Summary
ミトコンドリアタンパク質をコードするmRNAの多くはミトコンドリア外膜に関連している。私たちは、それに関連するmRNAおよびリボソームと酵母ミトコンドリアの分離を目的とした細胞下分画の手順が記載されている。このプロトコルは、mRNAの局在化およびミトコンドリア付近の局所的な翻訳の機構を明らかにするために、多様な条件下で増殖させた細胞に適用することができる。
Abstract
ミトコンドリアタンパク質の大部分は核内にエンコードされ、細胞小器官にインポートされる必要がある。タンパク質はミトコンドリアの近くに合成されている間、輸入が発生することがあります。この可能性のサポートは、ミトコンドリアタンパク質をコードするmRNAは、多くのミトコンドリア付近に局在することが示された最近の研究に由来する。一緒に外膜とのリボソーム協会の以前のデモで、これらの結果は、局所的な翻訳プロセスを示唆している。このような局所的な変換は、輸入の効率を向上させる独自の規制部位を提供し、異所性発現の例を最小にすることができる。多様な方法には、局所的な翻訳を媒介する因子および要素を特徴付けるために使用されてきた。これらの中で標準差動遠心分離によって細胞下分画である。このプロトコルは、単一の手順でのmRNA、リボソームとタンパク質の単離できるという利点がある。これらは、次いで、種々の分子と両性によって特徴付けることができるochemical方法。さらに、トランスクリプトミクスおよびプロテオミクス法は、それによってゲノムワイドな洞察を可能にし、得られた材料に適用することができる。そのような研究のためのモデル生物としての酵母の使用は、速度、費用および単純性の利点を有する。さらに、高度な遺伝学的ツールおよび使用可能な削除株が候補因子の検証を容易にします。
Introduction
真核細胞は、特定の機能を有する個別のコンパートメントで構成されています。その機能を実現するためには、各区画には、その活性に必須であるタンパク質の固有のセットが含まれています。これらのタンパク質は、そのコンパートメントにアプローチを通して可能なメカニズムは、ローカライズ、翻訳、1,2である。このプロセスにおいて、タンパク質は、そこに配置されるリボソームおよびmRNAにより目的地に合成される。ローカライズされた翻訳の可能性の利点の中で、タンパク質のターゲティングの効率を増加したタンパク質シャペロンの必要性が減少し、サイト固有の制御機構を可能にしています。また、ローカライズされたmRNAおよびリボソームは、一般的な翻訳が阻害される細胞ストレス、例に翻訳機構の人里離れた貯水池することができます。
ミトコンドリアは、近年ではローカライズされた翻訳を研究するための中心的なモデルとなりました。ほとんどのミトコンドリアタンパク質は、核内に符号化された細胞質ゾルに翻訳され、および細胞小器官にインポート。証拠の様々な線は、これらのタンパク質の多くは局所変換プロセスを介して産生されることを示している。最初に、電子顕微鏡および生化学的分画研究は、ミトコンドリア3-5に関連したリボソームを検出しました。その後、共翻訳的に6,7にのみインポートすることが判明した特定のmRNA上の仕事によってin vivoで裏付けられ、これらの研究。ミトコンドリアでのmRNAの関連のゲノムワイドな研究では、mRNAのかなりの部分がミトコンドリア近傍8月10日に局在していることを明らかにした。これらのmRNAの一部はさらに、FISH又はMタグ9,11などのインビボ蛍光法によって特徴付けした。この関連の直接的な解釈は、これらのmRNAは、ローカライズされた翻訳のための鋳型として作用するということです。
これらのmRNAは、ミトコンドリアに接近するメカニズムは不明である。非コード領域（最もsignificantlyの3 'のUTR）はミトコンドリア12 mRNAの会合に関与することが示された。これらのドメインは、それらの輸送を媒介するRNA結合タンパク質に対する結合部位として機能する可能性がある。酵母での研究では、タンパク質のPUMファミリーのメンバー（Puf3）はミトコンドリア8,13とmRNAの関連付けをサポートしていることを明らかにした。他の家族の機能に基づいておりPuf3、もっともらしい役割は、mRNAは、ルート 14 途中である間の翻訳を抑制することである。従って、mRNAは、非コード領域と相互作用するRNA結合タンパク質によって、非翻訳状態で輸送することができる。あるいは、作業の大きな体は、タンパク質が合成されている間輸送が生じることを示唆している。特に、翻訳阻害剤は、mRNAの会合8,13に影響を与えることが示された。さらに、このようなAUGをミトコンドリア標的化配列（MTS）またはORF領域として翻訳された特徴は、局在8,11,15を補助することが示された。 HSP70ファミリータンパク質のCHミトコンドリア外膜上aperoneおよびタンパク質受容体はさらに符号化されたタンパク質の機能は、mRNAの局在16にとって重要であることを示唆し、mRNAの関連付けをサポートすることが示された。これは、リボソームタンパク質はミトコンドリア新興17へのmRNA-リボソーム-タンパク質複合体を標的化するための認識要素として機能するモデルと一致する。
ミトコンドリアの近くの局在化、翻訳電子顕微鏡（リボソームを可視化するため）3、FISH 9、（特定のmRNAを検出するための）緑色RNA 11と、生化学的分画（RNAおよびリボソームの両方を検出する）10,18を含む様々な方法によって研究された。前者の方法は、インビボでの局在を検出し、トランスポート·ダイナミクスの可視化を可能にすることができるが、後者は単一の実験で多数の異なるmRNAの検出を可能にする。さらに、生化学的分画コードまたは非コードドメインの文献である必要はありませんteredは、したがって、それらの特定の役割を評価することができる。生化学的分画は正常に多くの異なる細胞区画の単離のために、長年にわたって使用されている。そのプリンシパルと制限は十分に確立され、人は簡単に様々な目的のために既存のプロトコルを変更することができます。必要な器具類は、したがって、それは通常、細胞内局在を研究するための選択の第一の方法で、多くのラボで標準です。私たちは、リボソームがミトコンドリアに関連しているながら、mRNAの単離のために最適化されたプロトコルを記述します。このプロトコルは、したがって、ミトコンドリアの近くに局在し、翻訳に関与する因子を研究するために最適である。
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Protocol
1。ミトコンドリア精製
細胞のペレットを計量。おおよそ0.6グラムを100mlの細胞から得られる。
- 30で600 = 1-1.5にOD酵母細胞100〜150ミリリットルの成長 ミトコンドリアを濃縮するために、このようなガラクトースベースの成長培地として非発酵増殖培地上℃、、。
- 室温で5分間3000×gで遠心分離細胞、上清を捨てる。
- 再び蒸留水と遠心でペレットを洗浄。上清を捨てる。
- 細胞の0.5グラム当たり1ミリリットルのDTTバッファーでペレットを再懸濁します。それにより、加水分解性を向上させる、細胞壁内のジスルフィド結合を破壊するために、還元剤で細胞を処理することが重要である。
- 30℃で10分間、細胞をインキュベート 穏やかに振盪しながら℃で。一方、細胞の1グラム当たり6ミリグラムザイモリアーゼを比較検討し、ザイモリアーゼバッファに一時停止。
- 5分A用3000×gで遠心分離細胞Tの室温、上清を捨てる。
- 細胞の0.15グラム当たり1ミリリットルザイモリアーゼバッファーでペレットを再懸濁します。ボルテックスを行います。
- 水990μLでの細胞の10μlアリコートのOD 600を測定します。
- β-1、3 - グルカン結合のグルコースポリマーを加水分解し、フェロプラストを生成する細胞にザイモリアーゼ（ステップ1.5）を追加します。この工程から、スフェロプラストは、溶解を避けるために等張溶液中に維持されるべきである。
- 穏やかに振とうしながら30℃（ザイモリアーゼの最適活性のための）で15分間細胞をインキュベートします。細胞壁の加水分解およびフェロプラストの発生を確認するには、水を990μlの細胞を10μlを混ぜる。スフェロプラストは、浸透圧の差に溶解するために期待され、OD 600は、少なくとも、ステップ1.9で決定された値未満の10倍されるべきである。そうでない場合は、さらに15分間ザイモリアーゼとのインキュベーションを続ける。
- 室温で5分間、3,000×gで遠心分離細胞。慎重にDISカード上清を、ペレットとして不安定になることがあります。
- ザイモリアーゼBufferでフェロプラストを洗浄し、上清を捨てる。
- 100ミリリットルの回復培地でフェロプラストを懸濁します。三角フラスコにフェロプラストを移し、30℃で1時間インキュベート 振とうしながら、Cを°。ザイモリアーゼ治療翻訳中に逮捕され、mRNAの局在が（ 図1B）破壊されたため、この回復手順が必要です。
- 予備冷却50ミリリットルコニカルチューブに0.1 mg / mlのCHXおよび転送フェロプラストを追加します。 CHXの添加は、mRNAとリボソーム協会を凍結することが重要です。このように、ミトコンドリアとリボソーム依存mRNAの関連付けが維持されている。
- 遠心機は、4℃で5分間3000×gでフェロプラスト、上清を捨てる。
- 冷たいマンニトール緩衝液で2回洗浄します。
- 4ミリリットル冷たいマンニトールBufferでフェロプラストを再懸濁し、タイトなフィットを搭載した15ミリリットルの容量のダウンスホモジナイザーに転送乳棒。優しく15ストロークでフェロプラストを破り、13ミリリットルチューブに溶解液を移す。
- 核および破壊されていない細胞をペレット化し、4℃で6分間1500×gで溶解液を遠心分離する。
- 慎重に新しいチューブに上清を移す。未分画サンプル（「合計」サンプル）として確保サンプルの1ミリリットル（25％）を設定します。新しいチューブに移すこのサンプルの50ミリリットルをし、ウエスタンブロット分析のために4倍のLSBの15ミリリットルを追加します。 「合計」のサンプルの残りからの沈殿物のRNA（プロトコル3、RNAの沈殿を参照してください）。
- 4時10分、10,000×gで上清を遠心分離 ミトコンドリアをペレット化°C。
- 新しいチューブに上清（〜3ミリリットル）を転送し、氷の上に保管してください。これは、「細胞質」画分である。新しいチューブに移すこのサンプルの50ミリリットルをし、ウエスタンブロット分析のために4倍のLSBの15ミリリットルを追加します。 「細胞質」は、試料の残りからの沈殿物のRNA（Protのを参照してください。ocol 3、RNA沈殿）。
- 4℃で10分間万×gで再び3ミリリットルマンニトールバッファと遠心でペレットを洗浄
- 3ミリリットルマンニトールバッファーでペレットを再懸濁します。このサンプルでは、ミトコンドリアが含まれ、「ミトコンドリア」画分と呼ぶ。新しいチューブに移すこのサンプルの50ミリリットルをし、ウエスタンブロット分析のために4倍のLSBの15ミリリットルを追加します。
2。 RNA抽出
- 8 MグアニジンHClおよび100％エタノールの2容積の各サンプル1ボリュームに追加。渦と-20℃で少なくとも2時間インキュベート ℃、
- 4で20分間万×gで遠心分離サンプル ℃、上清を捨てる。ペレットが不安定になる可能性があるため注意が必要です。
- 70％エタノールでペレットを洗浄。
- RNaseフリー水400mlでペレットを再懸濁し、新しいエッペンドルフチューブに試料を移す。
- 3 Mナトリウムacetatの0.1容量を追加することで、再びRNAを沈殿E pHは5.2〜100％エタノール2容量の。渦と-20℃で少なくとも2時間インキュベート ℃、
- 4℃で20分間、20,000×gで遠心分離サンプル上清を捨て、70％エタノールで洗浄する。
- 空気がペレットを乾燥し、RNaseフリー水で懸濁します。 -80で保存RNAサンプル ℃、試料は、ノーザン分析19またはマイクロアレイ分析18（プロトコル3を参照）のために使用することができる。
3。マイクロアレイ解析のためのRNAの準備
- RNaseフリー水650ミリリットルと歩調2.2からmRNAを懸濁します。
- 積極的にクロロホルム（5:1、pHは4.7）とボルテックス：残留DNAまたはタンパク質を除去するために、等しい酸性フェノールの量（650ミリリットル）を追加します。 2分間最大速度で遠心分離する。
- 新しいチューブに上相（水相）の500ミリリットルを転送します。それは、DNAが含まれているように、相間を取ることは避けてください。また、逆転写反応を阻害することができるフェノール、服用に注意してください。</李>
- RNAサンプルは、逆転写酵素の強力な阻害剤であるヘパリンの有意な量を含有する。このように、RT-PCRまたはマイクロアレイ標識のためにそれを除去する必要がある。塩化リチウム沈殿によりヘパリンを除去します。2 Mの最終濃度に塩化リチウムを追加し、-20℃で一晩サンプルをインキュベート ℃、
- 4でサンプルを解凍 ℃〜4℃で20分間、20,000×gで遠心
- 慎重に上清を廃棄し、80％エタノールでペレットを洗浄。ステップ3.5で説明したように再び遠心します。
- 上清を捨て、空気乾燥およびRNaseフリー水150ミリリットル中にペレットを再懸濁します。
- 任意の残留のLiClを除去するために、3 M酢酸ナトリウムpHが5.3体積の0.1〜100％エタノールを3倍量で再び沈殿させる。 -20でインキュベートする 少なくとも2時間、Cと°。
- 4で20分間最高速度で遠心 ℃、 80％エタノール、空気乾燥で慎重に透明なペレットを洗浄。
- 再懸濁を25mlのRNaseフリー水を用いてペレット化し、-80℃で試料を維持 ℃、
- 18,20で説明したRNA標識およびハイブリダイゼーションのための手順に従ってください。
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Representative Results
このプロトコルは、細胞質ゾルの構成要素からミトコンドリアを含む画分を分離することができます。その成功をテストする最良の方法は、別の単離段階からサ ンプルにノーザン分析およびウエスタン分析（ 図1）を実行することです。アイソレーション特性のための3つのパラメータは、これらの分析に由来する。まず、サンプル中のRNAまたはタンパク質が無傷であるかどうか - これらは分析において明瞭なバンドとして検出されます。分解イベントは付加的な、より短いバンドまたはスメアの出現を誘導する。第二に、入力（ すなわち合計）からの信号と、各ステップからの信号を比較する準備中に紛失に関する重要な情報を提供しています。重度の損失は、合計した信号の相対量の間に有意な差として観察されるであろう。最後に、そして最も重要な、ミトコンドリア及び細胞質ゾル成分との間の分離の品質を決定することができる。そのままmitochondriの分離唯一のミトコンドリア画分中ではなく、細胞質画分（ 図1A）中のミトコンドリア転写転写産物のシグナルになります。さらに、ミトコンドリア関連しているタンパク質は、ミトコンドリア分画でのウエスタンブロット、および細胞質画分（ 図1B）内の細胞質ゾルのタンパク質によって表示されます。
図1に、このプロトコルの標準である二つの追加の結果を示しています。最初に、ミトコンドリアと核コードmRNAの関連付けは、遺伝子間で変化する。 mRNAは細胞質画分（ 図1C）に主にある細胞質ゾルのアクチンタンパク質（ACT1）をコードしながら、一つは、ミトコンドリアのタンパク質をコードするACO1 mRNAは、ミトコンドリア画分に大部分が表示されていることがわかります。ゲノムワイドな解析は、多くの遺伝子間のばらつき8,10,21,22を明らかにし、この多様性のための基礎は、大規模な研究の下にあります。 ER関連マテリアの第二の、かなりの量Lは、ミトコンドリア画分にcoisolatedている。 ER関連でSEC61をコードするmRNAは、ノーザンブロット（ 図1A）によって検出され、ER膜タンパク質CUE1ウエスタンブロット（ 図1B）によって検出される。これは、ERとミトコンドリア間の既知の物理的に接触の結果かもしれません。ミトコンドリアのさらなる精製が可能であるが、それはいくつかの制限を導入することができ、これらは一覧に記載されている。
図1。分離の品質検証品質は手順の3つの代表的なステップで採取された試料を試験する。分別前（合計[ステップ1.20]、T;細胞質画[ステップ1.22]、C、およびミトコンドリア分画[ステップ1.24]、M）。サンプルは（ノーザン分析にかける次のmRNAのため、C）またはウェスタン分析（B）A）のノーザン分析：COBは、したがって、そのシグナルがミトコンドリアで排他的である必要があり、ミトコンドリアの中に転写されるRNAである。 C画分中のその外観は、製造中にミトコンドリア溶解のが示されます。 ACT1は、細胞質タンパク質をコードするmRNAであるため、サイトゾルリボソームにより翻訳され、C画分で主に現れる。 ACO1は、ミトコンドリアにインポートされたタンパク質をコードするmRNAであり、主にミトコンドリア分画で表示されます。 SEC61は、ER常在性タンパク質をコードするmRNAであり、M画分中のその存在は、この画分中のER成分の存在を示す。下のパネルは、北部の膜のメチレンブルー染色を提示2のrRNA（18Sおよび25S）が検出されている。このパネルには、リボソームのかなりの量がM分に表示されていることを実証している。followi用B）ウエスタン分析ngのタンパク質：POR1、したがって、その信号のみM画分中に予想されるミトコンドリア外膜タンパク質である。 C画分中の信号は、調製中に、ミトコンドリアの成分の解離を示唆するであろう。 Hxk1は、細胞質タンパク質であり、CUE1は、ERタンパク質である。どちらも、ミトコンドリア分画でこれらの画分の同時精製について報告する。 Rpl39は再び両方の画分中のリボソームの存在を証明する、リボソームタンパク質である。プロトコルはCCP1用の回収工程（ステップ1.14）。C）ノーザン分析、ミトコンドリアにインポートされるタンパク質をコードするmRNAの除外されたときにパネル「回復のないRpl39 "は、リボソームの分画を提示します。ゲル全体が短く、劣化由来のバンドがないことを示すために提示されている。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
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Discussion
画像内の科学技術の進歩は、mRNAの局在を研究するため、高解像度のツールが得られていた。今日、人はミリ秒時間スケール23-26においても単一のmRNA分子の動きを測定することができる。しかし、上述のものなどの従来の生化学的アプローチもまた、有益であり、いくつかの場合に好適である。生化学的隔離はmRNAおよびタンパク質の大きなレパートリーの精製を可能にし、従って、ゲノムワイドな研究のために好ましい。単離において、一方はDNAマイクロアレイ又はRNA-seqの18,27のいずれかによって、何千もの遺伝子の特徴付けを可能にするのに十分なmRNAレベルを得ることができる。並行して、一方がタンパク質を単離ミトコンドリア28上プロテオームを特徴付けるためにプロテオーム解析を実行することができる。生化学的分画は、他の細胞小器官、特にER 29からミトコンドリアを分離するように適合させることができる。これは、細胞の種類によっては有利であり得る高い空間的な重なりあったERおよびミトコンドリアの間で顕微鏡的局在解析を妨害する。生化学分画の重要な利点は、多くの異なるサンプルの分析を可能にする、低コストである。 in vivoイメージング研究の場合のように、生化学的分画、上記の1のように、通常はmRNAの面倒蛍光タグ付けを必要としない-関連利点は、そのシンプルさです。最後に、多くの落とし穴とアーティファクトは、すでにそのために必要なコントロールが十分に確立されている、これらの伝統的なプロトコルのために診断されています。
提示されたプロトコルは、ザイモリアーゼ治療に続く回収工程（ステップ1.14）を必要とする。ザイモリアーゼ治療時の応力がほぼ即時の翻訳停止およびmRNAからリボソーム「解離につながるため、この手順は非常に重要です。リボソーム解離のための実際のトリガは、この処理に含まれるステップのいずれかにおいて、炭素源の除去、すなわち缶エキスポ遠心分離中、高gのウレア剤（DTT）を還元による処理、ザイモリアーゼ又は高浸透圧条件の導入による細胞壁の除去、これらの各々は、翻訳停止を誘導することが知られている。この並進逮捕はおそらく、ミトコンドリアとリボソームとの会合に影響を与えます。従って、我々は、ミトコンドリアを有するmRNAのアソシエーションがザイモリアーゼ処理後に低く、回復中に増加する（図示せず）ことがわかった。
このプロトコルにより単離するミトコンドリア分画は、種々のERマーカーの存在から明らかなようにERかなりの量（ 例えば 、 図1）を含む。明らかな願望は、さらに、ER成分を除去して純粋なミトコンドリアを得るために、勾配29〜33を利用するいくつかの標準プロトコルの一つを使用している。しかし、これらのプロトコルは、ストレスの多いチモリアーゼ処理に（ 図1Bのどちらか、ミトコンドリアのリボソームのストリッピング必要すなわち、リボソーム、ミトコンドリアに再アソシエートする場合）からの回復の後勾配分離を適用した場合、例えば、両方のERおよびミトコンドリアのマーカーは、同じ画分を沈降させた。関連するリボソームが（データは示さず）、それらの密度の差を曖昧ためと考えられる。従って、リボソーム関連研究のために、ミトコンドリアの単離のための代替の方法が開発される必要がある。
多くの研究のために、しかしながら、ER成分の存在は必ずしも問題にはならない。十分に確立されたミトコンドリアタンパク質をコードするmRNAの協会（ 例えばアコニターゼ、ATP2、Oxa1）は、この粗調製におけるミトコンドリアなく、ERコンポーネントである可能性が高い。従って、ミトコンドリアへの影響のための読み出しとして、これらの典型的なミトコンドリアのmRNAのいずれかを使用することをお勧めします。ゲノムワイドのmRNA研究が行われた場合、これは特に重要である（ 例えば、マイクロアレイ分析）を、誤って割り当てられたmRNAは誤差を生じることができるように、ミトコンドリアは、レポーターとして使用されるべきではないと検証されなかったタンパク質。
このプロトコルの主な技術的課題は、mRNA分解を最小限に抑えている。 RNA分解酵素を含まない試薬を使用してが常に推奨されている間、1は、細胞の溶解の際にリボヌクレアーゼ、膨大な量の溶液に解き放たれていることを覚えておいてください。ヘパリンは非常に効果的なRNアーゼ阻害剤であり、有意な量で添加される。大規模な抽出ボリュームが用意されている場合には、その比較的低いコストは、他のRNA分解酵素阻害剤に比べて付加的な利点を提供します。ヘパリンは、しかしながら、逆転写を阻害するアーゼ、したがって、そのような酵素活性を伴う研究のために除去されるべきである（ 例えば RT-PCRやDNAマイクロアレイ標識）。ここに私たちは、塩化リチウムの析出（ステップ3.4から3.10）に基づいており、取り外し手順を提示する。この沈殿は、効果的にヘパリンを除去するが、mRNAの外見上も、かなりの量が失われます。あるいは、RNAサンプルからヘパリンを除去することになって、まだ我々はこれらに限定された成功を収めていている様々なスピンカラムがあります。
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Disclosures
著者らは、競合する経済的利益を宣言していません。
Acknowledgments
私たちは、博士に感謝します。 Erezさんエリヤフ、ダニエル·メラメド、Ophry松やドロンラパポートこのプロトコルの確立中助けとコメント。この作品は、ISF（承認番号が1193年から1109年）によって資金を供給される。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yeast Extract | |||
| BactoPeptone | |||
| Galactose | Do not autoclave Galactose | ||
| Growth medium | For mitochondrial enrichment, you should use any nonfermentable carbon source, such as Galactose-based growth medium sterilized 1% Yeast Extract, 2% BactoPeptone, 2% Galactose | ||
| 0.1 M Tris-HCl, pH 9.4 | |||
| 30 mM Tris-HCl, pH 7.6 | |||
| Dithiothreitol (DTT) | |||
| 10 mM DTT Buffer | 0.1 M TrisHCl pH 9.4, 10 mM Dithiothreitol (DTT). Make fresh every time | ||
| 1.2 M Sorbitol | |||
| 4 mM KH2PO4 | |||
| 16 mM K2HPO4 | |||
| 0.2 μm filter | |||
| Zymolyase Buffer | 1.2 M Sorbitol, 4 mM KH2PO4 , 16 mM K2HPO4. Filter this buffer (0.2 μm) and keep at room temperature for future use | ||
| Zymolyase 20T | 20,000 U/g | ||
| Recovery medium | Galactose-based growth medium supplemented with 1 M Sorbitol | ||
| 0.1 mg/ml Cycloheximide (CHX) | |||
| 0.6 M Mannitol | |||
| 5 mM MgAc | |||
| 100 mM KCl | |||
| 0.5 mg/ml Heparin | |||
| 1 mM Phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) | |||
| Mannitol Buffer | 0.6 M Mannitol, 30 mM Tris-HCl pH7.6, 5 mM MgAc, 100 mM KCl. Add freshly: 0.5 mg/ml Heparin, 0.1 mg/ml CHX and 1mM (PMSF). Filter this buffer and use it ice-cold | ||
| 8 M Guanidinium-HCl | |||
| 100% and 70% Ethanol (EtOH) | |||
| 3 M Sodium Acetate, pH 5.2 | |||
| 10 M LiCl stock solution | |||
| 250 mM Tris HCl pH 6.8 | |||
| SDS | |||
| Glycerol | |||
| β-Mercaptoethanol | |||
| Bromophenol blue | |||
| 4x LSB | 250 mM Tris HCl pH 6.8, 8% SDS, 40% Glycerol, 20% β-mercaptoethanol, and 0.02% Bromophenol blue | ||
| Dounce homogenizer of 15 ml capacity equipped with tight fitting pestle |
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