to the vicinity of mitochondria is essential for respiratory function. J EMBO. 21, 6893-6904 (2002).
- Saint-Georges, Y., et al. Yeast mitochondrial biogenesis: a role for the PUF RNA-binding protein Puf3p in mRNA localization. PloS one. 3, (2008).
- Quenault, T., Lithgow, T., Traven, A. PUF proteins: repression, activation and mRNA localization. Trends Cell Biol. 21, 104-112 (2011).
- Garcia, M., Delaveau, T., Goussard, S., Jacq, C. Mitochondrial presequence and open reading frame mediate asymmetric localization of messenger RNA. EMBO Rep. 11, 285-291 (2010).
- Eliyahu, E., Lesnik, C., Arava, Y. The protein chaperone Ssa1 affects mRNA localization to the mitochondria. FEBS Lett. 586, 64-69 (2012).
- Ahmed, A. U., Fisher, P. R. Import of nuclear-encoded mitochondrial proteins: a cotranslational perspective. Int. Rev. Cell Biol. 273, 49-68 (2009).
- Eliyahu, E., Melamed, D., Arava, Y. Genome-wide analysis of RNA extracted from isolated mitochondria. Methods Mol. Biol. 714, 287-299 (2011).
- Eldad, N., Yosefzon, Y., Arava, Y. Identification and characterization of extensive intra-molecular associations between 3'-UTRs and their ORFs. Nucleic Acids RES. 36, 6728-6738 (2008).
- Melamed, D., Arava, Y. Genome-wide analysis of mRNA polysomal profiles with spotted DNA microarrays. Methods Enzymol. 431, 177-201 (2007).
- Margeot, A., et al. Why are many mRNAs translated to the vicinity of mitochondria: a role in protein complex assembly. Gene. 354, 64-71 (2005).
- Mathieu, L., Marsy, S., Saint-Georges, Y., Jacq, C., Dujardin, G. A transcriptome screen in yeast identifies a novel assembly factor for the mitochondrial complex III. Mitochondrion. 11, 391-396 (2011).
- Hocine, S., Raymond, P., Zenklusen, D., Chao, J. A., Singer, R. H. Single-molecule analysis of gene expression using two-color RNA labeling in live yeast. Nat. Methods. 10, 119-121 (2013).
- Park, H. Y., Buxbaum, A. R., Singer, R. H. Single mRNA tracking in live cells. Methods Enzymol. 472, 387-406 (2010).
- Thompson, M. A., Casolari, J. M., Badieirostami, M., Brown, P. O., Moerner, W. E. Three-dimensional tracking of single mRNA particles in Saccharomyces cerevisiae using a double-helix point spread function. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 17864-17871 (2010).
- Tyagi, S. Imaging intracellular RNA distribution and dynamics in living cells. Nat. Methods. 6, 331-338 (2009).
- Garcia, M., Darzacq, X., Devaux, F., Singer, R. H., Jacq, C. Yeast mitochondrial transcriptomics. Methods Mol. Biol. 372, 505-528 (2007).
- Reinders, J., Sickmann, A. Proteomics of yeast mitochondria. Methods Mol. Biol. 372, 543-557 (2007).
- Meisinger, C., Sommer, T., Pfanner, N. Purification of Saccharomcyes cerevisiae mitochondria devoid of microsomal and cytosolic contaminations. Anal. Biochem. 287, 339-342 (2000).
- Glick, B. S., Pon, L. A. Isolation of highly purified mitochondria from Saccharomyces cerevisiae. Methods Enzymol. 260, 213-223 (1995).
- Boldogh, I. R., Pon, L. A. Purification and subfractionation of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. Methods Cell Biol. 80, 45-64 (2007).
- Rieder, S. E., Emr, S. D., et al. Isolation of subcellular fractions from the yeast Saccharomyces cerevisiae. Current protocols in cell biology / editorial board. Bonifacino, J. S. 8, (2001).
- Diekert, K., de Kroon, A. I., Kispal, G., Lill, R. Isolation and subfractionation of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. Methods Cell Biol. 65, 37-51 (2001).
