Summary
De nombreux ARNm codant pour des protéines mitochondriales sont associés à la membrane externe de la mitochondrie. Nous décrivons un procédé de fractionnement subcellulaire visant à l'isolement des mitochondries de levure avec ses ARNm et des ribosomes associés. Ce protocole peut être appliqué à des cellules cultivées dans des conditions diverses dans le but de révéler les mécanismes de localisation des ARNm et traduction localisée près des mitochondries.
Abstract
La plupart des protéines mitochondriales sont codées dans le noyau et doivent être importées dans l'organite. Importation peut se produire alors que la protéine est synthétisée à proximité des mitochondries. L'assistance pour cette possibilité est fondée sur des études récentes, dans lequel de nombreux ARNm codant pour des protéines mitochondriales ont été présentées à être localisées à proximité de mitochondries. Avec des manifestations antérieures de l'association des ribosomes à la membrane externe, ces résultats suggèrent un processus de traduction localisée. Cette traduction localisée peut améliorer l'efficacité de l'importation, fournir des sites de régulation uniques et réduire les cas de l'expression ectopique. Diverses méthodes ont été utilisées pour caractériser les facteurs et les éléments qui assurent la médiation de traduction localisée. Norme d'entre eux est un fractionnement sous-cellulaire par centrifugation différentielle. Ce protocole présente l'avantage d'isoler des ARNm, les ribosomes et les protéines en une seule procédure. Ceux-ci peuvent ensuite être caractérisés par divers moléculaire et biméthodes ochemical. En outre, la transcriptomique et la protéomique méthodes peuvent être appliquées à la matière résultante, permettre ainsi un aperçu de l'ensemble du génome. L'utilisation de la levure comme organisme modèle pour ces études a les avantages de rapidité, de simplicité et de coût. En outre, les outils de la génétique de pointe et des souches de suppression disponibles faciliter la vérification des facteurs de candidats.
Introduction
Les cellules eucaryotes sont organisés dans des compartiments distincts ayant des fonctions spécifiques. Pour remplir sa fonction, chaque compartiment contient un ensemble unique de protéines qui sont essentielles pour son activité. Un mécanisme possible par lequel ces protéines abordent leur compartiment est localisée par 1,2 de traduction. Dans ce procédé, la protéine est synthétisée à sa destination par les ribosomes et les ARNm qui y sont situés. Parmi les avantages probables de traduction localisée augmentent l'efficacité de la protéine de ciblage, de réduction du besoin de protéines chaperons, et permettant des mécanismes de régulation spécifiques au site. En outre, les ARNm et des ribosomes localisées peuvent être un réservoir isolé de machinerie de traduction en cas de stress cellulaire, lorsque la traduction générale est inhibée.
Mitochondries est devenu ces dernières années un modèle central à étudier traduction localisée. La plupart des protéines mitochondriales sont codées dans le noyau, traduites dans le cytosol,et importées dans l'organite. Divers éléments de preuve indiquent que bon nombre de ces protéines sont produites par un processus de traduction locale. Initialement, les études de microscopie électronique et de fractionnement biochimique détectés ribosomes associés aux mitochondries 5.3. Ces études ont été ensuite corroborées in vivo par le travail sur des ARNm spécifiques, qui ont été trouvés à être importés que d'une manière 6,7 cotraductionnelle. études de génome entier d'ARNm liaison avec les mitochondries ont montré qu'une fraction significative d'ARNm sont localisés au voisinage de la mitochondrie 8-10. Certains de ces ARNm ont été en outre caractérisé par fluorescence in vivo méthodes, comme le poisson ou MTAG 9,11. Une interprétation straight-forward de cette association est que ces ARNm servent de modèles pour la traduction localisée.
Les mécanismes par lesquels ces ARNm approchent les mitochondries ne sont pas connus. domaines non codantes (plus significantl3 'UTR y) ont été présentés à participer à l'ARNm association aux mitochondries 12. Ces domaines sont susceptibles de servir de site de liaison à des protéines liant l'ARN qui assurent la médiation de leur transport. Les études chez la levure ont révélé qu'un membre de la famille de PUM de protéines (Puf3) prend en charge l'association d'ARNm avec des mitochondries 8,13. Un rôle plausible pour Puf3, qui est basée sur les fonctions des autres membres de la famille, est d'inhiber la traduction de l'ARNm en est en route 14. Ainsi, les ARNm peuvent être transportés dans un état non traduite, par des protéines de liaison d'ARN qui interagissent avec les régions non codantes. En variante, un grand nombre de travaux suggèrent que le transport a lieu pendant que la protéine est synthétisée. En particulier, les inhibiteurs de la traduction ont été montrés pour affecter ARNm association 8,13. En outre, les caractéristiques traduits tels que l'AUG, la séquence de ciblage mitochondrial (MTS) ou les régions ORF sont présentés pour aider à la localisation 8,11,15. Hsp70-famille de protéines chaperone et récepteur de la protéine sur la membrane externe des mitochondries ont également été présentés à l'appui de liaison de l'ARNm, ce qui implique en outre que les caractéristiques-protéine codée sont importantes pour la localisation de l'ARNm 16. Ceci est en accord avec un modèle dans lequel la protéine de ribosome-émergentes sert d'élément de reconnaissance pour le ciblage complexe ribosome-ARNm-protéine à la mitochondrie 17.
Traduction localisée près de la mitochondrie a été étudié par diverses méthodes, y compris la microscopie électronique (pour visualiser les ribosomes) 3, FISH 9, ARN vert (pour détecter les ARNm spécifiques) 11, et le fractionnement biochimique (pour détecter l'ARN et des ribosomes) 10,18. Alors que les méthodes antérieures de détecter la localisation in vivo et peuvent permettre la visualisation de la dynamique de transport, celui-ci permet une détection de plusieurs ARNm différents dans une seule expérience. En outre, pour le codage de fractionnement biochimique ou non codantes domaines n'ont pas besoin d'être altation, par conséquent, leurs rôles spécifiques peut être évaluée. Fractionnement biochimique a été utilisée avec succès pendant de nombreuses années, pour l'isolement de nombreux compartiments cellulaires différents. Ses principes et les limites sont bien établies, et on peut facilement modifier les protocoles existants à des fins différentes. L'instrumentation nécessaire est la norme dans de nombreux laboratoires, il est donc généralement la première méthode de choix pour l'étude de la localisation intracellulaire. Nous décrivons un protocole qui a été optimisée pour l'isolement des ARNm tandis que les ribosomes sont associés aux mitochondries. Ce protocole est donc optimale pour étudier les facteurs impliqués dans la traduction localisée près de mitochondries.
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Protocol
Une. Mitochondries Purification
Peser le culot de cellules. Environ 0,6 g sont obtenus à partir de 100 cellules ml.
- Cultivez 100-150 ml de cellules de levure à DO 600 = 1-1,5 à 30 ° C sur un milieu de croissance non-fermentescible, comme milieu de croissance à base de galactose, de façon à enrichir pour des mitochondries.
- Centrifuger les cellules à 3000 g pendant 5 min à température ambiante et jeter le surnageant.
- Laver le culot avec de l'eau distillée deux fois et centrifuger à nouveau. Jeter le surnageant.
- Reprendre le culot dans 1 ml de tampon TNT par 0,5 g de cellules. Il est important de traiter les cellules avec un agent réducteur afin de rompre les liaisons disulfures à l'intérieur de la paroi cellulaire, ce qui améliore l'hydrolyse.
- Incuber les cellules pendant 10 min à 30 ° C avec agitation douce. Pendant ce temps, peser zymolyase 6 mg pour 1 g de cellules et de le suspendre dans le tampon Zymolyase.
- Centrifuger les cellules à 3000 g pendant 5 min untempérature t ambiante et jeter le surnageant.
- Reprendre le culot dans 1 ml de tampon Zymolyase par 0,15 g de cellules. Ne pas vortex.
- Mesurer la DO 600 de 10 ul aliquote de cellules dans 990 ul d'eau.
- Ajouter Zymolyase (étape 1.5) aux cellules d'hydrolyser des polymères de glucose à des liaisons β-1 ,3-glucane et de générer des sphéroplastes. A partir de cette étape, les sphéroplastes doivent être conservés dans une solution isotonique pour éviter la lyse.
- Incuber les cellules pendant 15 min à 30 ° C (pour une activité optimale de zymolyase) avec agitation douce. Pour vérifier l'hydrolyse de la paroi cellulaire et la production de sphéroplastes, mélanger 10 ul de cellules avec 990 ul d'eau. Sphéroplastes sont attendus à la lyse osmotique due à la différence, et la DO 600 devraient être au moins 10 fois inférieure à la valeur déterminée dans l'étape 1.9. Sinon, continuez incubation avec zymolyase pendant 15 min.
- Centrifuger les cellules à 3000 g pendant 5 min à température ambiante. Dis soigneusementcarte du surnageant, comme le culot peut être instable.
- Laver sphéroplastes avec Zymolyase tampon et jeter le surnageant.
- Reprendre sphéroplastes avec 100 ml de milieu de récupération. Transfert sphéroplastes à un Erlenmeyer et incuber pendant 1 heure à 30 ° C avec agitation. Cette étape de récupération est nécessaire, car lors de la translation de Zymolyase traitement est arrêté et la localisation de l'ARNm est perturbée (figure 1B).
- Ajouter 0,1 mg / ml CHX et sphéroplastes de transfert à un tube conique de 50 ml préalablement refroidi. plus de CHX est important de geler l'association des ribosomes avec des ARNm. Ainsi, les ribosomes dépendantes association d'ARNm avec des mitochondries est maintenue.
- sphéroplastes à centrifuger à 3000 g pendant 5 min à 4 ° C et jeter le surnageant.
- Laver deux fois avec le tampon mannitol froid.
- Reprendre sphéroplastes avec 4 ml de tampon mannitol froid et les transférer dans un homogénéisateur Dounce de 15 ml de capacité équipé hermétiquepilon. Briser doucement sphéroplastes avec 15 coups et transférer le lysat dans un tube de 13 ml.
- Centrifuger le lysat à 1500 x g pendant 6 minutes à 4 ° C pour sédimenter les noyaux et les cellules non rompues.
- Soigneusement transférer le surnageant dans un nouveau tube. Mettre de côté 1 ml (25%) de l'échantillon comme un échantillon non fractionnée (échantillon «Total»). Transfert de 50 ml de cet échantillon dans un nouveau tube et ajouter 15 ml de 4X LSB pour l'analyse Western blot. Précipité l'ARN du reste de l'échantillon «Total» (voir le protocole 3, ARN précipitations).
- Centrifuger le surnageant à 10000 g pendant 10 min à 4 ° C pour sédimenter les mitochondries.
- Transférer le surnageant (~ 3 ml) dans un nouveau tube et le garder sur la glace. Il s'agit de la fraction "cytosolique". Transfert de 50 ml de cet échantillon dans un nouveau tube et ajouter 15 ml de 4x LSB pour l'analyse Western blot. ARN précipité du reste de l'échantillon "cytosolique" (Voir Protocol 3, ARN précipitations).
- Laver le culot avec 3 ml de tampon mannitol et centrifuger à 10 000 g pendant 10 min à 4 ° C.
- Reprendre le culot avec 3 ml de mannitol tampon. Cet exemple contient les mitochondries, et appelé fraction «mitochondries». Transfert de 50 ml de cet échantillon dans un nouveau tube et ajouter 15 ml de 4x LSB pour l'analyse Western blot.
2. Extraction de l'ARN
- Ajouter à chaque échantillon un volume de 8 M de guanidinium-HCl et deux volumes d'éthanol à 100%. Vortex et incuber pendant au moins 2 heures à -20 ° C.
- Centrifuger les échantillons à 10 000 g pendant 20 min à 4 ° C. Rejeter le surnageant. Soyez prudent car la pastille peut être instable.
- Laver le culot avec 70% EtOH.
- Reprendre le culot avec 400 ml d'eau sans RNase et transférer l'échantillon dans un nouveau tube Eppendorf.
- Précipiter l'ARN à nouveau en ajoutant 0,1 volume d'acétate de 3 M de sodiume pH 5,2 et deux volumes d'EtOH à 100%. Vortex et incuber pendant au moins 2 heures à -20 ° C.
- Centrifuger les échantillons à 20 000 g pendant 20 min à 4 ° C. Jeter le surnageant et laver avec de l'EtOH à 70%.
- Air sécher le culot et remettre en suspension avec de l'eau sans RNase. échantillons d'ARN de magasin à -80 ° C. Les échantillons peuvent être utilisés pour l'analyse du nord 19 ou analyse de puces à ADN 18 (voir protocole 3).
3. Préparation de l'ARN pour l'analyse de puces à ADN
- Reprendre l'ARNm de l'étape 2.2 avec 650 ml d'eau sans RNase.
- Pour retirer tout l'ADN ou de protéines résiduel, ajouter un volume égal (650 ml) d'acide phénol: chloroforme (5:1, pH 4,7) et vortexer vigoureusement. Centrifuger à vitesse maximale pendant 2 min.
- Transférer 500 ml de la phase supérieure (phase aqueuse) dans un nouveau tube. Évitez de prendre de l'interphase, car il contient de l'ADN. Aussi soyez prudent de prendre phénol, qui peut inhiber la réaction de transcription inverse. </ Li>
- L'échantillon d'ARN contient une quantité importante de l'héparine, qui est un puissant inhibiteur de la transcriptase inverse. Ainsi, par RT-PCR ou le marquage par puce à ADN, il doit être retiré. Retirer l'héparine par la précipitation de LiCl: ajouter LiCl à une concentration finale de 2 M et incuber les échantillons pendant une nuit à -20 ° C.
- Décongeler les échantillons à 4 ° C et centrifuger à 20 000 g pendant 20 min à 4 ° C.
- Prenez soin de le surnageant et laver le culot avec 80% d'éthanol. Centrifuger à nouveau comme décrit dans l'étape 3.5.
- Jeter le surnageant, l'air sec et remettre en suspension le culot dans 150 ml d'eau sans RNase.
- Pour retirer tout résidu LiCl, précipiter à nouveau avec 0,1 volume de 3 M d'acétate de sodium pH 5,3 et 3 volumes d'éthanol à 100%. Incuber à -20 ° C pendant au moins 2 heures.
- Centrifuger à vitesse maximale pendant 20 min à 4 ° C. Laver soigneusement la pastille transparente avec 80% d'éthanol et de l'air sec.
- Reprendre leculot avec de l'eau sans RNase 25 ml et conserver les échantillons à -80 ° C.
- Suivez les étapes de l'étiquetage de l'ARN et hybridation décrit dans 18,20.
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Representative Results
Ce protocole permet la séparation d'une fraction contenant des mitochondries, à partir des composants cytosoliques. La meilleure façon de tester son succès consiste à effectuer une analyse de Northern et une analyse Western (figure 1) à partir des échantillons des différentes étapes d'isolement. Trois paramètres de la qualité de l'isolation sont obtenus à partir de ces analyses. Tout d'abord, si l'ARN ou des protéines dans les échantillons sont intacts - ceux-ci sont détectés en tant que bandes distinctes dans les analyses. événements de dégradation seront induire l'apparition de bandes ou de frottis courts supplémentaires. D'autre part, la comparaison des signaux à partir de chaque étape avec le signal provenant de l'entrée (à savoir Total) fournit des informations importantes concernant les pertes au cours de la préparation. Pertes sévères seront observées comme une différence significative entre le total et la quantité relative de signaux. Enfin, et plus important, la qualité de la séparation entre les composants mitochondriaux et cytosoliques peut être déterminée. Isolement de mitochondri intactesse traduira par un signal pour la transcription mitochondriale transcrit uniquement dans la fraction mitochondriale et non pas dans la fraction cytosolique (Figure 1A). En outre, les protéines qui sont associées mitochondries apparaîtront par western blot seulement à la fraction mitochondriale, et des protéines cytosoliques dans la fraction cytosolique (Figure 1B).
La figure 1 montre deux résultats supplémentaires qui sont la norme pour ce protocole: d'abord, l'association d'ARNm nucléaires codé avec les mitochondries varie entre gènes. On peut voir que ACO1 ARNm, qui code pour une protéine mitochondriale, apparaît surtout dans la fraction de mitochondries, tandis que l'ARNm codant pour la protéine d'actine cytosolique (ACT1) est principalement dans la fraction cytosolique (figure 1C). analyses de génome entier variation révélé entre de nombreux gènes 8,10,21,22 et la base de cette diversité est à l'étendue de la recherche. Deuxièmement, des quantités importantes de materia liés ER-l sont coisolated dans la fraction mitochondriale. L'ARNm codant pour SEC61, qui est ER-associé, est détecté par Northern blot (figure 1A) et la protéine de membrane ER-CUE1 est détectée par western blot (Figure 1B). Cela peut être le résultat des contacts physiques connus entre ER et les mitochondries. Bien purification supplémentaire des mitochondries est possible, il peut introduire certaines limites; ceux-ci sont présentés dans le rapport.
Figure 1. . vérification de la qualité de l'isolation de qualité est testé pour les échantillons prélevés en trois étapes représentatives de la procédure: Avant de fractionnement (Total [étape 1.20], T; fraction cytosolique [étape 1.22], C et fraction mitochondriale [étape 1.24], M). Les échantillons sont soumis à une analyse de Northern (. A, C) ou analyse western (B) A) pour une analyse de Northern des ARNm suivants: COB est un ARN qui est transcrit à l'intérieur des mitochondries donc son signal soit exclusivement dans les mitochondries. Son apparition dans la fraction C indique des mitochondries lyse lors de la préparation. ACT1 est un ARNm qui code pour une protéine cytosolique, et donc traduite par les ribosomes cytosoliques et apparaît la plupart du temps à la fraction C. ACO1 est un ARNm qui code pour une protéine qui est importé dans les mitochondries, et apparaît principalement dans la fraction mitochondriale. SEC61 est un ARNm qui code pour la protéine ERa résident; sa présence dans la fraction H indique la présence de composants de ER dans cette fraction. Le panneau inférieur présente une coloration au bleu de méthylène de la membrane du nord, est que deux ARNr (18S et 25S) sont détectés. Ce panneau montre que beaucoup de ribosomes apparaissent dans la fraction de M. B) de l'analyse Western pour la following protéines: POR1 est une mitochondrie protéine de membrane externe donc son signal est prévu seulement dans la fraction M. Signal dans la fraction C proposera dissociation des composants mitochondriaux lors de la préparation. Hxk1 est une protéine cytosolique et CUE1 est une protéine de ER. Les deux rapport sur la copurification de ces fractions de la fraction de mitochondries. Rpl39 est une protéine ribosomale, ce qui démontre à nouveau la présence de ribosomes dans les deux fractions. Le panneau "Rpl39 sans récupération", présente le fractionnement des ribosomes lorsque le protocole est exclu de l'étape de récupération (étape 1.14). C) d'analyse du Nord pour PC1, un ARNm qui code pour une protéine qui est importé dans les mitochondries. Le gel entier est présentée pour démontrer l'absence de bandes plus courtes, la dégradation-origine. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Les progrès technologiques en matière d'imagerie ont donné des outils de haute résolution pour étudier la localisation des ARNm. Aujourd'hui, on peut mesurer le mouvement même d'une molécule d'ARNm unique à l'échelle de temps ms 23-26. Pourtant, des approches biochimiques traditionnels, comme celui décrit ci-dessus, sont également informative et sont préférables dans certains cas. L'isolement biochimique permet la purification d'un large répertoire d'ARNm et de protéines, et est donc préférable pour les études de l'ensemble du génome. En une seule isolement, on peut obtenir des niveaux d'ARNm suffisantes pour permettre la caractérisation des milliers de gènes, soit par les puces à ADN ou ARN-seq 18,27. En parallèle, on peut isoler des protéines et d'effectuer une analyse protéomique pour caractériser le protéome sur les mitochondries 28. Fractionnements biochimiques peuvent être adaptés pour séparer les mitochondries à partir d'autres organelles cellulaires, en particulier l'ER 29. Ceci peut être avantageux dans certains types de cellules étaient le chevauchement spatial hauteentre ER et les mitochondries obstrue analyses localisation microscopique. Un avantage important de fractionnements biochimiques est leur faible coût, qui permet l'analyse de nombreux échantillons différents. Un avantage connexe est leur simplicité - fractionnement biochimique, comme celui décrit ci-dessus, ne nécessitent pas habituellement laborieux de marquage fluorescent d'ARNm, comme c'est le cas dans les études in vivo d'imagerie. Enfin, de nombreux pièges et artefacts sont déjà diagnostiqués pour ces protocoles traditionnels, donc les contrôles nécessaires sont bien établies.
Le protocole présenté comporte une étape de récupération (étape 1.14) qui suit le traitement de la zymolyase. Cette étape est essentielle parce que la contrainte induite au cours du traitement de zymolyase conduit à un arrêt quasi-immédiat de la translation et de la dissociation des ribosomes à partir des ARNm. Le déclencheur réel de dissociation des ribosomes peut l'une des étapes qui ont inclus dans ce traitement, à savoir l'élimination de la source de carbone, exposure à haute g pendant la centrifugation, traitement avec des agents (TNT) en réduisant, l'enlèvement de la paroi cellulaire par zymolyase ou l'introduction de conditions osmotiques, chacun de ces derniers est connue pour entraîner une arrestation translation. Cette arrestation translation affecte probablement l'association des ribosomes avec les mitochondries. En conséquence, nous avons trouvé que l'association de l'ARNm avec des mitochondries est faible après le traitement zymolyase, et augmente pendant la récupération (non représenté).
La fraction mitochondriale qui est isolé par ce protocole contient une quantité importante de ER, comme le voit par la présence de différents marqueurs de ER (par exemple figure 1). Une volonté manifeste est de supprimer en outre des composants de ER et d'obtenir des mitochondries pur, l'aide de plusieurs protocoles standards qui utilisent des gradients 29-33. Toutefois, ces protocoles nécessitent du décapage des ribosomes de la mitochondrie, soit en raison du traitement de zymolyase stressante (Figure 1B (c'est à dire lorsque les ribosomes réassocier avec les mitochondries), les deux marqueurs de ER et mitochondries sédimentés à la même fraction. C'est probablement parce que les ribosomes associés masquent les différences de leurs densités (données non présentées). Ainsi, pour les études d'association des ribosomes, des méthodes alternatives pour l'isolement de mitochondries devront être mis au point.
Pendant de nombreuses études, cependant, la présence de composants d'ER n'est pas nécessairement un problème. Association des ARNm qui codent pour des protéines mitochondriales bien établies (par exemple,Aconitase, ATP2, Oxa1) est susceptible d'être avec les mitochondries et non le composant de ER dans cette préparation brut. Il est donc recommandé d'utiliser un de ces ARNm mitochondriaux typiques comme les lectures de l'impact sur les mitochondries. Protéines qui n'ont pas été vérifiées comme mitochondrial ne doivent pas être utilisés comme des journalistes, ce qui est particulièrement important si les études d'ARNm du génome sont effectuées (par exemple l'analyse des microréseaux), comme mis-assignées ARNm peuvent introduire une erreur.
Le défi technique majeur de ce protocole est de minimiser la dégradation de l'ARNm. Tout en utilisant des réactifs RNase-free est toujours conseillé, il faut se rappeler que lors de la lyse des cellules d'énormes quantités de RNAses sont lâchés dans la solution. L'héparine est un inhibiteur de la RNAse très efficace et il est ajouté à des quantités significatives. Lorsque de grandes quantités d'extraits sont préparés, son coût relativement faible fournit un avantage supplémentaire par rapport aux autres inhibiteurs de la RNAse. Toutefois, l'héparine inhibe également la transcription inversease, et devrait donc être supprimé pour des études qui impliquent une telle activité enzymatique (par exemple RT-PCR ou ADN étiquetage des puces à ADN). Nous présentons ici une procédure de retrait qui est basé sur LiCl précipitations (étapes 03.04 à 03.10). Cette précipitation élimine efficacement l'héparine, mais également des quantités significatives de apparemment ARNm sont perdus. Sinon, il ya différents spin-colonnes qui sont censés éliminer l'héparine à partir d'échantillons d'ARN, mais nous avons eu un succès limité avec ces derniers.
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Disclosures
Les auteurs déclarent aucun intérêt financier concurrents.
Acknowledgments
Nous remercions les Drs. Erez Eliyahu, Daniel Melamed, Ophry Pines et Doron Rapaport de l'aide et des commentaires lors de la mise en place de ce protocole. Ce travail est financé par l'ISF (numéro de subvention 1193-1109).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yeast Extract | |||
| BactoPeptone | |||
| Galactose | Do not autoclave Galactose | ||
| Growth medium | For mitochondrial enrichment, you should use any nonfermentable carbon source, such as Galactose-based growth medium sterilized 1% Yeast Extract, 2% BactoPeptone, 2% Galactose | ||
| 0.1 M Tris-HCl, pH 9.4 | |||
| 30 mM Tris-HCl, pH 7.6 | |||
| Dithiothreitol (DTT) | |||
| 10 mM DTT Buffer | 0.1 M TrisHCl pH 9.4, 10 mM Dithiothreitol (DTT). Make fresh every time | ||
| 1.2 M Sorbitol | |||
| 4 mM KH2PO4 | |||
| 16 mM K2HPO4 | |||
| 0.2 μm filter | |||
| Zymolyase Buffer | 1.2 M Sorbitol, 4 mM KH2PO4 , 16 mM K2HPO4. Filter this buffer (0.2 μm) and keep at room temperature for future use | ||
| Zymolyase 20T | 20,000 U/g | ||
| Recovery medium | Galactose-based growth medium supplemented with 1 M Sorbitol | ||
| 0.1 mg/ml Cycloheximide (CHX) | |||
| 0.6 M Mannitol | |||
| 5 mM MgAc | |||
| 100 mM KCl | |||
| 0.5 mg/ml Heparin | |||
| 1 mM Phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) | |||
| Mannitol Buffer | 0.6 M Mannitol, 30 mM Tris-HCl pH7.6, 5 mM MgAc, 100 mM KCl. Add freshly: 0.5 mg/ml Heparin, 0.1 mg/ml CHX and 1mM (PMSF). Filter this buffer and use it ice-cold | ||
| 8 M Guanidinium-HCl | |||
| 100% and 70% Ethanol (EtOH) | |||
| 3 M Sodium Acetate, pH 5.2 | |||
| 10 M LiCl stock solution | |||
| 250 mM Tris HCl pH 6.8 | |||
| SDS | |||
| Glycerol | |||
| β-Mercaptoethanol | |||
| Bromophenol blue | |||
| 4x LSB | 250 mM Tris HCl pH 6.8, 8% SDS, 40% Glycerol, 20% β-mercaptoethanol, and 0.02% Bromophenol blue | ||
| Dounce homogenizer of 15 ml capacity equipped with tight fitting pestle |
References
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