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Chemistry

折叠的DNA折纸一个生物反应机器人与表征

Published: December 3, 2015 doi: 10.3791/51272
Automatic Translation
1, 1, 1
1Faculty of Life Sciences and the Institute for Nanotechnology & Advanced Materials, Bar-Ilan University

Abstract

该DNA纳米机器人是一个中空的六角纳米器件，设计成响应于特定的刺激和本货物内部隔离开。既刺激和货物可以根据具体需要量身定做。在这里，我们描述了DNA纳米机器人制造协议，与使用DNA折纸技术。该步骤首先短单链DNA订书钉混合到原料混合物中，然后加入到长圆形，单链DNA的支架中的折叠缓冲液中的存在。一个标准的热循环仪被编程，以逐渐降低所述混合反应温度，方便钉到脚手架退火，这是纳米机器人的折叠背后的导向力。一旦60小时折叠反应完成后，过剩的钉被使用离心过滤器，接着经由可视琼脂糖凝胶电泳（AGE）丢弃。最后，将纳米机器人的制造成功是由透射电子显微镜检验（TEM）与使用双氧铀酸盐作为负染色。

Introduction

的用途核酸纳米技术是惊人。在Watson-Crick碱基配对的易处理性以及大规模合成的定制寡核苷酸2的易用性和相对低的成本已生成的应用3中的DNA纳米技术领域的爆炸和研究。结构DNA纳米，基于所述不动的塞曼结4,5-作为基本构建块利用的DNA，作为任意形状6-8的结构的自组装基本单位。

脚手架DNA折纸9技术的最新发展使得复杂的2D / 3D纳米结构10-12亚纳米级精度的建设，是建设新的功能对象日益增长的复杂性和惊人的多样性的有效途径。施工过程是基于一个长脚手架单链DNA，通常是从病毒染色体组衍生即，它可以通过几百短单链DNA寡核苷酸的杂交被折叠称为订书钉。通过这种技术获得的高结构分辨率是DNA双螺旋的自然尺寸的直接结果，而制造的再现性剪裁短单链订书钉序列以促进最大的氢键互补达到的结果。与使用慢温度退火的斜坡设计最低能量，热力学优选的纳米结构中达到高的产率和保真度。在计算机代码轻松实现连接处的设计规则允许的CAD工具，如caDNAno 13的发展，也极其简化设计包含数百个路口相连的大，结构复杂的任务。

先前我们描述的DNA纳米机器人的设计与caDNAno工具14,15的助剂。在这里，我们描述的制造和可视化，通过透射电子显微镜（TEM），所述纳米机器人，一个三维空心六角纳米器件，具有尺寸为35×35×50纳米的三件设计成经受到预定刺激和本具体货物中，响应一个主要的构象变化，例如蛋白质或核酸的寡核苷酸，隔离内部。虽然12装载站可在空心机箱内部，束缚货物的实际数量与不同尺寸的货物。货物分子范围从小型DNA分子的酶，抗体和5-10纳米金纳米颗粒。 Cargocan要么是均匀的或异质的，使得每个纳米机器人包含不同的分子的混合物。感测通过两个双螺旋锁定门设计实现成感测蛋白质，核酸或其它化学品，或者基于适体传感器16,17或DNA链置换18的技术。在适体选择的协议19-21最近的事态发展使纳米机器人的设计响应到分子和细胞类型的不断增加的范围。

早期的工作表明一个纳米机器人携带的特异性抗体，其在结合其抗原可以中继既抑制性或多产的信号，以特定的细胞类型的内部以混合细胞群15。这些纳米器件的一个令人兴奋的特性是他们与一个单一的群体推出不同的纳米机器人亚型的执行更为复杂的任务和逻辑控制能力。最近，我们证明了在执行作为正或负调节纳米机器人的特定亚型，控制含活性货物分子22的效应器群体。

这里介绍的协议描述门控与选择性结合的PDGF以促进纳米机器人15,22的开口适体传感器序列的纳米机器人的制造中，纯化和成像。中描述的制造过程类似于n个anorobot制造工艺最初由Douglas 等人 15的变化旨在减少整个过程持续时间所描绘的，同时增加了产率和纯化率。

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Protocol

1.准备的斯台普斯池混合

  1. 如表 1中所列的96孔板顺序冻干的DNA纳米机器人订书钉（ 见材料），并归一至10纳摩尔。将DNA纳米机器人的设计和结构的详细描述，请参见本- Ishay 等人 14和Douglas 等人15）。
  2. 重构各订书钉以及用DNA酶/无RNase超纯至100μM的浓度。主食归到10纳摩尔，重组与100微升超纯水。
  3. 池一起20微升各订书钉的使用多通道移液器和无菌55毫升解决方案盆地。
    注：由于纳米机器人形状是由254短 ​​链（包括核心，边缘，手柄和指南序列， 表1），每个U形钉池中的订书钉的浓度为394纳米。从订书钉池中取出钉，或添加一些不同的卷超微电极，可降低产率相当，或者以其他方式导致展开聚集体。

2.制备制作反应液

  1. 对于一个标准的反应混合物用40微升的M13mp18病毒基因组的环状单链DNA中，对应于4皮摩尔脚手架的DNA（100nM的原液， 见材料）。支架在制造混合物的最终浓度为20nM的，最终体积200微升。
    1. 调整根据具体需要脚手架DNA的量;然而，保持在反应混合物中的DNA支架的最终浓度在恒定的20纳米。
  2. 添加订书钉达到支架为1订书钉比率至10。对于20纳米支架DNA浓度，每254订书钉'最终浓度是200nM的。对于200微升最终反应体积加上102微升斯台普斯游泳池混合物（第1.2节）的。
    1. 添加特定的门序列，分别为thË折叠反应混合物在这个时候。这些寡单独订购，并要求HPLC纯化。确保门寡核苷酸存在于1:10支架到门序列比， 即 200nM的每种寡核苷酸的20nM的脚手架浓度。对于200微升折叠反应体积，在100微米的股票浓度增加0.4微升每个四门寡。
  3. 添加10倍TAE储备缓冲到达1×TAE（40mM的Tris-醋酸，1mM EDTA）中的最终浓度。对于200微升折叠反应体积，加入20微升的10X TAE。
  4. 添加1M的MgCl 2的，以10mM的终浓度。对于200微升折叠反应体积，加入2微升的1M 氯化镁 。
  5. 添加36微升DNA酶/ RNA酶游离超纯水，使达到200微升的最终体积。
  6. 涡和分装100微升样品到PCR小瓶。
    注：请有关最大反应体积中使用热循环仪规范。减少体积，以满足这些限制将不降低获得的收益率。反应体积上述规定将危及收益率的最大值。

制作反应3.温度退火斜坡

  1. 程序热循环仪如下：
    1. 坡道85℃至60℃，在5分钟/℃的速率。
    2. 斜坡60℃至4℃下以75分钟/℃的速率。
    3. 保持在4℃下去。
  2. 经过加工已经结束商店样品在-20℃。

4.去除多余史泰博

  1. 加入100微升的折叠反应混合物与0.5 ml的离心过滤器100 kDa的的MWCO。保存纳米机器人预纯化供以后分析的10微升样品。
  2. 离心机在9,600×g的10分钟。
  3. 加入400微升的折叠缓冲液（1×TAE，10毫米氯化镁2）。
  4. 重复步骤4.2和4.3的两倍多。
  5. 离心5分钟，在9,600×g的。
  6. 通过将过滤器倒置在一个干净的离心管中，自旋为1分钟，在9600×g下恢复该浓缩物。最终体积可以根据制造反应混合物的初始体积被放入过滤器的不同而不同。通常浓缩纳米机器人样品的25-60微升最终体积被获得。
  7. 测量通过分光光度计在样品中的DNA的浓度在260纳米。计算摩尔浓度的纳米机器人的样品时，应采用5.3微克/皮摩尔分子量。
    注：摩尔消光系数为双链DNA，50微克/ OD 260，足以满足大多数应用。 48微克/ OD 260考虑到聚胸腺嘧啶的ssDNA延伸在边缘处缝合钉。

折叠纳米机器人的5琼脂糖凝胶电泳分析

  1. 补充了10mM的MgCl 2 0.5×TBE（45毫摩尔Tris-硼酸盐，1mM EDTA中），2％琼脂糖凝胶的制备等 [21]。）：
    1. 在118.75双蒸2 O.毫升准备0.5X TBE缓冲液稀释6.25毫升10倍TBE储备缓冲
    2. 溶解2.5克琼脂糖在125毫升的0.5×TBE缓冲液。
    3. 沸腾在微波直到琼脂糖完全溶解。
    4. 加入1.25毫升的1M的MgCl 2的 10mM的最终浓度。
    5. 加7微升10毫克/毫升的溴化乙锭。
    6. 等待解决方案，以偏凉和琼脂糖凝胶固化前，填补了凝胶托盘。立即安装所需的梳子。
    7. 制备1升0.5×TBE缓冲液加入50毫升10×TBE储备缓冲和10ml的1M MgCl 2的940至双蒸2 O中的溶液
    8. 一旦凝胶是固体加载运行缓冲液的电泳设备，并把设备在冰浴中。
  2. 在纳米机器人预净化负载1微克总DNA（步骤3.2），和纯化后（步骤4.7），旁边一个支架DNA样品和1 kb的DNA标记，凝胶上。给出一个例子在图2中。样品的实际量取决于纯化后得到的浓度。每个样品装入在1装载缓冲液：6终体积比。
  3. 设置电源到80伏，并运行凝胶3小时。运行在装满冰和水的浴中的凝胶。纳米机器人将展开，如果琼脂糖凝胶电泳过程中加热出现一抹黑。电泳过程中添加额外的冰块，以保持设备的加热。
  4. （ 图2）紫外线表视图凝胶。

纳米机器人6.用铀甲酸盐负染色

  1. 2％的铀甲酸盐原液制备（改编自卡斯特罗等23）：
    1. 权衡的双氧铀酸盐粉末100毫克到15毫升管。
    2. 煮沸DNA酶/ RNA酶的超纯水进行3分钟脱含氧化合物。
    3. 添加5毫升脱氧热水（〜60℃）入15ml试管中含有双氧铀酸盐粉末（来自之前的步骤）。紧紧合上机盖，包装在铝箔和涡严格的10分钟（系管涡流）。溶液应出现浑浊带有黄色。
    4. 通过0.2微米注射器滤波器过滤解决方案。解决方法应该很清楚。
    5. 分装200微升的溶液倒入离心管中。
    6. 离心机中以最大速度为5分钟在台式离心机以池的样品在管的底部。
  2. 样品电网和消极染色加载：
    1. 除霜2％铀甲酸盐溶液（6.1节准备）200微升等分。加入10微升0.5M的NaOH溶液和涡旋严格3分钟。离心机中以最大速度用台式离心机5分钟。
    2. 同时，辉光放电网格使用室内空气在0.2毫巴和25 mA的30秒。
    3. 添加15微升为2nM纳米机器人样品的纯化后（secti上4.7）到电网的顶侧（用镊子保持），并让吸收1分钟。使用滤波器纸张放置在网格上的滤纸的顶部以排出多余的液体。请勿触摸网格表面。
    4. 加入10微升2％的铀甲酸盐（从步骤6.2.1）的网格上的顶面（用钳子举行）。
    5. 快速使用滤波器纸张放置在网格上的滤纸的顶部以排出多余的液体。请勿触摸网格表面。
    6. 重复步骤6.2.4和6.2.5。
    7. 加入10微升2％的铀甲酸盐（从步骤6.2.1）的网格上的顶面（用钳子举行）。让染色溶液吸收30秒。
    8. 使用滤波器纸张放置在网格上的滤纸的顶部以排出多余的液体。请勿触摸网格表面。
    9. 让格完全干燥至少30分钟，面朝上的滤纸，注射入的TEM之前。

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Representative Results

代表性的结果示于图2A。所有泳道含有1微克总DNA，通过分光光度计（OD 260）来测定。与环状单链DNA的支架（泳道2）相比，纳米机器人是受阻在凝胶由于它们的较高分子量，的订书钉杂交至骨架的DNA的结果（泳道3.红色箭头）。在泳道3的低分子量带代表其中不结合该支架的DNA（绿色箭头）过量订书钉。通过离心过滤纯化后大部分过量的订书钉被除去（泳道4-6）和纳米机器人准备下载缀合于把手互补链14,15,22货物分子。泳道4-6含有超高分子量带代表纳米机器人二聚体（​​蓝色箭头），纳米机器人的这些结合在一起的人口。降低制造过程中的支架的浓度（以5或10纳米）可以潜在热镀CE这些高分子量结构的相对量。泳道4-6显示纳米机器人后净化用轻微变化所描述的纯化方案，即制造的纳米机器人的初始体积加入到旋转过滤器（步骤4.1泳道4：50微升;泳道5：100微升;泳道6：100微升），和次缓冲液加入到过滤器的数目（步骤4.4泳道4：2倍;泳道5：2倍;泳道6：5次）。

的不同变化到协议（图2C）之间的屈服和纯化结果的比较显示，减少直到离心过滤装制造的机器人（步骤4.1）的初始体积对产量和纯化率影响不大。此外，增加缓冲液交换和离心旋转（步骤4.4）具有上的纳米机器人纯度边缘影响的数量，同时大大减少产率。因此，描述的方案中，对应于100微升初始体积和2缓冲添加剂（泳道5），被认为是最佳的。

产率估算基于分光光度计（OD 260）各样品后纯化的测量和计算相对于加载到每个离心过滤的初始量。纯化是基于重量百分比从样品中的完整DNA的纳米机器人的，对应于纳米机器人和过量订书钉其中纯化过程中没有洗掉。纯化估计从纳米机器人（红色和蓝色箭头在图2A中），以使得过量的钉（ 在图2B中绿色箭头）的相对强度来计算。相对纳米机器人/订书钉强度进行归一化的预纯化的样品（泳道3），其中，所述缝钉（绿色箭头）的总DNA重为〜4.5倍，该未纯化的纳米机器人（红色箭头），对应于初始的10：1脚手架订书钉摩尔比在制造协议。

的结构完整性最终验证通过使用2％的双氧铀酸盐作为负染透射电子显微镜来实现。照片示于图3。

图1
图1：在设计纳米机器人的原理封闭的纳米机器人（A）的侧视图。栅双螺旋，由适体序列和互补链产生，由绿色箭头指示。 （B）的一个封闭的纳米机器人示出货物蛋白内结合的前视图。 （ 三）生产的纳米机器人封闭截面示意图。把手钉是由一个红色箭头突出。绿色圆圈表示含有在一侧的铰链，并在相对侧上的栅极序列螺旋。 （四）蓝图一个纳米机器人的侧视图。手柄用红色箭头表示。门序列由绿色箭头指示。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2
图2：琼脂糖凝胶电泳结果 （ 一）第1道：1KB标记。 2泳道：圆形的M13mp18单链支架。泳道3：纳米机器人预净化。 4-6道：纳米机器人后纯化。泳道4：50微升初始体积; 2缓冲增加。泳道5：100微升初始体积; 2缓冲增加。泳道6：100微升初始体积; 5缓冲增加。多余的主食是由绿色箭头装配式纳米机器人是由一个红色箭头表示。蓝箭头表示纳米机器人二聚体。 （B）中的频带的琼脂糖的相对强度的三维图凝胶。 （C）产量和净化估计。

图3
图3：从多个胡编乱造/染色程序采取DNA纳米机器人的TEM照片。

“> TATACAGGAAATAAAGAAATTTTGCCCGAACGTTAAGACTTT 2“>核心 141 0“> TTTTTTTTTTTTTTTGTTAATTTCATCT
数 指定 序列
1 核心 AAAAACCAAACCCTCGTTGTGAATATGGTTTGGTC
2 核心 GGAAGAAGTGTAGCGGTCACGTTATAATCAGCAGACTGATAG
3 核心 TACGATATAGATAATCGAACAACA
4 核心 CTTTTGCTTAAGCAATAAAGCGAGTAGA
五核心 GTCTGAAATAACATCGGTACGGCCGCGCACGG
6 核心 GGAAGAGCCAAACAGCTTGCAGGGAACCTAA
7 核心 AAAATCACCGGAAGCAAACTCTGTAGCT
8 核心 CCTACATGAAGAACTAAAGGGCAGGGCGGAGCCCCGGGC
9 核心 CATGTAAAAAGGTAAAGTAATAAGAACG
10 核心 ATTAAATCAGGTCATTGCCTGTCTAGCTGATAAATTGTAATA
11 核心 ATAGTCGTCTTTTGCGGTAATGCC
12 核心 AGTCATGGTCATAGCTGAACTCACTGCCAGT
13 核心 AACTATTGACGGAAATTTGAGGGAATATAAA
14 核心 ATCGCGTCTGGAAGTTTCATTCCATATAGAAAGACCATC
15 核心 AAATATTGAACGGTAATCGTAGCCGGAGACAGTCATAAAAAT
16 核心 GTCTTTACAGGATTAGTATTCTAACGAGCATAGAACGC
17 核心 GCACCGCGACGACGCTAATGAACAGCTG
18 核心 AACTTCATTTTAGAATCGCAAATC
19 核心 CGTAGAGTCTTTGTTAAGGCCTTCGTTTTCCTACCGAG
20 核心 CCAATCAAAGGCTTATCCGGTTGCTATT
21 核心 AGAGGCGATATAATCCTGATTCATCATA
22 核心 CCGTAATCCCTGAATAATAACGGAATACTACG
23 核心 AAATGGTATACAGGGCAAGGAAATC
24 核心 TCCTCATCGTAACCAAGACCGACA
25 核心 CATTATCTGGCTTTAGGGAATTATGTTTGGATTAC
26 核心 ACCCGCCCAATCATTCCTCTGTCC
27 核心 CGACCAGTCACGCAGCCACCGCTGGCAAAGCGAAAGAAC
28 核心 CTAAAGGCGTACTATGGTTGCAACAGGAGAGA
29 核心 TTGGCAGGCAATACAGTGTTTCTGCGCGGGCG
三十核心
31 核心 AAGTATAGTATAAACAGTTAACTGAATTTACCGTTGAGCCAC
32 核心 ACATTCAGATAGCGTCCAATATTCAGAA
33 核心 AAACATCTTTACCCTCACCAGTAAAGTGCCCGCCC
34 核心 GAGATGACCCTAATGCCAGGCTATTTTT
35 核心 TCCTGAATTTTTTGTTTAACGATCAGAGCGGA
36 核心 GCCGAAAAATCTAAAGCCAATCAAGGAAATA
37 核心 AGCGTAGCGCGTTTTCACAAAATCTATGTTAGCAAACGAACGCAACAAA
38 核心 ACCAATCGATTAAATTGCGCCATTATTA D>
39 核心 ATCTTACTTATTTTCAGCGCCGACAGGATTCA
40 核心 CCCTAAAAGAACCCAGTCACA
41 核心 GGAAGGGCGAAAATCGGGTTTTTCGCGTTGCTCGT
42 核心 CAGACCGGAAGCCGCCATTTTGATGGGGTCAGTAC
43 核心 TAATATTGGAGCAAACAAGAGATCAATATGATATTGCCTTTA
44 核心 TTCCTTATAGCAAGCAAATCAAATTTTA
45 核心 ACTACGAGGAGATTTTTTCACGTTGAAACTTGCTTT
46 核心 AAACAGGCATGTCAATCATATAGATTCAAAAGGGTTATATTT
47 AACAGGCACCAGTTAAAGGCCGCTTTGTGAATTTCTTA
48 核心 TTCCTGAGTTATCTAAAATATTCAGTTGTTCAAATAGCAG
49 核心 AAAGAAACAAGAGAAGATCCGGCT
50 核心 TTGAGGGTTCTGGTCAGGCTGTATAAGC
51 核心 TTTAACCGTCAATAGTGAATTCAAAAGAAGATGATATCGCGC
52 核心 ACGAGCGCCCAATCCAAATAAAATTGAGCACC
53 核心 AATAAGTCGAAGCCCAATAATTATTTATTCTT
54 核心 ACGAAATATCATAGATTAAGAAACAATGGAACTGA
55 核心 TTTCATAGTTGTACCGTAACACTGGGGTTTT
56 核心 AGGAGCGAGCACTAACAACTAAAACCCTATCACCTAACAGTG
57 核心 CAAAGTATTAATTAGCGAGTTTCGCCACAGAACGA
58 核心 TGGGGAGCTATTTGACGACTAAATACCATCAGTTT
59 核心 ATAACGCAATAGTAAAATGTTTAAATCA
60 核心 ACGAATCAACCTTCATCTTATACCGAGG
61 核心 TAATGGTTTGAAATACGCCAA
62 核心 CGGAACAAGAGCCGTCAATAGGCACAGACAATATCCTCAATC
63 核心 ATTAAAGGTGAATTATCAAAGGGCACCACGG
64 GGCAACCCATAGCGTAAGCAGCGACCATTAA
65 核心 AGAAACGTAAGCAGCCACAAGGAAACGATCTT
66 核心 AGAGGTCTTTAGGGGGTCAAAAGGCAGT
67 核心 GGGGACTTTTTCATGAGGACCTGCGAGAATAGAAAGGAGGAT
68 核心 TTTTAGAACATCCAATAAATCCAATAAC
69 核心 AAATGTGGTAGATGGCCCGCTTGGGCGC
70 核心 ACGGATCGTCACCCTCACGATCTAGAATTTT
71 核心 CGCCATAAGACGACGACAATAGCTGTCT
72 核心 GCGTATTAGTCTTTAATCGTAAGAATTTAC一个
73 核心 AGAGAACGTGAATCAAATGCGTATTTCCAGTCCCC
74 核心 AACGAAAAAGCGCGAAAAAAAGGCTCCAAAAGG
75 核心 TAATTTAGAACGCGAGGCGTTAAGCCTT
76 核心 ACCAGGCGTGCATCATTAATTTTTTCAC
77 核心 CAGCCTGACGACAGATGTCGCCTGAAAT
78 核心 ATTAGTCAGATTGCAAAGTAAGAGTTAAGAAGAGT
79 核心 CTCGAATGCTCACTGGCGCAT
80 核心 GGGCAGTCACGACGTTGAATAATTAACAACC
81 核心
82 核心 TCAACCCTCAGCGCCGAATATATTAAGAATA
83 核心 ATTATACGTGATAATACACATTATCATATCAGAGA
84 核心 GCAAATCTGCAACAGGAAAAATTGC
85 核心 ATAATTACTAGAAATTCTTAC
86 核心 TATCACCGTGCCTTGAGTAACGCGTCATACATGGCCCCTCAG
87 核心 AAGTAGGGTTAACGCGCTGCCAGCTGCA
88 核心 CCAGTAGTTAAGCCCTTTTTAAGAAAAGCAAA
89 核心 TGGCGAAGTTGGGACTTTCCG
90 CAGTGAGTGATGGTGGTTCCGAAAACCGTCTATCACGATTTA
91 核心 AAATCAAAGAGAATAACATAACTGAACACAGT
92 核心 CTGTATGACAACTAGTGTCGA
93 核心 ATCATAAATAGCGAGAGGCTTAGCAAAGCGGATTGTTCAAAT
94 核心 TTGAGTAATTTGAGGATTTAGCTGAAAGGCGCGAAAGATAAA
95 核心 ATAAGAATAAACACCGCTCAA
96 核心 CGTTGTAATTCACCTTCTGACAAGTATTTTAA
97 核心 AACCGCCTCATAATTCGGCATAGCAGCA
98 核心 AAATAGGTCACGTTGGTAGCGAGTCGCGTCTAATTCGC
99 核心 CAGTATAGCCTGTTTATCAACCCCATCC
100 核心 TTGCACCTGAAAATAGCAGCCAGAGGGTCATCGATTTTCGGT
101 核心 CGTCGGAAATGGGACCTGTCGGGGGAGA
102 核心 AAGAAACTAGAAGATTGCGCAACTAGGG
103 核心 CCAGAACCTGGCTCATTATACAATTACG
104 核心 ACGGGTAATAAATTAAGGAATTGCGAATAGTA
105 核心 CCACGCTGGCCGATTCAAACTATCGGCCCGCT
106 核心 GCCTTCACCGAAAGCCTCCGCTCACGCCAGC
107 CAGCATTAAAGACAACCGTCAAAAATCA
108 核心 ACATCGGAAATTATTTGCACGTAAAAGT
109 核心 CAACGGTCGCTGAGGCTTGATACCTATCGGTTTATCAGATCT
110 核心 AAATCGTACAGTACATAAATCAGATGAA
111 核心 TTAACACACAGGAACACTTGCCTGAGTATTTG
112 核心 AGGCATAAGAAGTTTTGCCAGACCCTGA
113 核心 GACGACATTCACCAGAGATTAAAGCCTATTAACCA
114 核心 AGCTGCTCGTTAATAAAACGAGAATACC
115 核心 CTTAGAGTACCTTTTAAACAGCTGCGGAGATTTAGACTA
116 核心 CACCCTCTAATTAGCGTTTGCTACATAC
117 核心 GAACCGAAAATTGGGCTTGAGTACCTTATGCGATTCAACACT
118 核心 GCAAGGCAGATAACATAGCCGAACAAAGTGGCAACGGGA
119 核心 ATGAAACAATTGAGAAGGAAACCGAGGATAGA
120 核心 GGATGTGAAATTGTTATGGGGTGCACAGTAT
121 核心 GGCTTGCGACGTTGGGAAGAACAGATAC
122 核心 TAAATGCCTACTAATAGTAGTTTTCATT
123 核心 TGCCGTCTGCCTATTTCGGAACCAGAATGGAAAGCCCACCAGAAC
124 核心 TGACCATAGCAAAAGGGAGAACAAC
125 核心 CGAGCCAGACGTTAATAATTTGTATCA
126 核心 GCTCAGTTTCTGAAACATGAAACAAATAAATCCTCCCGCCGC
127 核心 AGACGCTACATCAAGAAAACACTTTGAA
128 核心 AGTACTGACCAATCCGCGAAGTTTAAGACAG
129 核心 GATTCCTGTTACGGGCAGTGAGCTTTTCCTGTGTGCTG
130 核心 GGTATTAAGGAATCATTACCGAACGCTA
131 核心 GTTCATCAAATAAAACGCGACTCTAGAGGATCGGG
132 核心
133 核心 ACAGAGGCCTGAGATTCTTTGATTAGTAATGG
134 核心 AACGAGATCAGGATTAGAGAGCTTAATT
135 核心 TACCAAGTTATACTTCTGAATCACCAGA
136 核心 CAGTAGGTGTTCAGCTAATGCGTAGAAA
137 核心 AGGATGACCATAGACTGACTAATGAAATCTACATTCAGCAGGCGCGTAC
138 核心 TTTCAACCAAGGCAAAGAATTTAGATAC
139 核心 TTGAAATTAAGATAGCTTAACTAT
140 核心 CTATTATCGAGCTTCAAAGCGTATGCAA
核心 CAGGGTGCAAAATCCCTTATAGACTCCAACGTCAAAAGCCGG
142 核心 GAGCTTGTTAATGCGCCGCTAATTTTAGCGCCTGCTGCTGAA
143 核心 CGAACGTTAACCACCACACCCCCAGAATTGAG
144 核心 GTGTGATAAATAAGTGAGAAT
145 核心 GCTATATAGCATTAACCCTCAGAGA
146 核心 AGGAGAGCCGGCAGTCTTGCCCCCGAGAGGGAGGG
147 核心 CGGCCTCCAGCCAGAGGGCGAGCCCCAA
148 核心 CCAAAACAAAATAGGCTGGCTGACGTAACAA
149 核心
150 核心 ATAAAGGTTACCAGCGCTAATTCAAAAACAGC
151 核心 ATTGCCCCCAGCAGGCGAAAAGGCCCACTACGTGACGGAACC
152 核心 TTTTAAAACATAACAGTAATGGAACGCTATTAGAACGC
153 核心 AATTGGGTAACGCCAGGCTGTAGCCAGCTAGTAAACGT
154 边缘 TTACCCAGAACAACATTATTACAGGTTTTTTTTTTTTTTTT
155 边缘 TTTTTTTTTTTTTTTTAATAAGAGAATA
156 边缘 TTTTTTTTTTTTTTTTCCAGTTTGGGAGCGGGCTTTTTTTTTTTTTTT
157 边缘
158 边缘 TTTTTTTTTTTTTTTGATTAAGACTCCTTATCCAAAAGGAAT
159 边缘 TTTTTTTTTTTTTTTTCTTCGCTATTACAATT
160 边缘 TTTTTTTTTTTTTTTCTTGCGGGAGAAGCGCATTTTTTTTTTTTTTTT
161 边缘 TTTTTTTTTTTTTTGGGAATTAGAGAAACAATGAATTTTTTTTTTTTTTT
162 边缘 TCAGACTGACAGAATCAAGTTTGTTTTTTTTTTTTTTT
163 边缘 TTTTTTTTTTTTTTTGGTCGAGGTGCCGTAAAGCAGCACGT
164 边缘 TTTTTTTTTTTTTTTTTTAATCATTTACCAGACTTTTTTTTTTTTTTT
165 边缘 TTTTTTTTTTTTTCATTCTGGCCAAATTCGACAACTCTTTTTTTTTTTTT
166 边缘 TTTTTTTTTTTTTTTACCGGATATTCA
167 边缘 TTTTTTTTTTTTTTTTAGACGGGAAACTGGCATTTTTTTTTTTTTTTT
168 边缘 TTTTTTTTTTTTTTTCAGCAAGCGGTCCACGCTGCCCAAAT
169 边缘 CTGAGAGAGTTGTTTTTTTTTTTTTTT
170 边缘 CAATGACAACAACCATTTTTTTTTTTTTTTT
171 边缘 TTTTTTTTTTTTTTTTGAGAGATCTACAAGGAGAGG
172 边缘 TCACCAGTACAAACTATTTTTTTTTTTTTTT
173 边缘
174 边缘 TAAAGTTACCGCACTCATCGAGAACTTTTTTTTTTTTTTT
175 边缘 TTTTTTTTTTTTTTTCACCCTCAGAACCGCC
176 边缘 TTTTTTTTTTTTTAGGTTTAACGTCAATATATGTGAGTTTTTTTTTTTTT
177 边缘 CCACACAACATACGTTTTTTTTTTTTT
178 边缘 TTTTTTTTTTTTTTTGCTAGGGCGAGTAAAAGATTTTTTTTTTTTTTT
179 边缘 TTTTTTTTTTTTTTTAGTTGATTCCCAATTCTGCGAACCTCA
180 边缘 TTATTTAGAGCCTAATTTGCCAGTTTTTTTTTTTTTTTTT
181 边缘 TTTTTTTTTTTTTTTACGGCGGAT
182 边缘 TTTTTTTTTTTTTTTATATGCGTTAAGTCCTGATTTTTTTTTTTTTTT
183 边缘 TTTTTTTTTTTTTTTACGATTGGCCTTGATA
184 边缘 TTTTTTTTTTTTTTTCAACGCCTGTAGCATT
185 边缘 TTTTTTTTTTTTTTTGGCTTTGAGCCGGAACGATTTTTTTTTTTTTTT
186 边缘 TTTTTTTTTTTTTTTAAGCAAGCCGTTT
187 边缘 TTTTTTTTTTTTTATGTGTAGGTAAGTACCCCGGTTGTTTTTTTTTTTTT
188 边缘 ATCGTCATAAATATTCATTTTTTTTTTTTTTTTT
189 边缘
190 边缘 TTTTTTTTTTTTTGTATTAAATCCTGCGTAGATTTTCTTTTTTTTTTTTT
191 边缘 GCCATATAAGAGCAAGCCAGCCCGACTTGAGCCATGGTT
192 边缘 GTAGCTAGTACCAAAAACATTCATAAAGCTAAATCGGTTTTTTTTTTTTT
193 边缘 ATAACGTGCTTTTTTTTTTTTTTTTTT
194 边缘 TTTTTTTTTTTTTTTAAAATACCGAACGAACCACCAGTGAGAATTAAC
195 边缘 TTTTTTTTTTTTTTTACAAAATAAACA
196 边缘 TTTTTTTTTTTTTTTACAAGAAAAACCTCCCGATTTTTTTTTTTTTTT
197 边缘
198 边缘 TTTTTTTTTTTTTCAATTACCTGAGTATCAAAATCATTTTTTTTTTTTTT
199 边缘 GGTACGGCCAGTGCCAAGCTTTTTTTTTTTTTTT
200 边缘 TTTTTTTTTTTTTTGAATAACCTTGAAATATATTTTATTTTTTTTTTTTT
201 边缘 CACTAAAACACTTTTTTTTTTTTTTTT
202 边缘 TTTTTTTTTTTTTTTTAACCAATATGGGAACAATTTTTTTTTTTTTTT
203 边缘 TACGTCACAATCAATAGAATTTTTTTTTTTTTTT
204 边缘 TTTTTTTTTTTTTTTAGAAAGATTCATCAGTTGA
205 边缘 TTTTTTTTTTTTTGTGGCATCAATTAATGCCTGAGTATTTTTTTTTTTTT
206 边缘 TTTTTTTTTTTTTTTTTGCATGCCTGCATTAATTTTTTTTTTTTTTTT
207 边缘 CCAGCGAAAGAGTAATCTTGACAAGATTTTTTTTTTTTTTT
208 边缘 TTTTTTTTTTTTTTTGAATCCCCCTCAAATGCTT
209 边缘 AGAGGCTGAGACTCCTTTTTTTTTTTTTTTT
210 边缘 ACAAACACAGAGATACATCGCCATTATTTTTTTTTTTTTTT
211 边缘 TTTTTTTTTTTTTTTCAAGAGAAGGATTAGG
212 边缘 TTTTTTTTTTTTTGAATTGAGGAAGTTATCAGATGATTTTTTTTTTTTTT
213 CAGAACAATATTTTTTTTTTTTTTTTT
214 边缘 TTTTTTTTTTTTTAGCCGGAAGCATAAAGTGTCCTGGCC
215 边缘 TGACCGTTTCTCCGGGAACGCAAATCAGCTCATTTTTTTTTTTTTTTTTT
216 边缘 TTTTTTTTTTTTTTTGGTAATAAGTTTTAAC
217 边缘 TTTTTTTTTTTTTTGTCTGTCCATAATAAAAGGGATTTTTTTTTTTTTTT
218 边缘 TTTTTTTTTTTTTTTCCTCGTTAGAATCAGAGCGTAATATC
219 边缘 AATTGCTCCTTTTGATAAGTTTTTTTTTTTTTTT
220 边缘 CATCGGACAGCCCTGCTAAACAACTTTCAACAGTTTTTTTTTTTTTTT
221 TTTTTTTTTTTTTTTAACCGCCTCCCTCAGACCAGAGC
222 边缘 TCTGACAGAGGCATTTTCGAGCCAGTTTTTTTTTTTTTTT
223 边缘 TTTTTTTTTTTTTTTTTTCAGCGGAGTTCCATGTCATAAGG
224 边缘 TTTTTTTTTTTTTTTCGCCCACGCATAACCG
225 边缘 AATTACTTAGGACTAAATAGCAACGGCTACAGATTTTTTTTTTTTTTT
226 边缘 CAAGTTTTTTGGTTTTTTTTTTTTTTT
227 边缘 TTTTTTTTTTTTTTTCCTTTAGCGCACCACCGGTTTTTTTTTTTTTTT
228 边缘 TTTTTTTTTTTTTTTGAATCGGCCGAGTGTTGTTTTTTTTTTTTTTTT
229 边缘 TTTTTTTTTTTTTCATCTTTGACCC
230 边缘 TTTTTTTTTTTTTATAATCAGAAAATCGGTGCGGGCCTTTTTTTTTTTTT
231 边缘 GATACAGGAGTGTACTTTTTTTTTTTTTTTT
232 边缘 TTTTTTTTTTTTTTTGGCGCAGACAATTTCAACTTTTTTTTTTTTTTT
233 边缘 GGAGGTTTAGTACCGCTTTTTTTTTTTTTTT
234 边缘 TTTTTTTTTTTTTACCGCCAGCCATAACAGTTGAAAGTTTTTTTTTTTTT
235 边缘 TTTTTTTTTTTTTTTATAGCAATAGCT
236 手柄 AATAAGTTTTGCAAGCCCAATAGGGGATAAGTTGTGCTACTCCAGTTC
237 手柄 ACATAGCTTACATTTAACAATAATAACGTTGTGCTACTCCAGTTC
238 手柄 CCTTTTTGAATGGCGTCAGTATTGTGCTACTCCAGTTC
239 手柄 CGTAACCAATTCATCAACATTTTGTGCTACTCCAGTTC
240 手柄 CACCAACCGATATTCATTACCATTATTGTGCTACTCCAGTTC
241 手柄 CCACCCTCATTTTCTTGATATTTGTGCTACTCCAGTTC
242 手柄 AACTTTGAAAGAGGAGAAACATTGTGCTACTCCAGTTC
243 手柄 CAAGGCGCGCCATTGCCGGAATTGTGCTACTCCAGTTC
244 手柄 CATAGCCCCCTTAAGTCACCATTGTGCTACTCCAGTTC
245 手柄 TTTCCCTGAATTACCTTTTTTACCTTTTTTGTGCTACTCCAGTTC
246 手柄 AACGGTGTACAGACTGAATAATTGTGCTACTCCAGTTC
247 手柄 GATTCGCGGGTTAGAACCTACCATTTTGTTGTGCTACTCCAGTTC
248 指南 AGAGTAGGATTTCGCCAACATGTTTTAAAAACC
249 指南 ACGGTGACCTGTTTAGCTGAATATAATGCCAAC
250 指南 CGTAGCAATTTAGTTCTAAAGTACGGTGTTTTA
251 指南 GCTTAATGCGTTAAATGTAAATGCTGATCTTGAAATGAGCGTT
252 指南 AAGCCAACGGAATCTAGGTTGGGTTATATAGATTAAGCAACTG
253 指南 TTTAACAACCGACCCAATCGCAAGACAAAATTAATCTCACTGC
254 指南 TTTAGGCCTAAATTGAGAAAACTTTTTCCTTCTGTTCCTAGAT
255 指南拆除 GGTTTTTAAAACATGTTGGCGAAATCCTACTCT
256 指南拆除 GTTGGCATTATATTCAGCTAAACAGGTCACCGT
257 指南拆除 TAAAACACCGTACTTTAGAACTAAATTGCTACG
258 指南拆除 AACGCTCATTTCAAGATCAGCATTTACATTTAACGCATTAAGC
259 指南拆除 CAGTTGCTTAATCTATATAACCCAACCTAGATTCCGTTGGCTT
260 桂德去除 GCAGTGAGATTAATTTTGTCTTGCGATTGGGTCGGTTGTTAAA
261 指南拆除 ATCTAGGAACAGAAGGAAAAAGTTTTCTCAATTTAGGCCTAAA
262 盖茨 Gate29 TGGGGCGCGAGCTGAAAAGTACTCAGGGCACTGCAAGCAATTGTGGTCCCAATGGGCTGAGTA
263 盖茨 Gate30 TACTCAGCCCATTGGGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAGGTCTGAGAGACTACCTT
264 盖茨 GATE0 TGATGAGCGTGGATGATACTCAGCCCATTGGGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAGGTCATTTTTGCGGATGG
265 盖茨 Gate61 ATACAAAAAGCCTGTTTAGTATCTACTCAGGGCACTGCAAGCAATTGTGGTCCCAATGGGCTGAGTA

表1：订书钉序列列表用于构建纳米机器人。斯台普斯1-153被指定为核心，弥补了大部分的结构。订书钉154-235被指定边并位于在每个结构的61螺旋的端部。边缘主食含有聚胸腺嘧啶尾部设计，可避免纳米机器人的聚集。斯台普斯236-247指定手柄和弥补货物停靠站点。处理订书钉有一个独特的序列区域，其连接到该结构的其特定的位置，并且其被用作停泊位点的货物分子的共有序列区域。订书钉248-254被指定指南和在退火过程连接该设备的两半。制造之后的导片通过加入指南去除订书钉255-261（步骤6）除去，留下锁定的纳米机器人的两个传感器器件。传感器序列指定盖茨。每两个传感器是由一个PDGF适体和互补链。对于更详细的expla国家看到奔Ishay 等人 14和Douglas 等人的15。订书钉被三个96孔平板（深圆底）商购订购。各订书钉量被归一化至10纳摩尔。除了门序列，其需要HPLC纯化，订书钉不需要特殊的纯化过程。

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Discussion

我们介绍的加工，净化，和可视化的DNA纳米机器人的。继装置的六边形底盘的制造中，所述纳米机器人的功能进行编程时将简单介绍的特定货物和传感链到机器人容易地找到它们的指定的位置，由于氢键互补可用单链对接位点14 ，15,22。

描述的制造协议使用缓慢退火坡道，其通常使用在我们的实验室折叠广泛折纸形状。如果生产时间成为关键因素的其它协议，如由Sobczak 等描述的快速折叠协议24可以使用。该协议被报告以实现高产率折纸折叠，然而它需要校准每个折纸形状。

自旋过滤被用来净化从过量订书钉的机器人。当装载在S与样品或缓冲销柱，应注意不要损伤膜枪头。该膜可以潜在破裂从而显着降低了产量。明智的做法是不丢弃流过，直到纳米机器人是由AGE可视化。

对于某些应用程序更高的净化率需要;这可以通过使用原始旋转柱重复过滤来实现。对于甚至更高的纯度，一个新的旋转柱可以使用，然而，这将对收率率产生重大的负面影响。其它方法用于纯化的DNA折纸结构进行了测试，如从电泳和过量订书钉透析随后琼脂糖凝胶切除。这些方法导致了无论是产量很低或与描述的协议相比，差的净化率。其他方法，如基于PEG的纯化25和速率纬向超离心26未测试。这些方法被报告给ACHI前夜高净化率，但他们要么导致不良的收益率（利率纬向超速离心），或需要沉淀（PEG为基础的），这可能会损害中空的纳米机器人的形状。

纳米机器人被制造与指南订书钉其锁定在关闭位置的形状，以增加制造yeilds 15。它通过添加指南去除订书钉为纳米机器人响应于所设计的刺激有效开放（PDGF在所描述的协议），以除去这些订书钉是重要的。导向钉都设计有一个立足点单链区域的其中通过链置换的18。这些订书钉应在10被加入一个过程释放出引导订书钉导向去除订书钉对接：1的摩尔比在过量的纯化的端订书钉“阶段（步骤4.7），并温育2小时，在室温下在端超过端振荡器。

可视化用TEM进行了说明，其中包吴铀甲酸盐2％的负染色。用醋酸双氧铀相比，铀，甲酸产生更细的颗粒结构，该结构能更好地解决了DNA折纸设计。应注意作为双氧铀酸盐将凝固如果等分试样冷冻长时间。最好是使用染色新鲜制备的2％的双氧铀酸盐溶液。更好的分辨率是可以实现与使用低温TEM 27。

在DNA纳米机器人的基本体系结构设计和制造协议的最终统一和简单。然而，大范围的灵活性的特定货物的混合物和感测链的形式提供。此外，在一个单一的人口许多亚型可以引入和它们的相对化学计量编程和优化的，以适应特定的需要。在每个限速步骤的具体动力学的更大的微调是可以实现的增加/减少的双链杂交或长度引进的不匹配，在具体的关键岗位。这种高度的轻松构建灵活度使得能够在一个生物相关环境进行多种多样复杂的任务的纳米器件的工程。

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Disclosures

作者什么都没有透露。

Acknowledgments

作者要感谢S.道格拉斯极有价值的讨论和建议，以及巴切莱特实验室的所有成员有益的讨论和工作。这项工作是由生命科学学院和纳米技术及先进材料研究所在巴伊兰大学的资助。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DNase/RNase free distilled water Gibco 10977
M13mp18 ssDNA scaffold NEB N4040S
10x TAE Gibco 15558-042
1 M MgCl2 Ambion AM9530G
Amicon Ultra 0.5 ml centrifugal filter 100K MWCO Amicon UFC510024
Agarose Promega V3125
TBE buffer Promega V4251
Ethidium bromide 10 mg/ml solution Sigma Aldrich E1510
1 kb DNA marker NEB N3232S
Loading Dye NEB B7021S
uranyl formate polysciences 24762
carbon-coated TEM grids  Science services EFCF400-Cu-50
Thermal Cycler c1000 Touch Bio-Rad
Glow Discharge K100X Emitech
UV table Gel Doc EZ Imager Bio-Rad
NanoDrop 2000c Thermo Scientific
TEM FEI-G12 Tecnai

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References

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化学，第106，脱氧核糖核酸折纸，纳米机器人，自组装，适体，合成生物学，可编程纳米器件，DNA纳米技术
折叠的DNA折纸一个生物反应机器人与表征
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Amir, Y., Abu-Horowitz, A., Bachelet, I. Folding and Characterization of a Bio-responsive Robot from DNA Origami. J. Vis. Exp. (106), e51272, doi:10.3791/51272 (2015).

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