Summary
Mitokondriyal proteinleri kodlayan birçok mRNA'lar mitokondri dış membran ile ilişkilidir. Biz ilişkili mRNA'lardan ve ribozomlarla maya mitokondri izolasyonu amaçlayan bir hücre altı bölme prosedürü tarif. Bu protokol, mRNA lokalizasyonu mekanizmaları ve mitokondri yakın olarak lokalize çeviri ortaya çıkarmak için çeşitli koşullar altında yetiştirilen hücreler uygulanabilir.
Abstract
Mitokondriyal proteinlerin çoğu çekirdeğine kodlanmış ve organel içine ithal edilecek ihtiyacı vardır. Protein, mitokondri yakın sentezlenir Alma oluşabilir. Bu olasılığı için destek mitokondriyal proteinleri kodlayan birçok mRNA'lar mitokondri civarı lokalize edilmesi gösterilmiştir edildiği son çalışmalar, türetilmiştir. Birlikte dış zar ile ribozomların 'derneği önceki gösterileri ile, bu sonuçlar yerelleştirilmiş bir çeviri sürecini öneririz. Bu tür lokalize çeviri, ithalat verimliliğini artırmak benzersiz düzenleme siteleri sağlamak ve ektopik ifade vakalarını minimize edebilir. Çeşitli yöntemler lokalize çeviri aracılık faktörler ve unsurları karakterize etmek için kullanılmıştır. Bunlar arasında standart diferansiyel santrifüjle hücre içi fraksiyonlarının. Bu protokol, tek bir prosedür olarak mRNA, ribozomlar ve proteinlerinin izolasyonu gibi bir avantajı vardır. Bunlar daha sonra çeşitli moleküler ve bi karakterize edilebilirochemical yöntemleri. Ayrıca, transkriptomik ve proteomik yöntemleri böylece genom çapında derin bir bakış açısı sağlar, elde edilen malzemeye uygulanabilir. Bu çalışmalar için bir model organizma olarak maya kullanımı hızı, maliyetler ve basitlik avantajları vardır. Ayrıca, gelişmiş bir genetik araçları ve mevcut silme suşları aday faktörlerin incelenmesini kolaylaştırmak.
Introduction
Ökaryotik hücreler, belirli işlevleri olan farklı bölümlerinde düzenlenmektedir. Bu fonksiyonu yerine getirmek için, her bir bölme bu etkinlik için temel olan protein benzersiz bir dizi içerir. Bu proteinler bölmesini hangi yaklaşımı sayesinde mümkün olan bir mekanizma lokalize çeviri 1,2 gereğidir. Bu işlemde, protein ribozomlar ve orada bulunan mRNA tarafından hedefe sentezlenir. Lokalize çeviri muhtemel avantajları protein hedeflemesi verimliliği artmış arasında protein chaperones ihtiyacının azalması ve site-spesifik düzenleme mekanizmalarını sağlayarak. Ayrıca, lokalize mRNAlarının ve ribozomlar genel çeviri inhibe hücresel stres, durumlarında çeviri makine tenha bir rezervuar olabilir.
Mitokondri son yıllarda lokalize çeviri incelemek için merkezi bir model oldu. En mitokondri proteinleri, sitosol tercüme çekirdeğinde, kodlanmıştırve organel içine ithal. Kanıtlar çeşitli çizgiler, bu proteinler çoğu yerel için bir süreç yoluyla üretilmiş olduğunu göstermektedir. Başlangıçta, elektron mikroskobu ve biyokimyasal bölme çalışmaları mitokondri 3-5 ile ilişkili ribozomlan algılandı. Sonra sadece bir cotranslational şekilde 6,7 ithal edilecek bulundu belirli mRNA'lardan çalışmalardan in vivo doğrulanmıştır Bu çalışmalar. Mitokondri ile ilişkili mRNA genom çalışmalar mRNA önemli bir kısmı mitokondri civarı 8-10 lokalize olduğunu ortaya çıkardı. Bu mRNA bazıları ayrıca, balık veya MTAG 9,11 olarak in vivo floresan yöntemler ile karakterize edilmiştir. Bu derneğin bir düz ileri yorumlama bu mRNAlarının lokalize çeviri için şablon olarak hizmet olmasıdır.
Bu mRNAları mitokondri yaklaşım hangi mekanizmalar bilinmemektedir. Noncoding etki (en significantly 3 'UTRs) mitokondri 12 mRNA birlikte dahil olmak gösterilmiştir. Bu etki kendi taşıma aracılık eden RNA bağlayıcı proteinlere bir bağlama alanı olarak hizmet etmek olasıdır. Mayada çalışmalar proteinlerin PUM ailesinin (Puf3) üyesi mitokondri 8,13 ile mRNA ilişki desteklediğini göstermiştir. Diğer aile üyelerinin fonksiyonları dayanmaktadır Puf3 için mantıklı bir rolü, mRNA rota 14 tr ise çeviri inhibe etmektir. Bu durumda, mRNA kodlayıcı olmayan bölgeler ile etkileşime RNA bağlayıcı protein tarafından, bir çevrilmemiş durumu nakledilebilir. Seçenek olarak ise, işin büyük bir gövde, protein sentez edilirken taşıma cereyan ettiğini ortaya çıkarmaktadır. Özellikle de, çeviri inhibitörleri mRNA'lar ilişki 8,13 etkilediği gösterilmiştir. Ayrıca, bu tür Ağustos olarak tercüme özellikleri, mitokondriyal hedefleme sekansı (MTS) ya da ORF bölgeler lokalizasyon 8,11,15 yardımcı gösterilmiştir. Hsp70-family protein chmitokondri dış zar üzerinde aperone ve protein reseptör daha da kodlanmış protein özellikleri mRNA lokalizasyonu 16 için önemli olduğunu ima, mRNA ilişki destek gösterilmiştir. Bu, ribozom ortaya çıkan protein mitokondri 17 mRNA ribozom-protein kompleksi hedefleme için tanıma elemanı olarak hizmet ettiği bir modelle tutarlıdır.
Mitokondri yakın olarak lokalize için elektron mikroskopisi (ribozomlar görselleştirmek için) 3, FISH 9, (spesifik mRNA tespit etmek için), yeşil RNA 11 ve biyokimyasal fraksiyonasyon (RNA ve hem ribozomlar tespit etmek için) 10,18 dahil olmak üzere çeşitli yöntemler ile araştırılmıştır. Eski yöntemler, canlı ortam içinde lokalizasyonu tespit etmek ve taşıma dinamikleri görselleştirme izin verirken, ikinci tek bir deneyde bir çok farklı mRNA tespiti sağlar. Ayrıca, biyokimyasal ayırma kodlayıcı veya kodlayıcı olmayan bir etki için al olması gerekmezolarak girilir, bu nedenle belirli bir rolleri değerlendirilebilir. Biyokimyasal ayırma başarılı bir şekilde bir çok farklı hücre bölmelerinin izole edilmesi için, uzun yıllardır kullanılmaktadır. Onun ilke ve sınırlamaları iyi kurulmuş, ve kolayca farklı bir amaç için mevcut protokolleri değiştirebilirsiniz. Gerekli enstrümantasyon, bu nedenle genellikle hücre içi lokalizasyonu eğitim için tercih edilen ilk yöntemdir, birçok laboratuvar standarttır. Biz, ribozomlar mitokondri ile ilişkili ise mRNA izolasyonu için optimize edilmiş bir protokol açıklar. Bu protokol, bu nedenle mitokondri yakın lokalize çeviri katılan faktörleri incelemek için en uygunudur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Mitokondri Arıtma
Hücre pelet tartılır. Yaklaşık 0.6 g 100 mi hücrelerden elde edilir.
- 30 ° C'de 600 = 1-1,5 OD maya hücrelerinin 100-150 ml büyümek Mitokondri için zenginleştirmek için, bu tür galaktoz bazlı bir büyüme ortamı olarak bir nonfermentable büyüme ortamı, üzerinde C °.
- Santrifüj hücreleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 3000 x g ve supernatant atın.
- Yine iki kere damıtılmış su ve santrifüj ile pelet yıkayın. Süpernatant atın.
- Hücrelerin 0.5 gramı başına 1 ml DTT tampon içinde pelletini. Böylece, hidroliz geliştirilmesi, hücre duvarı içinde disülfid bağları kırmak amacıyla bir indirgeme maddesi ile hücreleri tedavi etmek için önemlidir.
- 30 ° C'de 10 dakika boyunca inkübe hücreleri Nazik sallayarak C °. Öte yandan, hücreler 1 gramı başına 6 mg ağırlığında ve askiyle sonuçlanır ki askiyle sonuçlanır ki Tamponu içinde askıya.
- 5 dk a boyunca 3.000 xg'de Santrifüj hücrelerit oda sıcaklığı ve süpernatant atın.
- Hücrelerin 0.15 g başına 1 mi askiyle sonuçlanır ki Tampon pelet tekrar. Vorteks.
- 990 ul su içindeki hücrelerin 10 ul alikotunun OD 600 ölçün.
- Β-1 ,3-glukan bağları glikoz polimerler, hidrolize ve sferoplastlar oluşturmak için, hücrelere askiyle sonuçlanır ki (adım 1.5) ilave edin. Bu aşama, sferoplastlar lizis önlemek amacıyla bir izotonik çözelti içinde tutulmalıdır.
- Hafif sallama ile 30 ° C (askiyle sonuçlanır ki optimal aktivitesi için) 15 dakika boyunca inkübe hücreleri. Hücre duvarı ve sferoplastlar nesil hidroliz doğrulamak için, 990 ul su ile hücrelerin 10 ul karıştırın. Spheroplastlar nedeniyle osmotik farkı lize beklenmektedir ve OD 600 aşamasında, en azından 1.9 belirlenen değerden daha düşük 10 misli olmalıdır. Aksi takdirde, başka bir 15 dakika boyunca inkübasyon askiyle sonuçlanır ki bu devam eder.
- Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 3000 x g'de santrifüjleyin hücreleri. Dikkatle diskart süpernatan, pelet olarak kararsız olabilir.
- Askiyle sonuçlanır ki Tampon ile spheroplastlar yıkayın ve süpernatant atın.
- 100 ml Kurtarma ortamı ile spheroplastlar süspanse edin. Bir Erlenmeyer şişeye spheroplastlar aktarın ve 30 ° C'de 1 saat boyunca inkübe Çalkalanarak C °. Askiyle sonuçlanır ki tedavi çeviri sırasında tutuklandı ve mRNA lokalizasyon (Şekil 1B) bozulur çünkü bu kurtarma adım gereklidir.
- Bir soğutulmuş 50 ml konik tüp, 0.1 mg / ml cHx ve transfer spheroplastlar ekleyin. CHX ilave mRNA'larla ribozomlarla 'dernek dondurmak için önemlidir. Böylece, mitokondri ile ribozomlar-bağımlı mRNA ilişki korunur.
- Santrifüj sferoplastlar 'ı içerir, 4 ° C'de 5 dakika boyunca 3000 x g ve supernatant atın.
- Soğuk Mannitol Tampon ile iki kez yıkayın.
- 4 ml soğuk tampon ile Mannitol spheroplastlar yeniden süspanse edin ve sıkı geçme ile donatılmış 15 ml kapasiteli bir Dounce homojenizatör aktarınpestle. Yavaşça 15 darbelerle spheroplastlar kırmak ve bir 13 ml tüp lizat aktarın.
- Çekirdek ve kesintisiz hücrelerini pellet haline getirmek üzere, 4 ° C'de 6 dakika boyunca 1500 x g'de lizat santrifüj.
- Dikkatle yeni bir tüp süpernatant aktarın. Bölünmemiş bir örnek ("Toplam" örneği) olarak bir yana numunenin 1 ml (% 25) olarak ayarlayın. Yeni bir tüpe aktarın Bu örneğin 50 ml ve western blot analizi için 4X LSB 15 ml ekleyin. "Toplam" numunenin geri kalanından Çökelti RNA (Protokol 3, RNA çökeltme bakınız).
- 4 ° C'de 10 dakika boyunca 10,000 x g'de santrifüje süpernatan Mitokondri pelet için C °.
- Yeni bir tüp süpernatant (~ 3 ml) aktarın ve buz üzerinde tutmak. Bu "Sitosolik" bölümüdür. Yeni bir tüpe aktarın Bu örneğin 50 ml ve western blot analizi için LSB 4x 15 ml ekleyin. "Sitosolik" numunenin geri kalanından Çökelti RNA (Protocol 3, RNA yağış).
- 4 ° C'de 10 dakika boyunca 10,000 x g'de tekrar 3 ml Tampon Mannitol ve santrifüj ile pelet yıkayın
- 3 ml mannitol Tampon ile pelletini. Bu örnek, mitokondri içerir ve "Mitokondri" fraksiyonu olarak adlandırılır. Yeni bir tüpe aktarın Bu örneğin 50 ml ve western blot analizi için LSB 4x 15 ml ekleyin.
2. RNA Ekstraksiyon
- Her bir örnek 8 M guanidinyum-HCl, bir hacim ve% 100 etanolden iki hacmin ekle. Vorteks ve -20 ° C'de en az 2 saat boyunca inkübe ° C.
- 4 ° C'de 20 dakika boyunca 10,000 x g'de santrifüjleyin örnekleri ° C. Süpernatant atın. Pelet kararsız olabilir dikkatli olun.
- % 70 EtOH ile pelet yıkayın.
- RNase-içermeyen su içinde 400 ml pelet yeniden süspanse edin ve yeni bir Eppendorf tüpüne örnek aktarın.
- 3 M sodyum Etilasetat 0.1 hacim ilave edilerek RNA Çökeltie pH 5.2 ve% 100 EtOH iki hacimleri. Vorteks ve -20 ° C'de en az 2 saat boyunca inkübe ° C.
- 4 ° C'de 20 dakika boyunca 20,000 x g'de santrifüjleyin örnekleri Süpernatantı atın ve% 70 EtOH ile yıkayın.
- Hava pelet kuru ve RNase-barındırmayan su ile yeniden süspanse edin. -80 ° C'de saklayın RNA numuneleri ° C. Örnekler Northern analizinde 19 ya da mikro-dizi analizi 18 (Protokol 3 bak) için kullanılabilir.
3. Mikrodizi Analizi RNA hazırlanması
- RNase-içermeyen su içinde 650 ml aşama 2.2 'den mRNA yeniden süspanse edin.
- Kuvvetli bir şekilde kloroform (5:1, pH 4.7) ve vorteks: herhangi bir kalıntı DNA ya da proteinleri çıkarmak için, eşit asidik fenol hacmi (650 mi) ilave edin. 2 dakika boyunca maksimum hızda santrifüj.
- Yeni bir tüpe, üst faz (sulu faz) 500 ml aktarın. DNA'yı içerdiği gibi, interfazda almaktan kaçının. Ayrıca, ters transkripsiyon reaksiyonu inhibe fenol, alma dikkat edin. </ Li>
- RNA örnek ters transkriptazın bir inhibitörü olan heparin önemli bir miktarda içerir. Böylece, RT-PCR veya mikroarray etiketleme için kaldırılması gerekmektedir. LiCI çökeltme yoluyla heparin çıkarmak: 2 M bir son konsantrasyona kadar LiCI ekleyin ve -20 ° C'de gece boyunca inkübe örnekleri ° C.
- 4 ° C'de örnekleri Çözülme ° C ve 4 ° C'de 20 dakika boyunca 20,000 xg'de santrifüj
- Dikkatlice süpernatant atın ve% 80 etanol ile pelet yıkayın. Aşama 3.5 de tarif edildiği gibi tekrar santrifüj.
- Süpernatantı, kuru hava atın ve RNase-içermeyen su içinde 150 ml pelet tekrar süspansiyon.
- Herhangi bir artık LiCI kaldırmak için, 3 M sodyum asetat pH 5.3 ve 0.1 hacim% 100 etanol içinde 3 hacim ile tekrar çökeltilmesi. -20 ° C de inkübe En az 2 saat boyunca ° C.
- 4 ° C'de 20 dakika boyunca en yüksek hızda santrifüje ° C. % 80 etanol ve kuru hava ile dikkatlice şeffaf pelet yıkayın.
- Süspanse25 ml RNase içermeyen su ile pelet ve -80 ° C'de örnekleri tutmak ° C.
- 18,20 açıklanan RNA etiketleme ve melezleme için adımları izleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu protokol, sitosolik bileşenlerden bir mitokondri içeren fraksiyonu ayrılmasını sağlar. Başarısını test etmek için en iyi yolu, farklı izolasyon adımlardan örnekler kuzey analizi ve batı analizi (Şekil 1) yapmaktır. Izolasyon kalitesi için üç parametre, bu analizlerden elde edilir. İlk olarak, örneklerde, RNA ya da protein bozulmamış olsun - bu analizlerde ayrı bantlar olarak tespit edilecektir. Parçalanma olaylar ilave, kısa bantlar veya smear görünümünü neden olacaktır. İkinci olarak, giriş (yani toplam) gelen sinyal ile, her aşama sinyalleri karşılaştırma hazırlanması sırasında kaybedilmesi ile ilgili önemli bilgiler sağlar. Ciddi zararlar Toplam ve sinyalin nispi miktarı arasında belirgin bir fark olarak gözlenecektir. Son olarak ve en önemlisi, mitokondriyal ve sitosolik bileşenleri arasındaki ayrılma kalitesi tespit edilebilir. Sağlam mitochondri İzolasyonuBir sadece mitokondri fraksiyonunda olup sitozolik fraksiyondan (Şekil 1A) içinde mitokondriyal transkribe transkripti için bir sinyal ile sonuçlanır. Ayrıca, mitokondri-ilişkili proteinler, sadece mitokondri kısmını western blot ve sitozolik fraksiyondan (Şekil 1 B) sitosolik proteinler ile görüntülenecektir.
Şekil 1, bu protokol için standart olan iki ek sonuçlarını gösterir: Birincisi, mitokondri ile nükleer kodlanmış mRNA'lanmn dernek genler arasında değişir. MRNA, sitozolik fraksiyondan (Şekil 1C) çoğunlukla olan sitosolik aktin proteini (ACT1) kodlayan bir tanesi, bir mitokondriyal protein kodlayan ACO1 mRNA, mitokondri fraksiyonunda daha çok görünür görebilirsiniz. Genom analizleri birçok genin 8,10,21,22 ve bu çeşitliliğin temelinde arasında ortaya varyasyon kapsamlı araştırma altındadır. ER-ilgili maddi ikinci, önemli miktardal mitokondriyal fraksiyonunda coisolated edilir. ER-ilişkili olan mRNA kodlayan Sec61, kuzey blot (Şekil 1A) tarafından tespit edilir ve ER-zar proteini Cue1 western blot (Şekil 1 B) tarafından tespit edilir. Bu ER ve mitokondri arasındaki bilinen fiziksel temasların bir sonucu olabilir. Mitokondri ayrıca saflaştırılması mümkün olmakla birlikte, bazı sınırlamalar getirmektedir olabilir, bu Tartışma tartışılmıştır.
Şekil 1. . Izolasyon Kalite Kalitesi doğrulama prosedürü üç temsil adımda alınan örnekler için test edilmiştir: fraksiyonlama önce (Toplam [adım 1.20], T; sitosolik fraksiyonu [adım 1.22], ° C; ve mitokondriyal fraksiyon [adım 1.24], M). Numuneler, kuzey analizi (tabi tutulur. Aşağıdaki mRNA için A, C) ya da batı analizi (B) A) Northern analizi: COB dolayısıyla sinyal mitokondride özel olmalıdır mitokondri içinde transkribe bir RNA'dır. C fraksiyonu Onun görünüşü hazırlanması sırasında mitokondri lisisinin gösterecektir. ACT1 sitosolik bir protein kodlayan bir mRNA olduğunu ve bu nedenle sitosolik ribozomlar tarafından çevrilmiştir ve C kısmını daha çok görünür. ACO1 mitokondri ithal edilen bir proteini şifreleyen bir mRNA ve mitokondri kısmını daha çok görünür. Sec61 ER yerleşik proteinini kodlayan mRNA olduğunu, M fraksiyonu varlığı bu fraksiyonunda ER bileşenlerin varlığını gösterir. Alt panel, kuzey zarın bir metilen mavi boya sunulur iki rRNA (18S ve 25S) tespit edilir budur. Bu panel ribozomların önemli miktarda followi için M fraksiyonu. B) Batı analizi görünür olduğunu gösteriyorproteinler ng: Por1 bu nedenle sinyali sadece M fraksiyonda beklenen bir mitokondri dış zar proteinidir. C fraksiyonunda sinyal hazırlama sırasında mitokondriyal bileşenlerin ayrılmasını önerir. Hxk1 bir sitosolik protein olan ve ER Cue1 bir proteindir. Her ikisi de mitokondri fraksiyonu ile, bu fraksiyonların birlikte saflaşması rapor. Rpl39 yine her iki fraksiyonda da ribozomların varlığını gösteren, bir ribozomal proteindir. Panelin "kurtarma olmadan Rpl39", protokol kurtarma aşama (1,14 adım) CCP1 için. C) Northern analizi, mitokondri ithal edilen bir proteini kodlayan bir mRNA'nın hariçtir ribozomların fraksiyonasyon sunar. Bütün jel kısa, bozulması kaynaklı bantların eksikliği göstermek için sunulmuştur. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Görüntülemede Teknolojik gelişmeler mRNA yerelleştirme incelemek için yüksek çözünürlüklü araçları vermiştir. Bugün, bir msn zaman ölçeği 23-26 hatta tek bir mRNA molekülünün hareketini ölçebilirsiniz. Bununla birlikte, geleneksel biyokimyasal yaklaşımlar, yukarıda tarif edilen gibi, aynı zamanda bilgi ve bazı durumlarda tercih edilir. Biyokimyasal izolasyon mRNA ve proteinlerin büyük bir repertuar saflaştırılmasını sağlar ve genom çalışmaları için bu nedenle tercih edilir. Tek bir izolasyon, bir DNA ya da RNA-mikrodizilerinin seq 18,27 yoluyla, binlerce gen karakterizasyonu imkan vermek için yeterli mRNA seviyeleri elde edilebilir. Buna paralel olarak, bir protein izole ve mitokondri 28 proteomesini karakterize bir proteomik analizi yapabilirsiniz. Biyokimyasal paylarına ayırma ER 29, özellikle de diğer hücre organelleri mitokondri ayırmak için adapte edilebilir. Bu hücrelerin bazı türlerinde avantajlı olabilir yüksek uzamsal örtüşme idiER ve mitokondri arasındaki mikroskobik yerelleştirme analizleri engeller. Biyokimyasal fraksiyonlar önemli bir avantajı, birçok farklı numunelerin analizini sağlar: düşük maliyeti vardır. In vivo görüntüleme çalışmalarında olduğu gibi, biyokimyasal ayırma, yukarıda tarif edilen gibi, genellikle mRNA zahmetli floresan etiketleme gerektirmeyen - İlgili bir avantajı basitliğidir. Son olarak, birçok tuzaklar ve eserler zaten bu nedenle gerekli kontroller köklü, bu geleneksel protokoller için teşhis edilir.
Sunulan protokol askiyle sonuçlanır ki tedaviyi izleyen bir kurtarma adım (adım 1.14) gerektirir. Askiyle sonuçlanır ki tedavi sırasında meydana gelen stres hemen hemen öteleme tutuklanması ve mRNA'lardan ribozomlara 'ayrışmasına yol açar, çünkü bu adım önemlidir. Ribozomlar ayrılması için gerçek tetikleyebilir bu tedavi, karbon kaynağı, yani uzaklaştırılması Expos dahil herhangi bir aşamasıSantrifüj maddeler (DTT) indirgeyici ile muamele sırasında yüksek g ure askiyle sonuçlanır ki veya yüksek ozmotik koşulların dahil edilmesi ile hücre duvarı çıkarılması;, bunların her biri, bir dönüşümsel durdurulmasını sağlamak için bilinmektedir. Bu öteleme tutuklama muhtemelen mitokondri ile ribozomların ilişkiyi etkiler. Buna göre, mitokondri ile mRNA birleşme askiyle sonuçlanır ki tedavi sonrası düşüktür, ve iyileşme sırasında artar (gösterilmemiş olan) olduğu bulunmuştur.
Bu protokol ile izole edilir mitokondriyal fraksiyon ER çeşitli belirteçlerin varlığı belirgin olarak ER önemli bir miktarda (örneğin, Şekil 1) içerir. Bariz bir arzusu daha ER bileşenleri kaldırmak ve saf mitokondri elde etmek için, eğimleri 29-33 kullanmak birçok standart protokollerden birini kullanıyor. Ancak, bu protokoller nedeniyle stresli askiyle sonuçlanır ki tedavi (Şekil 1B ya mitokondri Ribozomların sıyırma gerektiren (örneğin ribozom mitokondri reassociate zaman) için kurtarma sonra gradyan ayırma tatbik edildiği zaman, örneğin, her iki ER ve mitokondri işaretleri aynı fraksiyonuna çöktürülmüştür. Ilişkili ribozom yoğunluklarına (veriler gösterilmemiştir) arasındaki farkları karanlık nedeni muhtemelen. Böylece, ribozom dernek çalışmaları için, mitokondri izolasyonu için alternatif metotlar geliştirildi gerekir.
Birçok çalışma için ise, ER bileşenlerin varlığı zorunlu olarak sorun teşkil etmez. Iyi kurulmuş bir mitokondriyal protein (örneğin, kodlayan mRNA'ların AssociationAkonitaz, ATP2, Oxa1) bu ham hazırlanmasında mitokondri olup ER bileşeni ile olması muhtemeldir. Bu nedenle mitokondri üzerine etkisi çıktılan olarak bu tipik mitokondriyal mRNA'lanmn birini kullanmanız tavsiye edilir. Mitokondriyal olarak doğrulanmadı edildi proteinler muhabir olarak kullanılmamalıdır; mis tayin edilen mRNA, bir hata katabilmektedir gibi genom mRNA araştırmalar (örneğin, mikro-dizi analizi) gerçekleştirilir, bu özellikle önemlidir.
Bu protokolün önemli teknik zorluk mRNA yıkımını minimize edilir. RNAse içermeyen reaktifler kullanılarak her zaman tavsiye edilir olsa da, tek bir RNaz'larına büyük miktarda çözelti içine ilk ortaya hücrelerin parçalanması üzerine unutulmamalıdır. Heparin çok etkili bir RNAse inhibitörüdür ve belirgin miktarlarda ilave edilir. Geniş bir özü miktarlar hazırlandığı zaman, nispeten düşük maliyetli başka RNAse önleyicileri ile karşılaştırıldığında ilave bir avantaj sağlar. Heparin ise, aynı zamanda ters transkriptaz inhibease ve bu nedenle bu tür enzim etkinliğinin kapsayan çalışmalar için kaldırılması (örneğin RT-PCR ya da DNA mikro-dizi etiketi). Bu yazıda (3,4-3,10 adımlar) LiCİ yağış dayalı bir çıkarma prosedürünü sunuyoruz. Bu yağış etkili heparin kaldırır, ama mRNA'lanmn görünüşte de önemli miktarda kaybolur. Alternatif olarak, RNA örneklerinden heparin kaldırmak gerekiyordu, ama biz bunlarla sınırlı başarı çeşitli spin-sütun vardır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar herhangi bir mali çıkarlarını beyan.
Acknowledgments
Biz Dr teşekkür ederim. Erez Eliyahu, Daniel Melamed, Ophry Pines ve bu protokolün kurulması sırasında yardım ve yorumlar için Doron Rapaport. Bu çalışma ISF (hibe sayısı 1193-1109) tarafından finanse edilmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yeast Extract | |||
| BactoPeptone | |||
| Galactose | Do not autoclave Galactose | ||
| Growth medium | For mitochondrial enrichment, you should use any nonfermentable carbon source, such as Galactose-based growth medium sterilized 1% Yeast Extract, 2% BactoPeptone, 2% Galactose | ||
| 0.1 M Tris-HCl, pH 9.4 | |||
| 30 mM Tris-HCl, pH 7.6 | |||
| Dithiothreitol (DTT) | |||
| 10 mM DTT Buffer | 0.1 M TrisHCl pH 9.4, 10 mM Dithiothreitol (DTT). Make fresh every time | ||
| 1.2 M Sorbitol | |||
| 4 mM KH2PO4 | |||
| 16 mM K2HPO4 | |||
| 0.2 μm filter | |||
| Zymolyase Buffer | 1.2 M Sorbitol, 4 mM KH2PO4 , 16 mM K2HPO4. Filter this buffer (0.2 μm) and keep at room temperature for future use | ||
| Zymolyase 20T | 20,000 U/g | ||
| Recovery medium | Galactose-based growth medium supplemented with 1 M Sorbitol | ||
| 0.1 mg/ml Cycloheximide (CHX) | |||
| 0.6 M Mannitol | |||
| 5 mM MgAc | |||
| 100 mM KCl | |||
| 0.5 mg/ml Heparin | |||
| 1 mM Phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) | |||
| Mannitol Buffer | 0.6 M Mannitol, 30 mM Tris-HCl pH7.6, 5 mM MgAc, 100 mM KCl. Add freshly: 0.5 mg/ml Heparin, 0.1 mg/ml CHX and 1mM (PMSF). Filter this buffer and use it ice-cold | ||
| 8 M Guanidinium-HCl | |||
| 100% and 70% Ethanol (EtOH) | |||
| 3 M Sodium Acetate, pH 5.2 | |||
| 10 M LiCl stock solution | |||
| 250 mM Tris HCl pH 6.8 | |||
| SDS | |||
| Glycerol | |||
| β-Mercaptoethanol | |||
| Bromophenol blue | |||
| 4x LSB | 250 mM Tris HCl pH 6.8, 8% SDS, 40% Glycerol, 20% β-mercaptoethanol, and 0.02% Bromophenol blue | ||
| Dounce homogenizer of 15 ml capacity equipped with tight fitting pestle |
References
- Holt, C. E., Bullock, S. L. Subcellular mRNA localization in animal cells and why it matters. Science. 326, 1212-1216 (2009).
- Donnelly, C. J., Fainzilber, M., Twiss, J. L. Subcellular communication through RNA transport and localized protein synthesis. Traffic. 11, 1498-1505 (2010).
- Kellems, R. E., Allison, V. F., Butow, R. A. Cytoplasmic type 80 S ribosomes associated with yeast mitochondria. II. Evidence for the association of cytoplasmic ribosomes with the outer mitochondrial membrane in situ. J. Biol. Chem. 249, 3297-3303 (1974).
- Kellems, R. E., Butow, R. A. Cytoplasmic type 80 S ribosomes associated with yeast mitochondria. 3. Changes in the amount of bound ribosomes in response to changes in metabolic state. J. Biol. Chem. 249, 3304-3310 (1974).
- Suissa, M., Schatz, G. Import of proteins into mitochondria. Translatable mRNAs for imported mitochondrial proteins are present in free as well as mitochondria-bound cytoplasmic polysomes. J. Biol. Chem. 257, 13048-13055 (1982).
- Fujiki, M., Verner, K. Coupling of cytosolic protein synthesis and mitochondrial protein import in yeast. Evidence for cotranslational import in vivo. J. Biol. Chem. 268, 1914-1920 (1993).
- Yogev, O., Karniely, S., Pines, O. Translation-coupled translocation of yeast fumarase into mitochondria in vivo. J. Biol. Chem. 282, 29222-29229 (2007).
- Eliyahu, E., et al. Tom20 mediates localization of mRNAs to mitochondria in a translation-dependent manner. Mol. Cell. Biol. 30, 284-294 (2010).
- Garcia, M., et al. Mitochondria-associated yeast mRNAs and the biogenesis of molecular complexes. Mol. Cell. Biol. 18, 362-368 (2007).
- Marc, P., et al. Genome-wide analysis of mRNAs targeted to yeast mitochondria. EMBO Rep. 3, 159-164 (2002).
- Gadir, N., Haim-Vilmovsky, L., Kraut-Cohen, J., Gerst, J. E. Localization of mRNAs coding for mitochondrial proteins in the yeast Saccharomyces cerevisiae. RNA. 17, 1551-1565 (2011).
- Margeot, A., et al. In Saccharomyces cerevisiae, ATP2 mRNA sorting to the vicinity of mitochondria is essential for respiratory function. J EMBO. 21, 6893-6904 (2002).
- Saint-Georges, Y., et al. Yeast mitochondrial biogenesis: a role for the PUF RNA-binding protein Puf3p in mRNA localization. PloS one. 3, (2008).
- Quenault, T., Lithgow, T., Traven, A. PUF proteins: repression, activation and mRNA localization. Trends Cell Biol. 21, 104-112 (2011).
- Garcia, M., Delaveau, T., Goussard, S., Jacq, C. Mitochondrial presequence and open reading frame mediate asymmetric localization of messenger RNA. EMBO Rep. 11, 285-291 (2010).
- Eliyahu, E., Lesnik, C., Arava, Y. The protein chaperone Ssa1 affects mRNA localization to the mitochondria. FEBS Lett. 586, 64-69 (2012).
- Ahmed, A. U., Fisher, P. R. Import of nuclear-encoded mitochondrial proteins: a cotranslational perspective. Int. Rev. Cell Biol. 273, 49-68 (2009).
- Eliyahu, E., Melamed, D., Arava, Y. Genome-wide analysis of RNA extracted from isolated mitochondria. Methods Mol. Biol. 714, 287-299 (2011).
- Eldad, N., Yosefzon, Y., Arava, Y. Identification and characterization of extensive intra-molecular associations between 3'-UTRs and their ORFs. Nucleic Acids RES. 36, 6728-6738 (2008).
- Melamed, D., Arava, Y. Genome-wide analysis of mRNA polysomal profiles with spotted DNA microarrays. Methods Enzymol. 431, 177-201 (2007).
- Margeot, A., et al. Why are many mRNAs translated to the vicinity of mitochondria: a role in protein complex assembly. Gene. 354, 64-71 (2005).
- Mathieu, L., Marsy, S., Saint-Georges, Y., Jacq, C., Dujardin, G. A transcriptome screen in yeast identifies a novel assembly factor for the mitochondrial complex III. Mitochondrion. 11, 391-396 (2011).
- Hocine, S., Raymond, P., Zenklusen, D., Chao, J. A., Singer, R. H. Single-molecule analysis of gene expression using two-color RNA labeling in live yeast. Nat. Methods. 10, 119-121 (2013).
- Park, H. Y., Buxbaum, A. R., Singer, R. H. Single mRNA tracking in live cells. Methods Enzymol. 472, 387-406 (2010).
- Thompson, M. A., Casolari, J. M., Badieirostami, M., Brown, P. O., Moerner, W. E. Three-dimensional tracking of single mRNA particles in Saccharomyces cerevisiae using a double-helix point spread function. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 17864-17871 (2010).
- Tyagi, S. Imaging intracellular RNA distribution and dynamics in living cells. Nat. Methods. 6, 331-338 (2009).
- Garcia, M., Darzacq, X., Devaux, F., Singer, R. H., Jacq, C. Yeast mitochondrial transcriptomics. Methods Mol. Biol. 372, 505-528 (2007).
- Reinders, J., Sickmann, A. Proteomics of yeast mitochondria. Methods Mol. Biol. 372, 543-557 (2007).
- Meisinger, C., Sommer, T., Pfanner, N. Purification of Saccharomcyes cerevisiae mitochondria devoid of microsomal and cytosolic contaminations. Anal. Biochem. 287, 339-342 (2000).
- Glick, B. S., Pon, L. A. Isolation of highly purified mitochondria from Saccharomyces cerevisiae. Methods Enzymol. 260, 213-223 (1995).
- Boldogh, I. R., Pon, L. A. Purification and subfractionation of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. Methods Cell Biol. 80, 45-64 (2007).
- Rieder, S. E., Emr, S. D., et al. Isolation of subcellular fractions from the yeast Saccharomyces cerevisiae. Current protocols in cell biology / editorial board. Bonifacino, J. S. 8, (2001).
- Diekert, K., de Kroon, A. I., Kispal, G., Lill, R. Isolation and subfractionation of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. Methods Cell Biol. 65, 37-51 (2001).
