Summary
Muitos mRNAs que codificam as proteínas mitocondriais são associados com a membrana exterior mitocondrial. Descreve-se um processo de fracionamento subcelular que visa o isolamento de mitocôndrias de levedura com seus mRNAs e ribossomos associados. Este protocolo pode ser aplicado a células cultivadas sob diversas condições, a fim de revelar os mecanismos de localização de mRNA e tradução localizada perto das mitocôndrias.
Abstract
A maioria das proteínas mitocondriais são codificados no núcleo e precisam ser importadas para a organela. Import pode ocorrer enquanto que a proteína é sintetizada próximo da mitocôndria. O suporte para esta possibilidade é derivado de estudos recentes, em que muitos mRNAs que codificam proteínas mitocondriais foram mostrados para ser localizado para a vizinhança mitocôndria. Juntamente com as demonstrações anteriores de associação dos ribossomos com a membrana externa, estes resultados sugerem um processo de tradução localizada. Tal tradução localizada pode melhorar a eficiência de importação, fornecer locais únicos de regulação e minimizar os casos de expressão ectópica. Diversos métodos têm sido utilizados para caracterizar os elementos e elementos que medeiam a tradução localizado. Padrão entre estes é o fraccionamento subcelular por centrifugação diferencial. Este protocolo apresenta a vantagem de isolamento de ARNm, ribossomas e proteínas num único processo. Estes podem, então, ser caracterizada por vários molecular e bimétodos ochemical. Além disso, transcriptómica e proteómica métodos pode ser aplicada ao material resultante, assim, permitir percepções de todo o genoma. A utilização de leveduras como organismo-modelo para tais estudos tem as vantagens de rapidez, simplicidade e custos. Além disso, as ferramentas genéticas avançadas e estirpes de deleção disponíveis facilitar a verificação de factores candidatos.
Introduction
As células eucarióticas são organizados em compartimentos distintos que possuem funções específicas. Para cumprir a sua função, cada compartimento contém um conjunto exclusivo de proteínas que são essenciais para a sua actividade. Um possível mecanismo pelo qual estas proteínas se aproximam de seu compartimento é de 1,2 localizada tradução. Neste processo, a proteína é sintetizada no destino por ribossomas e mRNAs que são aí localizados. Entre as vantagens prováveis de tradução localizada são o aumento da eficiência do direcionamento de proteínas, diminuição da necessidade de acompanhantes de proteína, e permitindo que os mecanismos de regulação específicas do site. Além disso, mRNAs e ribossomas localizados podem ser um reservatório isolado de máquinas de tradução em casos de estresse celular, quando a tradução geral é inibida.
As mitocôndrias se tornou nos últimos anos um modelo central para estudar tradução localizada. A maioria das proteínas de mitocôndrias são codificadas no núcleo, traduzida no citoplasma,e importadas para a organela. Várias linhas de evidência indicam que muitas destas proteínas são produzidas através de um processo de tradução local. Inicialmente, os estudos de microscopia eletrônica e de fracionamento bioquímico detectado ribossomos associados mitocôndrias 3-5. Estes estudos, onde, em seguida, corroborado in vivo pelo trabalho em mRNAs específicos, que foram encontrados para ser importados em um 6,7 maneira cotranslational. Estudos genômicos de mRNAs associação com mitocôndrias revelou que uma fracção significativa dos mRNAs são localizadas na vizinhança mitocôndrias 8-10. Alguns destes mRNAs foram adicionalmente caracterizados in vivo por métodos de fluorescência, tais como peixes ou MTAG 9,11. A interpretação direta desta associação é que esses mRNAs servir como modelos para tradução localizada.
Os mecanismos pelos quais estas se aproximam dos mRNAs mitocôndrias são desconhecidas. Domínios não-codificante (mais significantly 3 'UTRs) mostraram estar envolvidas na associação de mRNA para a mitocôndria 12. Estes domínios são susceptíveis de servir como um local de ligação a proteínas de ligação a ARN que medeiam o seu transporte. Estudos em levedura revelou que um membro da família de proteínas de PUM (Puf3) apoia associação ARNm com mitocôndrias 8,13. Um papel plausível para Puf3, que se baseia em funções de outros membros da família, é para inibir a tradução do mRNA, enquanto está a caminho 14. Assim, os mRNAs podem ser transportados num estado não traduzida, por proteínas de ligação de ARN que interagem com regiões não codificantes. Alternativamente, um grande corpo de trabalho sugere que ocorre o transporte, enquanto a proteína está a ser sintetizado. Em particular, os inibidores de tradução foram mostrados para afetar mRNAs associação 8,13. Além disso, os recursos traduzidos como a agosto, a sequência de direcionamento mitocondrial (MTS) ou regiões ORF foram mostrados para ajudar na localização 8,11,15. Ch proteína Hsp70-famíliaaperone e receptor de proteína de membrana externa as mitocôndrias foram também demonstrado que suporta associação ARNm, implicando que mais características codificado em proteínas são importantes para a localização de mRNA 16. Isto é consistente com um modelo no qual a proteína-ribossoma emergente serve como elemento de reconhecimento para a segmentação complexo ribossoma-ARNm-proteína para a mitocôndria 17.
Tradução localizada perto da mitocôndria foi estudado por vários métodos, incluindo a microscopia de electrões (para visualizar ribossomas) 3, FISH 9, RNA verde (para detectar os mRNAs específicos) 11, e fraccionamento bioquímico (para detectar os níveis de RNA e ribossomas) 10,18. Enquanto os métodos anteriores detectar a localização in vivo e pode permitir a visualização dinâmica de transporte, este último permite a detecção de vários mRNAs diferentes em uma única experiência. Além disso, para codificação de fracionamento bioquímico ou não-codificantes domínios não precisa ser altrado, por conseguinte, as suas funções específicas, podem ser avaliadas. Fraccionamento bioquímico tem sido utilizado com sucesso durante muitos anos, para o isolamento de diversos compartimentos celulares diferentes. Seus princípios e limitações estão bem estabelecidos, e pode-se facilmente modificar os protocolos existentes para finalidade diferente. A instrumentação necessária é padrão em muitos laboratórios, portanto, é geralmente o primeiro método de escolha para estudar a localização intracelular. Descreve-se um protocolo que foi optimizado para o isolamento de ARNm, enquanto ribossomas estão associados com a mitocôndria. Este protocolo é, portanto, ideal para o estudo de fatores envolvidos na tradução localizada perto mitocôndria.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. As mitocôndrias Purificação
Pesa-se o sedimento de células. Aproximadamente 0,6 g é obtido a partir de 100 células ml.
- Crescer 100-150 ml de células de levedura para OD 600 = 1-1,5 em 30 ° C em um meio de crescimento não fermentável, tal como o meio de crescimento à base de galactose, de modo a enriquecer a mitocôndria.
- Células de centrífuga a 3000 xg durante 5 min à temperatura ambiente e desprezar o sobrenadante.
- Lave o pellet com água bidestilada e centrifugar novamente. Desprezar o sobrenadante.
- Ressuspender o sedimento em 1 ml de tampão de DTT por 0,5 g de células. É importante para o tratamento das células com um agente de redução, a fim de quebrar as ligações dissulfureto dentro da parede da célula, aumentando assim a hidrólise.
- Incubar as células durante 10 min a 30 ° C com agitação suave. Enquanto isso, a pesar de 6 mg Zymolyase por 1 g de células e suspendê-lo em Zymolyase Buffer.
- Células de centrífuga a 3000 xg durante 5 minutos, umatemperatura ambiente t e descartar o sobrenadante.
- Ressuspender o sedimento em 1 ml de Tampão de Zymolyase por 0,15 g de células. Não vórtice.
- Medida OD600 de 10 uL alíquotas de células em 990 ul de água.
- Adicionar Zymolyase (passo 1.5) para as células para hidrolisar os polímeros de glicose aos β-1 ,3-glucano de ligações e gerar esferoplastos. A partir deste passo, esferoplastos deve ser mantida numa solução isotónica, a fim de evitar lise.
- Incubar as células durante 15 min a 30 ° C (para a actividade óptima de Zymolyase) com agitação suave. Para verificar a hidrólise da parede celular e geração de esferoplastos, misturar 10 mL de células com 990 ul de água. Os esferoplastos são esperados para lisar devido à diferença osmótico, e o OD 600 deve ser pelo menos 10 vezes menor do que o valor determinado no passo 1.9. Se não, continue a incubação com Zymolyase por mais 15 min.
- Células de centrífuga a 3000 xg durante 5 min à temperatura ambiente. Dis Cuidadosamentecartão do sobrenadante, o sedimento como pode ser instável.
- Lave esferoplastos com Zymolyase buffer e descartar o sobrenadante.
- Ressuspender esferoplastos com 100 ml meio de recuperação. Transferir esferoplastos para um balão Erlenmeyer e incubar durante 1 hora a 30 ° C com agitação. Este passo de recuperação é necessário uma vez que durante a tradução tratamento Zymolyase é preso e localização do mRNA é interrompido (Figura 1B).
- Adicionar 0,1 mg / ml CHX e esferoplastos de transferência para uma de 50 ml pré-resfriada tubo cônico. Além CHX é importante para congelar associação dos ribossomos com mRNAs. Assim, a associação mRNA ribossomos dependentes com mitocôndrias é mantida.
- Esferoplastos Centrifugar a 3.000 xg durante 5 min a 4 ° C e desprezar o sobrenadante.
- Lavar duas vezes com frio manitol Buffer.
- Ressuspender esferoplastos com 4 ml frio manitol buffer e transferi-los para um homogeneizador Dounce de 15 ml de capacidade equipado com ajuste apertadopilão. Gentilmente quebrar esferoplastos com 15 tacadas e transferir o lisado para um tubo de 13 ml.
- Centrifuga-se o lisado a 1,500 xg durante 6 minutos a 4 ° C para sedimentar os núcleos e as células intactas.
- Transferir cuidadosamente o sobrenadante para um novo tubo. Separe 1 ml (25%) da amostra como uma amostra não fracionada (amostra "Total"). Transferência de 50 mL desta amostra para um novo tubo e adicionar 15 ml de 4X LSB para análise de Western blot. O precipitado de RNA a partir do resto da amostra "total" (Ver Protocolo 3, a precipitação do RNA).
- Centrifugar o sobrenadante a 10.000 xg durante 10 min a 4 ° C para sedimentar as mitocôndrias.
- Transferir o sobrenadante (~ 3 mL) para um tubo novo e mantê-lo em gelo. Esta é a fracção "citosólica". Transferência de 50 mL desta amostra para um novo tubo e adicionar 15 ml de 4x LSB para análise de Western blot. O precipitado de RNA a partir do resto da amostra "citosólica" (Ver Protocol 3, RNA de precipitação).
- Lava-se a pelete com 3 ml de tampão de manitol e centrifugar novamente a 10.000 xg durante 10 min a 4 ° C.
- Ressuspender o sedimento em 3 ml de tampão de manitol. Este exemplo contém a mitocôndria, e referido como fração "mitocôndrias". Transferência de 50 mL desta amostra para um novo tubo e adicionar 15 ml de 4x LSB para análise de Western blot.
2. Extração de RNA
- Adicionar a cada amostra de um volume de 8 M de guanidina-HCl e dois volumes de etanol a 100%. Vortex e incubar durante pelo menos 2 horas a -20 ° C.
- Centrifugar as amostras a 10.000 xg durante 20 min a 4 ° C. Elimine o sobrenadante. Tenha cuidado, pois o pellet pode ser instável.
- Lavar o sedimento com 70% de EtOH.
- Ressuspender o sedimento em 400 ml de água isenta de RNase e transferir a amostra para um novo tubo de Eppendorf.
- Precipitar o ARN de novo por adição de 0,1 volume de 3 M de sódio acetate pH 5,2 e dois volumes de EtOH a 100%. Vortex e incubar durante pelo menos 2 horas a -20 ° C.
- Centrifugar as amostras a 20.000 xg durante 20 min a 4 ° C. Descartar o sobrenadante e lava-se com EtOH a 70%.
- O ar seco do pellet e ressuspender com água RNase-free. As amostras de RNA a -80 loja ° C. As amostras podem ser utilizadas para a análise Northern ou análise de microarray 19 18 (ver Protocolo 3).
3. Preparando o RNA para Análise Microarray
- Ressuspender o mRNA a partir do passo 2,2, com 650 ml de água isenta de RNase.
- Para remover qualquer ADN residual ou proteínas, adicionar um volume igual (650 mL) de ácido fenol: clorofórmio (5:1, pH 4,7) e vórtex vigorosamente. Centrifugar a velocidade máxima por 2 min.
- Transferir 500 ml da fase superior (fase aquosa) para um tubo novo. Evite tomar a interfase, pois ele contém DNA. Também deve ter cuidado de tomar fenol, o que pode inibir a reação de transcrição reversa. </ Li>
- A amostra de ARN contém uma quantidade significativa de heparina, que é um potente inibidor da transcriptase inversa. Assim, por RT-PCR ou rotulagem microarray que precisa ser removida. Retirar heparina por LiCl precipitação: adicionar LiCl até uma concentração final de 2 M e incuba-se as amostras durante a noite a -20 ° C.
- Descongelar as amostras a 4 ° C e centrifuga-se a 20000 xg durante 20 min a 4 ° C.
- Descartar cuidadosamente o sobrenadante e lavar o sedimento com etanol a 80%. Centrifugar novamente como descrito na etapa 3.5.
- Rejeitar o sobrenadante, o ar seco e ressuspender o sedimento em 150 ml de água isenta de RNase.
- Para remover qualquer LiCl residual precipitar novamente com 0,1 volume de 3 M acetato de sódio pH 5,3 e 3 volumes de etanol a 100%. Incubar a -20 ° C durante pelo menos 2 horas.
- Centrifugar a velocidade máxima por 20 min a 4 ° C. Lavar cuidadosamente a pelete transparente com etanol a 80% e ar seco.
- Ressuspender opellet com 25 ml de água livre de RNase e manter as amostras a -80 ° C.
- Siga os passos para a rotulagem RNA e hibridização descrito em 18,20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Este protocolo permite a separação de uma fracção contendo mitocôndrias de componentes citosólicos. A melhor maneira de testar o seu êxito é realizar análise Northern e análise de Western (Figura 1) a partir de amostras dos diferentes passos de isolamento. Três parâmetros para a qualidade de isolamento são derivadas a partir destas análises. Em primeiro lugar, quando o RNA ou proteínas nas amostras estão intactos - estes serão detectados como bandas distintas nas análises. Eventos de degradação vai induzir o aparecimento de bandas, mais curtos ou manchas adicionais. Em segundo lugar, comparando os sinais de cada passo com o sinal de entrada (isto é, total) fornece informações importantes sobre as perdas durante a preparação. Severas perdas serão observadas como uma diferença significativa entre o total ea quantidade relativa de sinal. Finalmente, e mais importante, a qualidade da separação entre mitocondrial e componentes citosólicos pode ser determinada. Isolamento de mitochondri intactasum vai resultar no sinal de transcrição para as mitocôndrias-transcritas apenas na fracção de mitocôndrias e não na fracção citosólica (Figura 1A). Além disso, as proteínas que estão associadas-mitocôndria aparece por western blot apenas na fracção de mitocôndrias, e proteínas citosólicas na fracção citosólica (Figura 1B).
A Figura 1 mostra dois resultados adicionais que são padrão para este protocolo: primeiro, a associação de mRNAs nucleares codificados com mitocôndrias varia entre genes. Pode-se ver que ACO1 mRNA, que codifica uma proteína mitocondrial, aparece principalmente na fracção de mitocôndrias, enquanto que o ARNm que codifica para a proteína actina citosólica (ACT1) está principalmente na fracção citosólica (Figura 1C). Análise de todo o genoma revelou variação entre muitos genes 8,10,21,22 ea base para essa diversidade está sob uma extensa pesquisa. Segundo, quantidades significativas de materia-relacionados ERl são coisolated na fração mitocondrial. O ARNm que codifica SEC61, que é associado-ER, é detectada por transferência de Northern (Figura 1A) e a proteína da membrana do ER-Cue1 é detectado por Western blot (Figura 1B). Este pode ser um resultado dos contatos físicos conhecidos entre ER e mitocôndrias. Enquanto purificação das mitocôndrias é possível, pode apresentar algumas limitações, as quais são discutidas na discussão.
Figura 1. . Verificação da qualidade de isolamento de qualidade é testada para as amostras colhidas em três passos representativos do processo: antes de fraccionamento (total [passo 1,20], T; fracção citosólica [passo 1,22], C, e fracção mitocondrial [passo 1,24], M). As amostras são submetidas a análise de Northern (. A, C) ou a análise de Western (B) A) análise de Northern dos ARNm seguintes: COB é um RNA transcrito que está dentro das mitocôndrias, por conseguinte, o sinal deve ser exclusivamente nas mitocôndrias. Sua aparência na fração C indicará das mitocôndrias lise durante a preparação. ACT1 é um ARNm que codifica para uma proteína citosólica, e, portanto, traduzida pelos ribossomas citosólicas e aparece principalmente na fracção C. ACO1 é um mRNA que codifica uma proteína que é importado para a mitocôndria, e aparece principalmente na fracção de mitocôndrias. SEC61 é um mRNA que codifica uma proteína residente do ER, a sua presença na fracção M indica a presença de componentes de ER nesta fracção. O painel inferior apresenta uma coloração azul de metileno da membrana do norte, é que são detectados dois rRNAs (18S e 25S). Este painel mostra que quantidades significativas de ribossomas aparecer na fracção M. B) para a análise de Western following proteínas: POR1 é uma proteína de membrana externa de mitocôndrias, por conseguinte, o sinal é esperado apenas na fracção M. Sinal na fração C irá sugerir a dissociação dos componentes mitocondriais durante a preparação. Hxk1 é uma proteína citosólica e Cue1 é uma proteína ER. Ambos relatórios sobre a copurification dessas frações com a fração mitocôndria. Rpl39 é uma proteína ribossomal, demonstrando novamente a presença de ribossomas em ambas as fracções. O painel "Rpl39 sem recuperação", apresenta o fracionamento dos ribossomos quando o protocolo é excluído da etapa de recuperação (passo 1.14). C) análise do Norte para CCP1, um mRNA que codifica uma proteína que é importado para a mitocôndria. Todo o gel é apresentado para demonstrar a falta de bandas, originou-degradação mais curtos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Os avanços tecnológicos no processamento de imagens tinha rendido ferramentas de alta resolução para estudar a localização mRNA. Hoje, pode-se medir o movimento de mesmo uma única molécula de mRNA na escala de tempo ms 23-26. No entanto, as abordagens bioquímicas tradicionais, como os descritos acima, também são informativos e são preferíveis em alguns casos. Isolamento bioquímico permite a purificação de um grande reportório de ARNm e proteínas, e por isso é preferível para estudos genômicos. Numa única isolamento, pode-se obter os níveis de mRNA suficientes para permitir a caracterização de milhares de genes, ou por microarranjos de DNA ou RNA-seq 18,27. Paralelamente, pode-se isolar proteínas e realizar uma análise proteômica para caracterizar o proteoma em mitocôndrias 28. Fraccionamentos bioquímicos pode ser adaptado para separar as mitocôndrias de outros organelos, em particular, o ER 29. Isto pode ser vantajoso, em alguns tipos de células eram o alto sobreposição espacialentre ER e mitocôndrias obstrui analisa localização microscópica. Uma vantagem importante de fraccionamentos bioquímicas é o seu baixo custo, que permite a análise de muitas amostras diferentes. Uma vantagem relacionada é a sua simplicidade - fraccionamento bioquímico, tal como a descrita acima, geralmente não requerem a marcação fluorescente trabalhoso de ARNm, como é o caso nos estudos in vivo de imagens. Finalmente, muitas armadilhas e artefatos já são diagnosticadas por estes protocolos tradicionais, pois os controles necessários estão bem estabelecidos.
O protocolo apresentado envolve uma etapa de recuperação (passo 1.14) que segue o tratamento Zymolyase. Esta etapa é fundamental, pois o estresse induzido durante o tratamento Zymolyase leva à prisão de translação quase imediata e dissociação 'ribossomos a partir de mRNAs. O gatilho real dos ribossomas dissociação pode qualquer um dos passos que incluídos neste tratamento, ou seja, a remoção da fonte de carbono, exposure a alta g, durante a centrifugação, o tratamento com os agentes (DTT), que reduz, a remoção da parede celular por Zymolyase ou introdução de elevadas condições osmóticos, cada um destes é conhecido por induzir uma detenção da tradução. Esta detenção translacional provavelmente afeta a associação dos ribossomos com mitocôndrias. Assim, verificou-se que a associação com mitocôndrias mRNA é baixo após o tratamento Zymolyase, e aumenta durante a recuperação (não mostrado).
A fracção mitocondrial que é isolado por este protocolo contém uma quantidade significativa de ER, tal como evidente a partir da presença de vários marcadores de ER (por exemplo, Figura 1). Um desejo é óbvio para remover mais componentes ER e obter mitocôndrias puro, usando um dos vários protocolos convencionais que utilizam gradientes de 29-33. No entanto, estes protocolos exigem a remoção de ribossomos das mitocôndrias, seja devido ao tratamento Zymolyase estressante (Figura 1B (isto é, quando os ribossomas reassociar com a mitocôndrias), ambos os marcadores de ER e mitocôndrias sedimentado para a mesma fracção. Isto é provavelmente porque os ribossomas associados obscurecer as diferenças nas suas densidades (dados não mostrados). Assim, para os estudos de associação do ribossoma, métodos alternativos para isolamento mitocôndrias terá de ser desenvolvido.
Para muitos estudos, no entanto, a presença de componentes de ER não é necessariamente um problema. Associação de mRNAs que codificam as proteínas mitocondriais bem estabelecidos (por exAconitase, ATP2, oxa1) é susceptível de ser com a mitocôndria e não o componente de ER nesta preparação em bruto. Portanto, é recomendável usar um desses mRNAs mitocondriais típicos como leituras de impacto na mitocôndria. As proteínas que não foram verificados quanto mitocondrial não deve ser usado como repórteres, o que é importante, em especial, quando os estudos de mRNA do genoma são realizados (por exemplo, análise de microarray), como mis-atribuídos mRNAs pode introduzir um erro.
O grande desafio técnico deste protocolo é minimizar a degradação do mRNA. Enquanto o uso de reagentes livre de RNAse é sempre aconselhável, deve-se lembrar que após a lise das células enormes quantidades de RNAses são liberadas para a solução. A heparina é um inibidor muito eficaz de RNAse e é adicionado em quantidades significativas. Quando grandes volumes de extrato são preparados, seu custo relativamente baixo proporciona vantagem adicional em relação a outros inibidores de RNAse. A heparina no entanto, também inibe a transcrição reversaase, e, portanto, deve ser removido para estudos que envolvem tal atividade enzimática (por exemplo, RT-PCR ou rotulagem de microarranjos de DNA). Apresentamos aqui um processo de remoção, que é baseado na precipitação de LiCl (passos 3,4-3,10). Esta precipitação remove eficazmente a heparina, mas valores aparentemente também significativos de ARNm são perdidos. Como alternativa, existem várias colunas de rotação que são supostamente para remover heparina a partir de amostras de RNA, mas nós tivemos um sucesso limitado com estes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Agradecemos drs. Erez Eliyahu, Daniel Melamed, Ophry Pines e Doron Rapaport ajuda e comentários durante o estabelecimento deste protocolo. Este trabalho é financiado pelo ISF (número de concessão 1193-1109).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yeast Extract | |||
| BactoPeptone | |||
| Galactose | Do not autoclave Galactose | ||
| Growth medium | For mitochondrial enrichment, you should use any nonfermentable carbon source, such as Galactose-based growth medium sterilized 1% Yeast Extract, 2% BactoPeptone, 2% Galactose | ||
| 0.1 M Tris-HCl, pH 9.4 | |||
| 30 mM Tris-HCl, pH 7.6 | |||
| Dithiothreitol (DTT) | |||
| 10 mM DTT Buffer | 0.1 M TrisHCl pH 9.4, 10 mM Dithiothreitol (DTT). Make fresh every time | ||
| 1.2 M Sorbitol | |||
| 4 mM KH2PO4 | |||
| 16 mM K2HPO4 | |||
| 0.2 μm filter | |||
| Zymolyase Buffer | 1.2 M Sorbitol, 4 mM KH2PO4 , 16 mM K2HPO4. Filter this buffer (0.2 μm) and keep at room temperature for future use | ||
| Zymolyase 20T | 20,000 U/g | ||
| Recovery medium | Galactose-based growth medium supplemented with 1 M Sorbitol | ||
| 0.1 mg/ml Cycloheximide (CHX) | |||
| 0.6 M Mannitol | |||
| 5 mM MgAc | |||
| 100 mM KCl | |||
| 0.5 mg/ml Heparin | |||
| 1 mM Phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) | |||
| Mannitol Buffer | 0.6 M Mannitol, 30 mM Tris-HCl pH7.6, 5 mM MgAc, 100 mM KCl. Add freshly: 0.5 mg/ml Heparin, 0.1 mg/ml CHX and 1mM (PMSF). Filter this buffer and use it ice-cold | ||
| 8 M Guanidinium-HCl | |||
| 100% and 70% Ethanol (EtOH) | |||
| 3 M Sodium Acetate, pH 5.2 | |||
| 10 M LiCl stock solution | |||
| 250 mM Tris HCl pH 6.8 | |||
| SDS | |||
| Glycerol | |||
| β-Mercaptoethanol | |||
| Bromophenol blue | |||
| 4x LSB | 250 mM Tris HCl pH 6.8, 8% SDS, 40% Glycerol, 20% β-mercaptoethanol, and 0.02% Bromophenol blue | ||
| Dounce homogenizer of 15 ml capacity equipped with tight fitting pestle |
References
- Holt, C. E., Bullock, S. L. Subcellular mRNA localization in animal cells and why it matters. Science. 326, 1212-1216 (2009).
- Donnelly, C. J., Fainzilber, M., Twiss, J. L. Subcellular communication through RNA transport and localized protein synthesis. Traffic. 11, 1498-1505 (2010).
- Kellems, R. E., Allison, V. F., Butow, R. A. Cytoplasmic type 80 S ribosomes associated with yeast mitochondria. II. Evidence for the association of cytoplasmic ribosomes with the outer mitochondrial membrane in situ. J. Biol. Chem. 249, 3297-3303 (1974).
- Kellems, R. E., Butow, R. A. Cytoplasmic type 80 S ribosomes associated with yeast mitochondria. 3. Changes in the amount of bound ribosomes in response to changes in metabolic state. J. Biol. Chem. 249, 3304-3310 (1974).
- Suissa, M., Schatz, G. Import of proteins into mitochondria. Translatable mRNAs for imported mitochondrial proteins are present in free as well as mitochondria-bound cytoplasmic polysomes. J. Biol. Chem. 257, 13048-13055 (1982).
- Fujiki, M., Verner, K. Coupling of cytosolic protein synthesis and mitochondrial protein import in yeast. Evidence for cotranslational import in vivo. J. Biol. Chem. 268, 1914-1920 (1993).
- Yogev, O., Karniely, S., Pines, O. Translation-coupled translocation of yeast fumarase into mitochondria in vivo. J. Biol. Chem. 282, 29222-29229 (2007).
- Eliyahu, E., et al. Tom20 mediates localization of mRNAs to mitochondria in a translation-dependent manner. Mol. Cell. Biol. 30, 284-294 (2010).
- Garcia, M., et al. Mitochondria-associated yeast mRNAs and the biogenesis of molecular complexes. Mol. Cell. Biol. 18, 362-368 (2007).
- Marc, P., et al. Genome-wide analysis of mRNAs targeted to yeast mitochondria. EMBO Rep. 3, 159-164 (2002).
- Gadir, N., Haim-Vilmovsky, L., Kraut-Cohen, J., Gerst, J. E. Localization of mRNAs coding for mitochondrial proteins in the yeast Saccharomyces cerevisiae. RNA. 17, 1551-1565 (2011).
- Margeot, A., et al. In Saccharomyces cerevisiae, ATP2 mRNA sorting to the vicinity of mitochondria is essential for respiratory function. J EMBO. 21, 6893-6904 (2002).
- Saint-Georges, Y., et al. Yeast mitochondrial biogenesis: a role for the PUF RNA-binding protein Puf3p in mRNA localization. PloS one. 3, (2008).
- Quenault, T., Lithgow, T., Traven, A. PUF proteins: repression, activation and mRNA localization. Trends Cell Biol. 21, 104-112 (2011).
- Garcia, M., Delaveau, T., Goussard, S., Jacq, C. Mitochondrial presequence and open reading frame mediate asymmetric localization of messenger RNA. EMBO Rep. 11, 285-291 (2010).
- Eliyahu, E., Lesnik, C., Arava, Y. The protein chaperone Ssa1 affects mRNA localization to the mitochondria. FEBS Lett. 586, 64-69 (2012).
- Ahmed, A. U., Fisher, P. R. Import of nuclear-encoded mitochondrial proteins: a cotranslational perspective. Int. Rev. Cell Biol. 273, 49-68 (2009).
- Eliyahu, E., Melamed, D., Arava, Y. Genome-wide analysis of RNA extracted from isolated mitochondria. Methods Mol. Biol. 714, 287-299 (2011).
- Eldad, N., Yosefzon, Y., Arava, Y. Identification and characterization of extensive intra-molecular associations between 3'-UTRs and their ORFs. Nucleic Acids RES. 36, 6728-6738 (2008).
- Melamed, D., Arava, Y. Genome-wide analysis of mRNA polysomal profiles with spotted DNA microarrays. Methods Enzymol. 431, 177-201 (2007).
- Margeot, A., et al. Why are many mRNAs translated to the vicinity of mitochondria: a role in protein complex assembly. Gene. 354, 64-71 (2005).
- Mathieu, L., Marsy, S., Saint-Georges, Y., Jacq, C., Dujardin, G. A transcriptome screen in yeast identifies a novel assembly factor for the mitochondrial complex III. Mitochondrion. 11, 391-396 (2011).
- Hocine, S., Raymond, P., Zenklusen, D., Chao, J. A., Singer, R. H. Single-molecule analysis of gene expression using two-color RNA labeling in live yeast. Nat. Methods. 10, 119-121 (2013).
- Park, H. Y., Buxbaum, A. R., Singer, R. H. Single mRNA tracking in live cells. Methods Enzymol. 472, 387-406 (2010).
- Thompson, M. A., Casolari, J. M., Badieirostami, M., Brown, P. O., Moerner, W. E. Three-dimensional tracking of single mRNA particles in Saccharomyces cerevisiae using a double-helix point spread function. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 17864-17871 (2010).
- Tyagi, S. Imaging intracellular RNA distribution and dynamics in living cells. Nat. Methods. 6, 331-338 (2009).
- Garcia, M., Darzacq, X., Devaux, F., Singer, R. H., Jacq, C. Yeast mitochondrial transcriptomics. Methods Mol. Biol. 372, 505-528 (2007).
- Reinders, J., Sickmann, A. Proteomics of yeast mitochondria. Methods Mol. Biol. 372, 543-557 (2007).
- Meisinger, C., Sommer, T., Pfanner, N. Purification of Saccharomcyes cerevisiae mitochondria devoid of microsomal and cytosolic contaminations. Anal. Biochem. 287, 339-342 (2000).
- Glick, B. S., Pon, L. A. Isolation of highly purified mitochondria from Saccharomyces cerevisiae. Methods Enzymol. 260, 213-223 (1995).
- Boldogh, I. R., Pon, L. A. Purification and subfractionation of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. Methods Cell Biol. 80, 45-64 (2007).
- Rieder, S. E., Emr, S. D., et al. Isolation of subcellular fractions from the yeast Saccharomyces cerevisiae. Current protocols in cell biology / editorial board. Bonifacino, J. S. 8, (2001).
- Diekert, K., de Kroon, A. I., Kispal, G., Lill, R. Isolation and subfractionation of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. Methods Cell Biol. 65, 37-51 (2001).
