Summary
mRNAs רבים קידוד חלבוני המיטוכונדריה משויך הקרום החיצוני מיטוכונדריה. אנו מתארים הליך חלוקה subcellular שמטרתה בידוד של שמרי המיטוכונדריה עם mRNAs הקשורים אליו והריבוזומים. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על תאים שגודל בתנאים מגוונים במטרה לחשוף את המנגנונים של לוקליזציה mRNA ותרגום מקומי ליד המיטוכונדריה.
Abstract
רוב חלבוני המיטוכונדריה מקודדים בגרעין וצריך להיות מיובא לתוך אברון. יבוא עלול להתרחש בזמן שהחלבון מסונתז ליד המיטוכונדריה. תמיכה באפשרות זו נגזר ממחקרים שנעשה לאחרונה, שבו mRNAs רבים קידוד חלבוני המיטוכונדריה הוצגו להיות מקומי כדי קרבת מיטוכונדריה. יחד עם הפגנות קודמות של העמותה 'הריבוזומים עם הקרום החיצוני, תוצאות אלו מצביעות על תהליך תרגום מקומי. תרגום מקומי כזו עשויה לשפר את יעילות יבוא, לספק אתרי רגולציה ייחודיים ולמזער מקרים של ביטוי מחוץ לרחם. מגוון שיטות שימשו כדי לאפיין את הגורמים ומרכיבים אשר מתווכים תרגום מקומי. תקן בין אלה הוא חלוקה subcellular על ידי צנטריפוגה ההפרש. פרוטוקול זה יש את היתרון של בידוד של mRNAs, ריבוזומים וחלבונים בהליך אחד. אלה אז יכולים להיות מאופיינים על ידי מולקולריים ודו שוניםשיטות ochemical. יתר על כן, ניתן ליישם שיטות transcriptomics ופרוטאומיקה לחומר וכתוצאה מכך, ובכך לאפשר לתובנה הגנום כולו. הניצול של שמרי כאורגניזם מודל למחקרים מסוג זה יש את היתרונות של מהירות, עלויות ופשטות. יתר על כן, הכלים הגנטיים המתקדמים וזני מחיקה זמינים להקל על אימות של גורמי מועמד.
Introduction
תאי אוקריוטים מאורגנים בתאים נפרדים, בעלי פונקציות ספציפיות. כדי להשיג את תפקידה, כל תא מכיל מערך ייחודי של חלבונים שחיוניים לפעילותו. מנגנון אפשרי שבאמצעותו חלבונים אלה מתקרבים התא שלהם הוא על ידי 1,2 תרגום לשפה מקומי. בתהליך זה, החלבון מסונתז ביעד שלה על ידי הריבוזומים וmRNAs שנמצאים שם. בין היתרונות האפשריים של תרגום מקומי גדלו יעילות של מיקוד חלבון, ירידה בצורך במלווי חלבון, ומאפשר למנגנוני רגולציה ספציפי לאתר. כמו כן, mRNAs והריבוזומים מקומיים יכולים להיות מאגר מבודד של מכונות תרגום במקרים של מתח הסלולר, כאשר תרגום כללי הוא עצור.
מיטוכונדריה הפכה בשנים האחרונות מודל מרכזי ללמוד תרגום מקומי. רוב חלבוני המיטוכונדריה מקודדים בגרעין, המתורגם בcytosol,ומיובא לאברון. קווים שונים של ראיות מצביעים על כך שרבים מחלבונים אלו מיוצרים בתהליך תרגום מקומי. בתחילה, לימודים במיקרוסקופ אלקטרונים וחלוקה ביוכימיים זוהו הריבוזומים הקשורים למיטוכונדריה 3-5. מחקרים אלה שבו ולאחר מכן אומתו in vivo על ידי עבודה על mRNAs הספציפי, שנמצאו להיות מיובאים רק ב6,7 אופן cotranslational. מחקרי הגנום של mRNAs שיתוף עם המיטוכונדריה חשפו כי חלק משמעותי של mRNAs הם מקומיים לסביבת מיטוכונדריה 8-10. חלקם של mRNAs אלה התאפיינו נוספים על ידי in vivo הקרינה שיטות, כגון דגים או mTAG 9,11. פרשנות ישר קדימה של עמותה זו היא שmRNAs אלה משמש כתבניות לתרגום לשפה מקומית.
המנגנונים שבאמצעותם mRNAs אלה מתקרבים למיטוכונדריה אינם ידועים. תחומים noncoding (רוב significantl3 UTRs 'y) הוצג להיות מעורב בmRNA העמותה למיטוכונדריה 12. תחומים אלה עשויים לשמש כאתר קישור לחלבוני קושרי RNA אשר מתווכים התחבורה שלהם. מחקרים בשמרים גילו כי חבר של משפחת PUM של חלבונים (Puf3) תומך בעמותת mRNA עם מיטוכונדריה 8,13. תפקיד מתקבל על הדעת לPuf3, המבוסס על פונקציות של בני משפחה אחרים, הוא לעכב תרגום ואילו את ה-mRNA הוא הדרך 14. לפיכך, mRNAs עשוי להיות מועבר במעמד nontranslated, על ידי חלבוני RNA מחייבים כי אינטראקציה עם אזורי noncoding. לחלופין, גוף עבודות גדול מצביע על כך שהתחבורה מתרחשת בזמן שהחלבון הוא להיות מסונתזת. בפרט, מעכבי תרגום הוצגו להשפיע mRNAs עמותה 8,13. יתר על כן, תכונות תורגמו כגון אוגוסט, רצף של המיטוכונדריה מיקוד (MTS) או אזורי ORF הוצגו כדי לסייע בלוקליזציה 8,11,15. ch חלבון HSP70 משפחתיaperone וקולטן חלבונים על הקרום החיצוני מיטוכונדריה הוצגו גם כדי לתמוך בעמותת ה-mRNA, רומזים עוד כי תכונות מקודדות חלבונים חשובות ללוקליזציה mRNA 16. זה עולה בקנה אחד עם מודל שבו החלבון המתעוררים-הריבוזום משמש כאלמנט הכרה למיקוד מורכב mRNA-הריבוזום חלבונים למיטוכונדריה 17.
תרגום מקומי ליד המיטוכונדריה נחקר על ידי שיטות שונות, ובכלל זה במיקרוסקופ אלקטרונים (כדי להמחיש הריבוזומים) 3, דגים 9, RNA הירוק (כדי לזהות mRNAs הספציפי) 11, וחלוקה ביוכימי (כדי לזהות שני RNA וריבוזומים) 10,18. בעוד השיטות לשעבר לזהות לוקליזציה in vivo ועשויות לאפשר הדמיה של דינמיקת תחבורה, האחרון מאפשר זיהוי של mRNAs שונים בניסוי יחיד. יתר על כן, לתחומים קידוד חלוקה ביוכימי או noncoding לא צריך להיות אלחזרתי אחורנית, ולכן ניתן להעריך התפקידים הספציפיים שלהם. חלוקה ביוכימיים שמשה בהצלחה במשך שנים רבות, לבידוד תרמי של תאים סלולריים שונים. מנהלים ומגבלותיו מבוססים היטב, ואפשר בקלות לשנות את הפרוטוקולים קיימים למטרות שונות. המכשור הדרוש הוא סטנדרטי במעבדות רבות, ולכן הוא בדרך כלל השיטה הראשונה לבחירה ללימוד לוקליזציה תאית. אנו מתארים פרוטוקול שהיה מותאם לבידוד של mRNAs בעוד הריבוזומים הקשורים למיטוכונדריה. פרוטוקול זה הוא אפוא אופטימלי לחקר גורמים המעורבים בתרגום מקומי ליד המיטוכונדריה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. מיטוכונדריה טיהור
לשקול את גלולה של תאים. בערך 0.6 גרם מתקבלים מ100 תאים למ"ל.
- לגדול 100-150 מיליליטר של תאי שמרים לOD 600 = 1-1.5 ב30 ° C במדיום גידול nonfermentable, כגון מצע גידול מבוסס גלקטוז, על מנת להעשיר למיטוכונדריה.
- תאי צנטריפוגה ב 3,000 XG במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר וזורקים supernatant.
- שטוף את הכדור עם מים מזוקקים כפולים ו צנטריפוגות שוב. בטל supernatant.
- Resuspend גלולה ב 1 מיליליטר DTT הצפת ל0.5 גרם של תאים. חשוב לטיפול בתאים עם סוכן צמצום כדי לשבור את קשרי דיסולפיד בתוך דופן התא, ובכך לשפר את הידרוליזה.
- דגירה התאים עבור 10 דקות ב30 ° C עם רעד עדין. בינתיים, שוקל zymolyase 6 מ"ג לכל 1 גרם של תאים ולהשעות אותו בZymolyase הצפת.
- תאי צנטריפוגה ב 3,000 XG במשך 5 דקותטמפרטורת חדר לא וזורקים supernatant.
- Resuspend גלולה ב 1 מיליליטר Zymolyase הצפת ל0.15 גרם של תאים. לא מערבולת.
- מדוד OD 600 של 10 aliquot μl של התאים ב990 μl מים.
- הוספת Zymolyase (שלב 1.5) לתאים לhydrolyze פולימרים של גלוקוז בβ-1 ,3-גלוקן הקשרים וליצור spheroplasts. מהשלב הזה, צריך להיות כל הזמן spheroplasts בתמיסה איזוטונית כדי להימנע תמוגה.
- דגירה תאים עבור 15 דקות ב 30 מעלות צלזיוס (לפעילות אופטימלית של zymolyase) עם רעד עדין. כדי לוודא הידרוליזה של דופן התא ודור spheroplasts, לערבב 10 μl של התאים עם 990 μl מים. Spheroplasts צפוי lyse בשל הבדל האוסמוטי, ו600 OD צריכים להיות לפחות פי 10 פחות מהשווי שנקבע בשלב 1.9. אם לא, תמשיך דגירה עם zymolyase לעוד דקות 15.
- תאי צנטריפוגה ב 3,000 XG במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר. זהירות דיסכרטיס supernatant, כגלולה עשוי להיות לא יציב.
- שטוף spheroplasts עם Zymolyase הצפת וזורקים supernatant.
- Resuspend spheroplasts עם 100 בינוני שחזור מיליליטר. העבר spheroplasts לבקבוק Erlenmeyer דגירה במשך שעה 1 ב30 ° C עם רעד. צעד התאוששות זו הוא הכרחי שכן בתרגום טיפול Zymolyase נעצר ולוקליזציה mRNA מופרת (איור 1).
- הוסף 0.1 מ"ג / מיליליטר CHX וspheroplasts העברת צינור חרוטי 50 מיליליטר precooled. בנוסף CHX חשוב להקפיא את העמותה 'הריבוזומים עם mRNAs. לפיכך, הריבוזומים תלויים עמותת mRNA עם מיטוכונדריה נשמר.
- spheroplasts צנטריפוגה ב 3,000 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C וזורקים supernatant.
- שטוף פעמיים עם קרה מניטול הצפת.
- Resuspend spheroplasts עם 4 מיליליטר קר מניטול הצפת ולהעביר אותם לhomogenizer Dounce של 15 מיליליטר קיבולת מצויד בהולם בחוזקההעלי. בעדינות לשבור spheroplasts עם 15 משיכות ולהעביר lysate לצינור 13 מיליליטר.
- צנטריפוגה lysate ב1,500 XG במשך 6 דקות ב 4 ° C עד גלולה גרעינים ותאים רצופים.
- להעביר בזהירות את supernatant לצינור חדש. להפריש 1 מיליליטר (25%) של המדגם כמדגם unfractionated (מדגם "סך הכל"). העברת 50 מיליליטר של מדגם זה לצינור חדש ולהוסיף 15 מיליליטר של 4X LSB לניתוח כתם מערבי. משקע RNA משאר המדגם "סך הכל" (ראה פרוטוקול 3, ממטרים RNA).
- צנטריפוגה supernatant ב 10,000 XG 10 דקות ב 4 ° C עד גלולה מיטוכונדריה.
- מעביר את supernatant (~ 3 מיליליטר) לצינור חדש ולשמור אותו על קרח. זה שבריר "Cytosolic". העברת 50 מיליליטר של מדגם זה לצינור חדש ולהוסיף 15 מיליליטר של 4x LSB לניתוח כתם מערבי. משקע RNA משאר המדגם "Cytosolic" (ראה Protocol 3, ממטרים RNA).
- שטוף את הכדור עם 3 מיליליטר מניטול הצפת ו צנטריפוגות שוב ב 10,000 XG 10 דקות ב 4 ° C.
- Resuspend את הכדור עם 3 מיליליטר מניטול הצפת. מדגם זה מכיל את המיטוכונדריה, ומכונה שבר "מיטוכונדריה". העברת 50 מיליליטר של מדגם זה לצינור חדש ולהוסיף 15 מיליליטר של 4x LSB לניתוח כתם מערבי.
2. RNA חילוץ
- הוסף לכל נפח דגימה אחת של ז 8 guanidinium-HCl ושני כרכים של 100% אתנול. וורטקס ו דגירה של לפחות 2 שעות ב-20 ° C.
- צנטריפוגה דגימות 10,000 XG במשך 20 דקות ב 4 ° C. בטל supernatant. להיזהר כמו גלולה עשויה להיות לא יציבה.
- שטוף את הכדור עם EtOH 70%.
- Resuspend את הכדור עם 400 מיליליטר מים RNase ללא ולהעביר את הדגימה לצינור Eppendorf חדש.
- לזרז את הרנ"א שוב על ידי הוספת 0.1 נפח של 3 acetat M נתרןדואר pH 5.2 ושני כרכים של 100% EtOH. וורטקס ו דגירה של לפחות 2 שעות ב-20 ° C.
- צנטריפוגה דגימות 20,000 XG עבור 20 דקות ב 4 ° C. בטל supernatant ולשטוף עם EtOH 70%.
- אוויר יבש גלולה ו resuspend במי RNase חינם. דגימות RNA החנות ב -80 ° C. דוגמאות יכולות לשמש לניתוח צפוני 19 או ניתוח microarray 18 (ראה פרוטוקול 3).
3. הכנת RNA לMicroarray ניתוח
- Resuspend mRNA משלב 2.2 עם 650 מיליליטר מים RNase חינם.
- כדי להסיר כל דנ"א או חלבוני שייר, להוסיף נפח שווה (650 מיליליטר) של פנול חומצי: כלורופורם (5:1, pH 4.7) ומערבולת במרץ. צנטריפוגה במהירות המרבית למשך 2 דקות.
- העבר 500 מיליליטר של השלב העליון (השלב המימית) לצינור חדש. הימנע מלקחת את שלבי ביניים, מכיוון שהיא מכילה DNA. גם להיות זהיר של לקיחת פנול, אשר יכול לעכב את תגובת השעתוק לאחור. </ Li>
- מדגם RNA מכיל כמות משמעותית של הפרין, שהוא מעכב חזק של reverse transcriptase. כך, RT-PCR או תיוג microarray זה צריך להסירו. הסר הפרין על ידי המשקעים LiCl: להוסיף LiCl לריכוז סופי של 2 מ 'ודגירת דגימות במשך הלילה ב -20 ° C.
- להפשיר את הדגימות בשעה 4 מעלות צלזיוס ו צנטריפוגות ב XG 20,000 עבור 20 דקות ב 4 ° C.
- להשליך בזהירות את supernatant לשטוף את הכדור עם 80% אתנול. שוב צנטריפוגות כמתואר בשלב 3.5.
- בטל supernatant, האוויר היבש וresuspend את הכדור ב150 מיליליטר מים RNase חינם.
- כדי להסיר כל LiCl שייר, לזרז שוב עם 0.1 נפח של 3 pH אצטט M נתרן 5.3 ו3 כרכים של 100% אתנול. לדגור על -20 ° C לפחות 2 שעות.
- צנטריפוגה במהירות שיא ל20 דקות ב 4 ° C. שטוף בזהירות את הכדור השקוף עם 80% אתנול ואוויר יבש.
- Resuspendגלולה עם מים RNase ללא 25 מ"ל ולשמור את הדגימות ב -80 ° C.
- בצע את השלבים לתיוג RNA והכלאה מתואר ב18,20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
פרוטוקול זה מאפשר הפרדה של חלק המכיל את המיטוכונדריה מרכיבי cytosolic. הדרך הטובה ביותר לבחון את הצלחתה היא לבצע ניתוח צפוני וניתוח מערבי (איור 1) לדגימות מצעדי הבידוד השונים. שלושה פרמטרים לאיכות הבידוד נגזרים מניתוחים אלו. ראשית, אם RNA או חלבונים בדגימות הם שלמים - אלו יזוהו כלהקות שונות בניתוחים. אירועי השפלה יניעו את המראה של, להקות קצרות נוספות או מריחות. שנית, השוואת האותות מכל שלב עם האות מהקלט (כלומר סה"כ) מספקת מידע חשוב לגבי הפסדים במהלך הכנה. הפסדים חמורים יקויימו כהבדל משמעותי בין סך הכל והכמות היחסית של אות. לבסוף, וחשוב ביותר, באיכות של הפרדה בין המיטוכונדריה ורכיבי cytosolic ניתן לקבוע. בידוד של mitochondri ללא פגעיביא אות לתמליל mitochondrially-עיבד רק בשבריר מיטוכונדריה ולא בשבריר cytosolic (איור 1 א). יתר על כן, חלבונים הקשורים-מיטוכונדריה יופיעו על ידי כתם מערבי רק בשבריר מיטוכונדריה, וחלבונים cytosolic בשבריר cytosolic (איור 1).
איור 1 מדגים שתי תוצאות נוספות, שהנן תקן לפרוטוקול זה: ראשון, עמותה של mRNAs בקידוד הגרעיני עם המיטוכונדריה משתנה בין הגנים. ניתן לראות כי ACO1-mRNA, אשר מקודד חלבון המיטוכונדריה, מופיע בעיקר בחלק המיטוכונדריה, ואילו את ה-mRNA המקודדת את חלבון cytosolic אקטין (ACT1) היא בעיקר בשבריר cytosolic (איור 1 ג). ניתוחי הגנום כל וריאציה חשפה בין גנים רבים 8,10,21,22 והבסיס למגוון הזה נמצא תחת מחקר מקיף. שנית, כמויות משמעותיות של מאטריה הקשורות לחדר מיוןl הם coisolated בשבריר של המיטוכונדריה. MRNA SEC61 הקידוד, שהוא הקשורים לחדר מיון, הוא זוהה על ידי כתם צפוני (איור 1 א) וחלבון ER-קרום Cue1 הוא זוהה על ידי כתם מערבי (איור 1). זה עשוי להיות תוצאה של הקשר הפיזי הידוע בין ER ומיטוכונדריה. בעוד טיהור נוספת של המיטוכונדריה היא אפשרית, זה עשוי להכניס קצת מגבלות; אלה נדונים בדיון.
איור 1. . אימות איכות בידוד האיכות הוא נבדק על דגימות שנלקחו בשלושה שלבים מייצגים את ההליך: לפני חלוקה ([צעד 1.20] סה"כ, T; שבריר cytosolic [צעד 1.22], C; ושבריר המיטוכונדריה [צעד 1.24], ז). דגימות נתונות לניתוח צפוני (., C) או ניתוח מערבי (B)) ניתוח צפון לmRNAs הבא: COB הוא RNA שהוא עיבד בתוך המיטוכונדריה ולכן האות שלה צריכה להיות אך ורק במיטוכונדריה. המראה שלה בשבריר C יציין לתמס המיטוכונדריה במהלך הכנה. ACT1 הוא mRNA שמקודד חלבון cytosolic, ותרגם ולכן על ידי הריבוזומים cytosolic ומופיע בעיקר בחלק ג. ACO1 הוא mRNA שמקודד חלבון שמיובא למיטוכונדריה, ומופיע בעיקר בחלק מיטוכונדריה. SEC61 הוא mRNA שמקודד חלבון תושב חדר מיון; את נוכחותה בשבריר M מעידה על קיומו של רכיבי ER בחלק זה. הפנל התחתון מציג מכתים מתילן כחול של הקרום הצפוני, הוא ששתי rRNAs (18S ו25S) מזוהים. לוח זה מוכיח כי כמות משמעותית של הריבוזומים מופיעה בחלק ז. ב ') הניתוח מערבי לfollowing חלבונים: Por1 הוא חלבון קרום חיצוני מיטוכונדריה ולכן האות שלה צפויה רק בחלק הקטן מהשני. אות בשבריר C תציע ניתוק של רכיבי המיטוכונדריה במהלך הכנה. Hxk1 הוא חלבון cytosolic וCue1 הוא חלבון ER. גם לדווח על copurification של שברים אלה עם שבר מיטוכונדריה. Rpl39 הוא חלבון ריבוזומלי, שוב הוכיח את נוכחותם של הריבוזומים בשני השברים. "Rpl39 ללא התאוששות" הפנל, מציג חלוקה של הריבוזומים כאשר הפרוטוקול אינו כלול בשלב ההתאוששות (שלב 1.14). C) ניתוח צפון לCCP1, ה-mRNA שמקודד חלבון שמיובא למיטוכונדריה. כל ג'ל מוצג כדי להדגים את חוסר להקות קצרות יותר, מקורו-השפלה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
התקדמות טכנולוגית בתחום ההדמיה הניבה כלים ברזולוציה גבוהה ללמוד לוקליזציה mRNA. כיום, ניתן למדוד את התנועה של אפילו מולקולת mRNA אחד בזמן בקנה מידה msec 23-26. עם זאת, גישות ביוכימיות מסורתיות, כפי שתואר לעיל, גם אינפורמטיבי ועדיפים במקרים מסוימים. בידוד ביוכימיים מאפשר טיהור של רפרטואר רחב של mRNAs וחלבונים, ולכן עדיף ללימודי הגנום כולו. בבידוד אחד, אחד יכול להשיג רמות ה-mRNA מספיק כדי לאפשר אפיון של אלפי גנים, או על ידי מערכי DNA או RNA-seq 18,27. במקביל, אפשר לבודד את החלבונים ולבצע ניתוח proteomic לאפיין proteome במיטוכונדריה 28. ניתן להתאים לחלוקות ביוכימית להפריד מיטוכונדריה מאברונים תאיים אחרים, בפרט ER 29. זה עשוי להיות יתרון בסוגים מסוימים של תאים היו החפיפה מרחבית הגבוההבין ER ומיטוכונדריה חוסם לוקליזציה מיקרוסקופית מנתח. יתרון חשוב של חלוקות ביוכימיים הוא העלות הנמוכה שלהם, המאפשרת ניתוח של דגימות רבות ושונות. יתרון נלווה הוא הפשטות שלהם - חלוקה ביוכימיים, כמו זה שתואר לעיל, בדרך כלל אינו דורש תיוג ניאון מייגע של mRNAs, כפי שקורה במחקרי הדמיה vivo. לבסוף, מלכודות וחפצים רבות שכבר אובחנו בפרוטוקולים מסורתיים אלה, ולכן הבקרות הדרושות מבוססות היטב.
הפרוטוקול המובא כרוך צעד התאוששות (שלב 1.14) שעוקב אחר טיפול zymolyase. שלב זה הוא קריטי משום שהמתח המושרה במהלך טיפול zymolyase מוביל למעצר translational כמעט מיידי ודיסוציאציה 'ריבוזומים מmRNAs. ההדק בפועל לניתוק הריבוזומים יכולים כל אחד מהשלבים שכללו בטיפול הזה, כלומר הסרת מקור פחמן, בירידיםיור עד גבוה גרם במהלך צנטריפוגה, טיפול בהפחתת סוכנים (DTT), תא קיר ההסרה על ידי zymolyase או הקדמה של תנאים האוסמוטי גבוהים; כל אחד מאלה ידוע לגרום מעצר translational. מעצר translational זה כנראה משפיע על הקשר של הריבוזומים במיטוכונדריה. בהתאם לכך, מצאנו כי עמותת mRNA עם המיטוכונדריה היא נמוכה לאחר טיפול zymolyase, ועליות במהלך התאוששות (לא מוצגת).
שבריר של המיטוכונדריה שבודד על ידי פרוטוקול זה מכיל כמות משמעותית של ER, כפי שעולה הנוכחות של סמני ER שונים (למשל איור 1). רצון ברור הוא להסיר רכיבים נוספים ER ולקבל מיטוכונדריה הטהורה, תוך שימוש באחד מכמה פרוטוקולים סטנדרטיים לנצל הדרגתיים 29-33. עם זאת, פרוטוקולים אלה מחייבים הפשטה של הריבוזומים של מיטוכונדריה, או בשל טיפול zymolyase מלחיץ (איור 1 ב (כלומר כאשר הריבוזומים לשייך מחדש עם מיטוכונדריה), שני סמני ER ומיטוכונדריה משקעים לאותו שבריר. זה כנראה בגלל הריבוזומים הקשורים לטשטש את ההבדלים בצפיפות שלהם (מידע לא מוצג). כך, מחקרי עמותת הריבוזום, שיטות חלופיות לבידוד המיטוכונדריה צריכים כדי להתפתח.
למחקרים רבים, עם זאת, נוכחותם של רכיבי ER היא לא בהכרח בעייתית. איגוד mRNAs שמקודד חלבוני המיטוכונדריה מבוססים היטב (למשלAconitase, ATP2, Oxa1) הוא צפוי להיות עם המיטוכונדריה ולא רכיב ER בהכנה הגולמי הזה. לכן מומלץ להשתמש באחד mRNAs המיטוכונדריה הטיפוסי אלה כקריאות להשפעה על המיטוכונדריה. אין להשתמש בחלבונים שלא אומתו כהמיטוכונדריה כעיתונאים, זה חשוב במיוחד כאשר מחקרי mRNA הגנום מבוצעים (ניתוח microarray למשל), כמו mRNAs שהוקצה אי עשוי להציג את שגיאה.
האתגר הטכני העיקרי של פרוטוקול זה הוא צמצום השפלה mRNA. תוך שימוש בחומרים כימי RNase ללא מומלץ תמיד, יש לזכור כי על תמוגה של תאי כמויות עצומות של RNases הם שחררו לפתרון. הפרין הוא מעכב RNAse יעיל מאוד והוא הוסיף בכמויות משמעותיות. כאשר כמויות גדולות תמצית מוכנות, העלות הנמוכה יחסית שלה מספקת יתרון נוסף בהשוואה למעכבי RNAse אחרים. הפרין עם זאת, גם מעכב תמליל הפוךASE, ולכן יש להסירם ללימודים שכוללים פעילות האנזימטית כזה (למשל RT-PCR או תיוג microarray-DNA). במסמך זה אנו מציגים את הליך ההסרה, המבוסס על המשקעים LiCl (שלבים 3.4-3.10). ממטרים זו מסיר ביעילות הפרין, אך ככל הנראה גם כמויות משמעותיות של mRNAs הולכים לאיבוד. לחלופין, יש ספין עמודות שונות שאמורות להסיר הפרין מדגימות RNA, ובכל זאת הייתה לנו הצלחה מוגבלת עם אלה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים שום אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
אנו מודים בני הזוג. ארז אליהו, דניאל מלמד, Ophry פינס ודורון רפפורט לעזרה והערות במהלך הקמתה של פרוטוקול זה. עבודה זו ממומנת על ידי הקרן הלאומית למדע (מענק מספר 1193-1109).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yeast Extract | |||
| BactoPeptone | |||
| Galactose | Do not autoclave Galactose | ||
| Growth medium | For mitochondrial enrichment, you should use any nonfermentable carbon source, such as Galactose-based growth medium sterilized 1% Yeast Extract, 2% BactoPeptone, 2% Galactose | ||
| 0.1 M Tris-HCl, pH 9.4 | |||
| 30 mM Tris-HCl, pH 7.6 | |||
| Dithiothreitol (DTT) | |||
| 10 mM DTT Buffer | 0.1 M TrisHCl pH 9.4, 10 mM Dithiothreitol (DTT). Make fresh every time | ||
| 1.2 M Sorbitol | |||
| 4 mM KH2PO4 | |||
| 16 mM K2HPO4 | |||
| 0.2 μm filter | |||
| Zymolyase Buffer | 1.2 M Sorbitol, 4 mM KH2PO4 , 16 mM K2HPO4. Filter this buffer (0.2 μm) and keep at room temperature for future use | ||
| Zymolyase 20T | 20,000 U/g | ||
| Recovery medium | Galactose-based growth medium supplemented with 1 M Sorbitol | ||
| 0.1 mg/ml Cycloheximide (CHX) | |||
| 0.6 M Mannitol | |||
| 5 mM MgAc | |||
| 100 mM KCl | |||
| 0.5 mg/ml Heparin | |||
| 1 mM Phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) | |||
| Mannitol Buffer | 0.6 M Mannitol, 30 mM Tris-HCl pH7.6, 5 mM MgAc, 100 mM KCl. Add freshly: 0.5 mg/ml Heparin, 0.1 mg/ml CHX and 1mM (PMSF). Filter this buffer and use it ice-cold | ||
| 8 M Guanidinium-HCl | |||
| 100% and 70% Ethanol (EtOH) | |||
| 3 M Sodium Acetate, pH 5.2 | |||
| 10 M LiCl stock solution | |||
| 250 mM Tris HCl pH 6.8 | |||
| SDS | |||
| Glycerol | |||
| β-Mercaptoethanol | |||
| Bromophenol blue | |||
| 4x LSB | 250 mM Tris HCl pH 6.8, 8% SDS, 40% Glycerol, 20% β-mercaptoethanol, and 0.02% Bromophenol blue | ||
| Dounce homogenizer of 15 ml capacity equipped with tight fitting pestle |
References
- Holt, C. E., Bullock, S. L. Subcellular mRNA localization in animal cells and why it matters. Science. 326, 1212-1216 (2009).
- Donnelly, C. J., Fainzilber, M., Twiss, J. L. Subcellular communication through RNA transport and localized protein synthesis. Traffic. 11, 1498-1505 (2010).
- Kellems, R. E., Allison, V. F., Butow, R. A. Cytoplasmic type 80 S ribosomes associated with yeast mitochondria. II. Evidence for the association of cytoplasmic ribosomes with the outer mitochondrial membrane in situ. J. Biol. Chem. 249, 3297-3303 (1974).
- Kellems, R. E., Butow, R. A. Cytoplasmic type 80 S ribosomes associated with yeast mitochondria. 3. Changes in the amount of bound ribosomes in response to changes in metabolic state. J. Biol. Chem. 249, 3304-3310 (1974).
- Suissa, M., Schatz, G. Import of proteins into mitochondria. Translatable mRNAs for imported mitochondrial proteins are present in free as well as mitochondria-bound cytoplasmic polysomes. J. Biol. Chem. 257, 13048-13055 (1982).
- Fujiki, M., Verner, K. Coupling of cytosolic protein synthesis and mitochondrial protein import in yeast. Evidence for cotranslational import in vivo. J. Biol. Chem. 268, 1914-1920 (1993).
- Yogev, O., Karniely, S., Pines, O. Translation-coupled translocation of yeast fumarase into mitochondria in vivo. J. Biol. Chem. 282, 29222-29229 (2007).
- Eliyahu, E., et al. Tom20 mediates localization of mRNAs to mitochondria in a translation-dependent manner. Mol. Cell. Biol. 30, 284-294 (2010).
- Garcia, M., et al. Mitochondria-associated yeast mRNAs and the biogenesis of molecular complexes. Mol. Cell. Biol. 18, 362-368 (2007).
- Marc, P., et al. Genome-wide analysis of mRNAs targeted to yeast mitochondria. EMBO Rep. 3, 159-164 (2002).
- Gadir, N., Haim-Vilmovsky, L., Kraut-Cohen, J., Gerst, J. E. Localization of mRNAs coding for mitochondrial proteins in the yeast Saccharomyces cerevisiae. RNA. 17, 1551-1565 (2011).
- Margeot, A., et al. In Saccharomyces cerevisiae, ATP2 mRNA sorting to the vicinity of mitochondria is essential for respiratory function. J EMBO. 21, 6893-6904 (2002).
- Saint-Georges, Y., et al. Yeast mitochondrial biogenesis: a role for the PUF RNA-binding protein Puf3p in mRNA localization. PloS one. 3, (2008).
- Quenault, T., Lithgow, T., Traven, A. PUF proteins: repression, activation and mRNA localization. Trends Cell Biol. 21, 104-112 (2011).
- Garcia, M., Delaveau, T., Goussard, S., Jacq, C. Mitochondrial presequence and open reading frame mediate asymmetric localization of messenger RNA. EMBO Rep. 11, 285-291 (2010).
- Eliyahu, E., Lesnik, C., Arava, Y. The protein chaperone Ssa1 affects mRNA localization to the mitochondria. FEBS Lett. 586, 64-69 (2012).
- Ahmed, A. U., Fisher, P. R. Import of nuclear-encoded mitochondrial proteins: a cotranslational perspective. Int. Rev. Cell Biol. 273, 49-68 (2009).
- Eliyahu, E., Melamed, D., Arava, Y. Genome-wide analysis of RNA extracted from isolated mitochondria. Methods Mol. Biol. 714, 287-299 (2011).
- Eldad, N., Yosefzon, Y., Arava, Y. Identification and characterization of extensive intra-molecular associations between 3'-UTRs and their ORFs. Nucleic Acids RES. 36, 6728-6738 (2008).
- Melamed, D., Arava, Y. Genome-wide analysis of mRNA polysomal profiles with spotted DNA microarrays. Methods Enzymol. 431, 177-201 (2007).
- Margeot, A., et al. Why are many mRNAs translated to the vicinity of mitochondria: a role in protein complex assembly. Gene. 354, 64-71 (2005).
- Mathieu, L., Marsy, S., Saint-Georges, Y., Jacq, C., Dujardin, G. A transcriptome screen in yeast identifies a novel assembly factor for the mitochondrial complex III. Mitochondrion. 11, 391-396 (2011).
- Hocine, S., Raymond, P., Zenklusen, D., Chao, J. A., Singer, R. H. Single-molecule analysis of gene expression using two-color RNA labeling in live yeast. Nat. Methods. 10, 119-121 (2013).
- Park, H. Y., Buxbaum, A. R., Singer, R. H. Single mRNA tracking in live cells. Methods Enzymol. 472, 387-406 (2010).
- Thompson, M. A., Casolari, J. M., Badieirostami, M., Brown, P. O., Moerner, W. E. Three-dimensional tracking of single mRNA particles in Saccharomyces cerevisiae using a double-helix point spread function. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 17864-17871 (2010).
- Tyagi, S. Imaging intracellular RNA distribution and dynamics in living cells. Nat. Methods. 6, 331-338 (2009).
- Garcia, M., Darzacq, X., Devaux, F., Singer, R. H., Jacq, C. Yeast mitochondrial transcriptomics. Methods Mol. Biol. 372, 505-528 (2007).
- Reinders, J., Sickmann, A. Proteomics of yeast mitochondria. Methods Mol. Biol. 372, 543-557 (2007).
- Meisinger, C., Sommer, T., Pfanner, N. Purification of Saccharomcyes cerevisiae mitochondria devoid of microsomal and cytosolic contaminations. Anal. Biochem. 287, 339-342 (2000).
- Glick, B. S., Pon, L. A. Isolation of highly purified mitochondria from Saccharomyces cerevisiae. Methods Enzymol. 260, 213-223 (1995).
- Boldogh, I. R., Pon, L. A. Purification and subfractionation of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. Methods Cell Biol. 80, 45-64 (2007).
- Rieder, S. E., Emr, S. D., et al. Isolation of subcellular fractions from the yeast Saccharomyces cerevisiae. Current protocols in cell biology / editorial board. Bonifacino, J. S. 8, (2001).
- Diekert, K., de Kroon, A. I., Kispal, G., Lill, R. Isolation and subfractionation of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. Methods Cell Biol. 65, 37-51 (2001).
